用於緩解或治療皮膚缺損的自體皮膚細胞治療劑的製備方法
2023-04-28 10:53:41 1
專利名稱：用於緩解或治療皮膚缺損的自體皮膚細胞治療劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於緩解或治療皮膚缺損的自體皮膚細胞治療劑的製備方法，更具體地涉及一種不同於現有細胞治療劑製備方法的因能夠排除酶或培養步驟而在短時間內製備細胞治療劑的方法。
背景技術：
在皮膚組織出現燒傷、創傷、色素脫失等缺損的情況下，如未進行適當治療或者採取錯誤的應急措施，將會給皮膚留下疤痕或導致治療時間延長，同時還可能伴隨其他皮膚疾病。通常，在燒傷或創傷的情況下，以往採用以浸溼有主要成分為凡士林的軟膏的繃帶包裹皮膚的方式進行治療，為了防止二次感染，額外服用青黴素、磺醯胺劑等抗生劑。並且，為了減輕痛症，另行服用鎮痛劑。但是，傷口治療所需時間短則2 3周，長則需要3個月左右的長時間的治療，由此需要的費用也非常高昂。並且，在燒傷的情況下，多採用一種利用自體細胞製成的細胞治療劑來進行治療的方法。但根據以往的利用自體細胞製成的細胞治療劑的製備方法，採用進行酶處理來提取特定細胞，將上述提取的細胞培養數日而生產的方法。因此，以往的細胞治療劑存在細胞培養所需時間長的問題，不適用於燒傷等皮膚缺損程度嚴重的情況和需要緊急治療的患者。`
發明內容
技術問題因此，本發明的目的在於提供一種利用不通過酶處理進行分離且不進行培養的自體皮膚細胞來製備用於緩解或治療皮膚缺損的細胞治療劑的方法和根據上述方法製備的細胞治療劑以及製備細胞治療劑的裝置。技術方案上述目的可通過如下的本發明的用於緩解或治療皮膚缺損的細胞治療劑的製備方法達成，該方法的特徵在於，包括從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟；將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟；以及從上述粉碎而成的組織碎片中獲取包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞在內的皮膚細胞群的步驟。其中，在上述將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟中，可以使用組織粉碎器，將上述正常皮膚組織大小的每Icm2粉碎10 60秒的時間，從而將上述正常皮膚組織粉碎成細胞單位。其中，在上述將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟中，可以粉碎上述正常皮膚組織使得上述粉碎的細胞濃度為I 40X IO7個/cm2。
其中，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，上述獲取的角質形成細胞可以是總獲取細胞的60 90%。其中，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，上述獲取的黑色素細胞可以是總獲取細胞的I 5%。其中，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，上述獲取的纖維細胞可以為總獲取細胞的10 40%。其中，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，無需對上述獲取的包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞在內的皮膚細胞群進行培養。其中，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，用於獲取包含上述角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞在內的皮膚細胞群時，無需進行任何酶處理。其中，上述皮膚缺損可以是從由燒傷、創傷、皮膚疤痕、色素脫失的皮膚傷口構成的群中選擇的某一種。並且，本發明的目的可通過本發明的細胞治療劑達成，該細胞治療劑通過上述記載的細胞治療劑的製備方法製備而成。有益效果如上所述，本發明的利用自體皮膚細胞的用於緩解或治療皮膚缺損的細胞治療劑的製備方法，針對自體皮 膚細胞，無需採用以酶處理來進行細胞分離的方式，並且不對分離出的細胞進行培養，也能夠製備細胞治療劑並方便、快速地用於患部的效果。並且，根據本發明，即使從主體獲取的正常皮膚組織的量少，也可製備用於較大面積患部的細胞治療劑。並且，還具有提供可製備上述細胞治療劑的製備裝置的效果。
圖1為表示本發明的一實施例的細胞治療劑的製備方法的流程圖。圖2為表示血球計數器的示例的圖。圖3a至3b為表示根據本發明的一實施例製備的細胞治療劑的細胞大小確認結果的圖。圖4為表示根據本發明的一實施例製備的細胞治療劑對燒傷部位的臨床效果的圖。圖5為表示根據本發明的一實施例製備的細胞治療劑對燒傷部位的再一臨床效果的圖。圖6a為表示根據以往的酶處理方式分離出的細胞的電子顯微鏡確認結果的圖。圖6b為表示根據本發明的一實施例分離出的細胞的電子顯微鏡確認結果的圖。圖7為表示根據本發明的一實施例製備的細胞治療劑對燒傷部位的動物實驗效果的圖。圖8a為表示上述圖7的燒傷部位的H&E染色結果的圖。圖8b為表示上述圖7的燒傷部位的MT染色結果的圖。圖9為表示根據本發明的一實施例製備的細胞治療劑對創傷部位的動物實驗效果的圖。圖1Oa為表示對圖9的創傷部位適用對照組後的MT染色結果的圖。圖1Ob為表示對圖9的創傷部位適用根據本發明的一實施例製備的細胞治療劑後的MT染色結果的圖。
