一種熱穩定性提高的蛋白酶及其構建方法和應用的製作方法
2023-04-28 01:07:51
專利名稱：一種熱穩定性提高的蛋白酶及其構建方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種熱穩定性提高的重組角蛋白酶及其構建方法和應用，屬於遺傳工程技術領域。
背景技術：
角蛋白酶(Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由細菌、放線菌和真菌等多種微生物產生。羽毛作為家禽飼養和屠宰工業的副產物每年產量巨大，且蛋白質和胺基酸含量豐富，是潛在的優良蛋白質資源。羽毛的合理利用一方面可以減少廢棄物對環境的汙染，同時可以作為一種飼科蛋白質應用於畜禽的飼養。在傳統利用羽毛過程中主要採用酸鹼水解。熱降解等方法，前者存在汙染環境問題，後者對能源消耗比較大，且可以 破壞部分胺基酸，降低了產品的營養價值。其他常見的角蛋白為動物的毛髮，如牛毛、羊毛和人發等，這類角蛋白質部分作為商業原料進行加工外，其餘多作為廢物處理，也造成了環境的汙染和蛋白資源的浪費。角蛋白酶能使角蛋白降解為多肽和胺基酸，既可用於農業肥料的生產，又可作為畜禽的飼料蛋白源；角蛋白酶是皮膚真菌重要的侵襲因子，其在皮膚病治療方面的研究還有待於進一步挖掘。另外，角蛋白酶可「消化」導致狂牛症和人類克雅氏症的毒蛋白，從而可應用於醫療和實驗儀器的淨化；它還可用於皮革脫毛鞣製，配製潤膚露、浴皂、洗髮水和脫毛膏等美容品。擁有較差熱穩定性的酶嚴重影響該酶在工業上的應用，提高角蛋白酶的熱穩定性在利於工業化應用的同時有助於角蛋白酶在應用過程中更好的滲透入底物表面並作用於底物，而且能夠減少雜菌的生長。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種熱穩定性提高的角蛋白酶。上述角蛋白酶是在GenBank accession nos. JX504681公布的基因序列基礎上,其成熟區的四個位點發生胺基酸突變，具體為 N122Y, N160C, A193P, N217S,其獲得方法為以 GenBank accession nos.JX504681公布的基因為出發基因，通過化學全合成或定點突變的方式將其成熟區的四個位點進行胺基酸的取代。產所述產角蛋白酶的基因工程菌或轉基因細胞系也為本發明要求保護的範圍。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種構建產角蛋白酶的基因工程菌的構建方法，具體包括如下步驟I)採用化學全合成或PCR方法克隆編碼權利要求I所述蛋白酶的基因kerTB ；2)將步驟I)獲得的kerTB基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體；3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。所述表達載體優選pMA 0911。應用上述產角蛋白酶基因工程菌發酵生產角蛋白酶的方法，將其斜面活化製備種子後，以3%的接種量轉入基本發酵培養基，於37°C、200rpm條件下培養24h。所述基本發酵培養基組成為胰蛋白腖10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖 10g/L, O. lg/L MgSO40檢測重組角蛋白酶熱穩定性指標(T1/2)的定義方法酶在指定溫度下酶活損失一半時所需要的時間。本發明採用定點突變技術將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker )基因進行定點突變並克隆連接到枯草芽孢桿菌表達載體pMA 0911，轉化Bacillus subtilis WB600,經純化驗證得到一株可以產具有較好熱穩定性角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600-pMA 0911-kerTB。該菌株表達的角蛋白酶在60°C的T1/2為78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍。這為角蛋白酶的應用奠定了良好的基礎。
圖I :蛋白電泳(SDS-PAGE)實驗結果。M :蛋白質分子量標準(Protein MolecularWeight Marker) ;1 :不含質粒的 Bacillus subtilis WB600 ;2 :含質粒 pMA0911_ker 重組菌；3 :含質粒pMA0911重組菌。圖2 :分子改造後重組角蛋白酶在60°C的T1/2和野生型(未改造)酶在60°C的T1/2的比較。