具體實施例方式以下，將參照附圖對本發明的實施例進行詳細說明，使得本發明所屬技術領域的普通技術人員能夠容易實施。本發明可以實現各種不同的實施方式，不限於在此說明的實施例。圖1為本發明的細胞治療劑的製備方法的流程圖。如圖1所示，本發明的細胞治療劑的製備方法包括從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟(步驟Sll);將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟(步驟S12);以及從上述粉碎而成的組織碎片中獲取包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中的至少一種細胞的皮膚細胞群的步驟(步驟S13)。本發明的細胞治療劑的製備方法用於製備為了緩解或治療哺乳動物的皮膚缺損的細胞治療劑。優選地，用於製備用於緩解或治療人類皮膚缺損的細胞治療劑。在上述正常皮膚組織的獲取步驟中，可利用取皮機(Dermatome)從主體獲取正常皮膚組織。上述主體可包含哺乳動物或人類。優選地，從某部分皮膚具有皮膚缺損的人體中獲取正常皮膚組織。上述正常皮膚組織可按照(I至5mm) X (I至5mm)的大小切割來獲取，具有上述大小的組織的個數可通過考慮患部的大小而獲取，作為一例，可獲取具有上述大小的碎片I至30個，更優選地獲取5至25個碎片，進 而優選地獲取10至25個碎片。上述獲取的正常皮膚組織可利用生理鹽水或滅菌水清洗後加以利用。並且，可利用通常的方法，對上述清洗的組織進行滅菌後加以利用。上述正常皮膚組織的粉碎步驟是將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟。在上述將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟中，通常利用可粉碎組織的一般組織粉碎器。在上述組織粉碎時考慮到上述需要粉碎的組織的量，可少量添加生理鹽水或滅菌水進行粉碎，優選地可添加I IOcc的生理鹽水或滅菌水進行粉碎，更優選地可添加I 5cc的生理鹽水或滅菌水進行粉碎。利用上述組織粉碎器粉碎組織時，粉碎時間可考慮上述組織的量而進行設定，優選地，上述組織大小的每Icm2可粉碎I至60秒的時間，更優選地，每Icm2可粉碎10至60秒的速度，以將上述組織粉碎成細胞單位。粉碎上述組織使得上述粉碎的細胞濃度為(I至40) X IO7個/cm2。上述細胞的濃度可根據上述主體的年齡或組織的狀態而不同。上述皮膚細胞群的獲取步驟表示，完成上述粉碎後，從組織碎片中獲取包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞的皮膚細胞群。上述角質形成細胞(keratinocyte)為，生產角質並通過形成物理屏障，以起到從外部進入的有害因子中保護個體的作用的表皮細胞，是一種生成並分泌可調節免疫反應的各種生物反應調節物質來調節免疫反應和炎症反應的重要結構要素。上述黑色素細胞(melanocyte)是生成作為存在於動物組織及皮膚中的褐色或黑色色素的黑色素的細胞，持續地將在細胞內生成的黑色素顆粒供應至表皮細胞。黑色素量多時，皮膚顏色呈黃褐色甚至黑褐色；量越少，顏色就越淺。上述纖維細胞(fibroblast)還稱為成纖維細胞，它是構成纖維性結締組織的重要成分的細胞，通過組織切片進行觀察時呈扁平而長條的外形，這些細胞通常具有不規則的突起。因此，上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟為，從粉碎上述組織而成的組織碎片中獲取包括角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞在內的皮膚細胞群。 此時，上述獲取的包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞在內的皮膚細胞群不僅包含存活的細胞，同時還可能包含在粉碎步驟中遭到破壞的細胞。在這裡，上述獲取的角質形成細胞可佔總獲取細胞的60 90%，上述獲取的黑色素細胞可佔總獲取細胞的I 5 %，上述獲取的纖維細胞可佔總獲取細胞的10 40%。因此，如上所述，本申請提供一種不經任何酶處理，也可以從正常皮膚組織中分離出角質形成細胞、黑色素細胞或纖維細胞的方法。並且，提供一種無需對上述獲取的包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞在內的皮膚細胞群進行培養，即可用於患部的細胞治療劑。由此，通過本申請的製備方法製備的細胞治療劑，不僅排除了依據酶處理的細胞分離過程，還排除了培養所分離的細胞的過程，可在非常短的時間內進行製備，完成製備後可立即用於患部，因此非常有效。在這裡，上述皮膚缺損可以是從由燒傷、創傷、皮膚疤痕、色素脫失的皮膚傷口構成的群中選擇的某一種。以下，將通過實施例和實驗例對本發明進行更詳細的說明。實驗例1.