具體實施例方式實施例I熱穩定性提高的角蛋白酶本發明的角蛋白酶是在GenBank accessionnos. JX504681公布的基因序列基礎上，其成熟區的四個位點發生胺基酸突變，具體為N122Y，N160C，A193P，N217S，可以通過化學全合成或定點突變的方式將其成熟區的四個位點進行胺基酸的取代。實施例2產角蛋白酶基因工程菌的構建及鑑定採用化學全合成方法獲得編碼實施例I中角蛋白酶的ker基因，將其克隆到PMA0911，獲得含有kerTB基因的重組表達質粒pMA 0911-kerTB。重組質粒pMA 0911-kerTB轉化Bacillus subtilis WB600感受態細胞,得到能在含有卡那黴素(30mg/mL)的LB平板上正常生長的基因工程菌，並經過鑑定命名為Bacillussubtilis WB600-pMA 0911-kerTB。。實施例3重組菌的酶活測定和蛋白電泳角蛋白酶酶活測定方法將發酵液離心IOmin (10000X g，4°C )取發酵上清液，吸取200uL適當稀釋的酶液，加入300uL 0. 05mol/L gly-NaOH緩衝液(pH9. 0)溶解1%的底物(角蛋白)，50°C培養20min，加入500uL 4M TCA溶液以終止反應。離心lOmin，吸取200uL上清液移入到新的試管中，後依此加入ImL福林酚試劑和200uL 0. 5MNa2C03後50度顯色15min。空白為在加入酶液的同時，加入500uLTCA溶液，經過相同過程反應的過濾清液作為空白。在660nm處檢測吸光值,根據酪氨酸標準曲線定義每15min內釋放Iug酪氨酸定義為一個酶活單位。培養基種子和斜面培養基為LB培養基(IL):胰蛋白腖10g，酵母抽提物5g，NaClIOg ;斜面培養基添加瓊脂15g ;基本發酵培養基為添加葡萄糖的LB培養基(IL):胰蛋白腖IOg,酵母抽提物5g, NaCl 10g，葡萄糖IOg;培養方法將37°C、200rpm下培養過夜的種子以3%的接種量轉入基本發酵培養基，於37°C、200rpm條件下培養；以空載體作為對照，通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為30kDa的蛋白條帶(見圖1)，純化後測定該重組角蛋白酶在60°C的T1/2為78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍(見圖2)。
可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬於本發明所附的權利要求的保護範圍。
權利要求
1.一種熱穩定性提高的角蛋白酶，其特徵在於在GenBank accession nos.JX504681公布的基因序列基礎上，其成熟區的四個位點發生胺基酸突變，具體為N122Y, N160C,A193P, N217S。
2.一種獲得權利要求I所述角蛋白酶的方法，其特徵在於以GenBank accession nos.JX504681公布的基因為出發基因，將其成熟區的四個位點進行胺基酸的取代。
3.產權利要求I所述產角蛋白酶的基因工程菌或轉基因細胞系。
4.權利要求3所述產角蛋白酶的基因工程菌的構建方法，其特徵在於包括如下步驟 1)採用化學全合成或PCR方法克隆編碼權利要求I所述蛋白酶的基因kerTB； 2)將步驟I)獲得的kerTB基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體； 3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化Bacillussubtilis WB600得到基因工程菌。
5.權利要求4所述的基因工程菌，其特徵在於所述表達載體為PMA0911。
6.應用權利要求4所述基因工程菌發酵生產角蛋白酶的方法，其特徵在於以產角蛋白酶基因工程菌為生產菌株，斜面活化製備種子後，以3%的接種量轉入已優化的基本發酵培養基，於37°C、200rpm條件下培養24h。
7.權利要求6所述的方法，其特徵在於基本發酵培養基組成為胰蛋白腖10g/L，酵母抽提物 5g/L, NaCl 10g/L,葡萄糖 10g/L,0. lg/L MgSO4。
全文摘要
本發明公開了一種熱穩定性提高的角蛋白酶及其應用，屬於遺傳工程領域。本發明採用定點突變技術將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker)基因進行定點突變並克隆連接到枯草芽孢桿菌表達載體pMA 0911，轉化Bacillus subtilis WB600，經純化驗證得到一株可以產具有較好熱穩定性角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisWB600-pMA 0911-kerTB，該菌株表達的角蛋白酶在60℃的T1/2為78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍。這為角蛋白酶的應用奠定了良好的基礎。
文檔編號C12N15/57GK102936588SQ20121052824
公開日2013年2月20日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者陳堅, 張娟, 劉柏宏, 堵國成 申請人:江南大學