根據本發明的一實施例製備的細胞治療劑中包含的細胞試驗及患部適用例針對47歲女性及36歲女性，利用取皮機，以4X5mm的大小分別切取20個正常皮膚組織，使用生理鹽水清洗後進行滅菌。往上述滅菌後的組織添加2cc的滅菌水，並使用組織粉碎器粉碎約30秒鐘。完成上述粉碎後，利用細胞過濾網(cell strainer),從組織碎片中獲取包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞在內的皮膚細胞群，從而製備出利用47歲女性的自體皮膚細胞的細胞治療劑和利用36歲女性的自體皮膚細胞的細胞治療劑。1-1.細胞的濃度測定利用血球計數器(Hemocytometer),分別測定上述製備的利用47歲女性的自體皮膚細胞的細胞治療劑和利用36歲女性的自體皮膚細胞的細胞治療劑的細胞濃度。圖3表示血球計數器的一實施例。如圖2所示，血球計數器是在其表面劃著橫豎斜線的載物玻璃，具有由規則四邊形分劃的兩個室(Chamber)，可在顯微鏡下測定在各個室的由規定體積構成的四邊形區劃內存在的細胞的數量，來測定在所有試料內存在的細胞濃度。在完成上述製備的100 U I的細胞治療劑中添加100 U I的臺盼藍，並均勻混合後，慢慢注入至用蓋玻片覆蓋的血球計數器中。經過約I分鐘後，在顯微鏡下測定已染色的細胞(死亡細胞)和未染色的細胞(存活細胞)的數量。
通過以下公式I測定細胞的濃度。公式I
權利要求
1.一種用於緩解或治療皮膚缺損的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，包括從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟；將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟；以及從上述粉碎而成的組織碎片中獲取包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞的皮膚細胞群的步驟。
2.根據權利要求1所述的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，在上述將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟中，使用組織粉碎器，將上述正常皮膚組織大小的每 Icm2粉碎10 60秒的時間，從而將上述正常皮膚組織粉碎成細胞單位。
3.根據權利要求1所述的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，在上述將上述獲取的正常皮膚組織粉碎成細胞單位的步驟中，粉碎上述正常皮膚組織使得上述粉碎的細胞濃度為 I 40X IO7 個/cm2。
4.根據權利要求1所述的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，上述獲取的角質形成細胞為總獲取細胞的60 90%。
5.根據權利要求1所述的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，上述獲取的黑色素細胞為總獲取細胞的I 5%。
6.根據權利要求1所述的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，上述獲取的纖維細胞為總獲取細胞的10 40%。
7.根據權利要求1所述的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，無需對上述獲取的包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞在內的皮膚細胞群進行培養。
8.一種細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，在上述從源於自體皮膚組織的一個供體部位中獲取正常皮膚組織的步驟中，用於獲取包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞在內的皮膚細胞群時，無需進行酶處理。
9.根據權利要求1所述的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，上述皮膚缺損為從由燒傷、創傷、皮膚疤痕、色素脫失的皮膚傷口構成的群中選擇的某一種。
10.一種細胞治療劑，其特徵在於，通過如權利要求1至9中任一項所述的方法製備而成。
全文摘要
本發明涉及一種用於緩解或治療皮膚缺損的自體皮膚細胞治療劑的製備方法。本發明的利用自體皮膚細胞的用於緩解或治療皮膚缺損的細胞治療劑的製備方法，其特徵在於，包括從主體獲取正常皮膚組織的步驟；將上述獲取的組織粉碎成細胞單位的步驟；從上述粉碎而成的組織碎片中獲取包含角質形成細胞、黑色素細胞及纖維細胞中至少一種細胞在內的皮膚細胞群的步驟。由此，相比現有細胞治療劑的製備方法，排除了酶處理和/或培養步驟，相當簡便，並且能夠在短時間內完成製備，並立即用於患部。
文檔編號A61P17/02GK103037871SQ201180022884
公開日2013年4月10日 申請日期2011年5月11日 優先權日2010年5月11日
發明者李貞淑, 鄭孝先, 李正姬, 閏天在, 孫泰植, 金慶植 申請人:醫療集團蓓世體安