棕點湍蛙活性多肽及其基因和在製藥中的應用的製作方法
2023-04-25 23:20:46
專利名稱：棕點湍蛙活性多肽及其基因和在製藥中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種棕點湍蛙(Amolops loloensis)活性多肽及其基因和在製藥中的應用，屬於生物醫學領域。
背景技術：
自從抗生素髮明以來，人類在控制和治療微生物感染疾病中取得了較大的成就。但隨著「傳統抗生素」的持續使用，不斷產生出諸多新問題。目前，微生物抗藥性已成為臨床微生物感染疾病治療的重大問題，以至於某些病原細菌已沒有臨床治療的一線藥物。萬古黴素抗性的葡萄球菌、腸球菌以及其他革蘭氏陰性感染疾病目前均是世界範圍內的臨床難題，三類主要引起腦膜炎的細菌在臨床上也出現了強的抗藥性，抗青黴素、氯黴素腦膜炎雙球菌、肺炎球菌，對抗新頭孢菌素抗生素的肺炎球菌也廣泛出現。因此新一類抗生素的研製已成為當務之急和國際上的熱點。研究發現，多肽抗生素具有廣譜的抗菌活性，同時具有「傳統抗生素」無法比擬的優越性如在最小作用濃度時，快速而廣譜地殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)；對真菌也有抑制作用；不會誘導抗藥菌株的產生；對於局部感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗菌劑，其研製目前受到廣泛重視。
很多兩棲類動物在中國屬於傳統中藥和民族藥物而廣泛應用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報導藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮痛、局部麻醉、免疫調節、心血管系統作用等。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發明的熱點。據國內外文獻報導，已從各種生物來源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進入臨床治療。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌液獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時具有抗腫瘤活性，在美國已獲準作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產品已進入三期臨床；Intrabiotics公司生產的活性多肽IB-367已獲準用於治療癌症病人因多種細菌感染而引起的口腔潰瘍一期臨床試驗；Applied Microbiology公司與Astra公司合作用活性多肽nisin治療胃潰瘍的臨床試驗也取得良好的療效。
我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質的研究主要集中於生物鹼等有機小分子，對其皮膚活性肽類物質研究不多。棕點湍蛙(Amolops loloensis)主要分布於四川、雲南省，是我國特色資源動物之一。
發明人將本發明的棕點湍蛙活性多肽全序列胺基酸結構經蛋白質資料庫進行搜尋比較，未發現有任何相同多肽。發明人將本發明的棕點湍蛙活性多肽編碼基因經基因資料庫進行搜尋比較，未發現有任何相同基因。
發明內容
本發明的目的在於提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽性細菌，真菌)的棕點湍蛙活性多肽及其基因和在製藥中的應用。
為了實現本發明的目的，本發明提供如下技術方案棕點湍蛙活性多肽棕點湍蛙活性多肽是中國兩棲類棕點湍蛙活性多肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量2664.36道爾頓，等電點9.70，多肽全序列一級結構為Phe Leu ProLeu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys Lys Ile Thr Lys LysCys-AMIDATION。
棕點湍蛙活性多肽基因的克隆包括棕點湍蛙皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物，利用PCR方法篩選棕點湍蛙活性多肽基因。擴增引物長度為25個核苷酸，其序列為5』ATAAGACATCTGATGTGCATTTAGC 3』，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的5』PCR Primer引物，其序列為5』AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3』。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定。基因測序結果表明編碼棕點湍蛙活性多肽的基因由448個核苷酸組成，自5』端至3』端序列為taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aactacccga acccaaagat gttcaccttg120aagaaatccc tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgcgagcaa180gagagagatg ccgatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccacttgc ggtcagtctg gccgctaatt tcttgcccaa actattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgaa aatggaattg gaaatcatct gatgttgaat360atcatttagc taaatgcaca tcagatgtct tataaaaaaa taaagatatc tcaaacatca420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448編碼棕點湍蛙成熟活性多肽為第247-318位核苷酸，其胺基酸序列為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。
20棕點湍蛙活性多肽基因作為基因工程製備棕點湍蛙活性多肽的應用。
棕點湍蛙活性多肽的製備方法根據編碼棕點湍蛙活性多肽的基因推斷棕點湍蛙活性多肽的胺基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。然後用HPLC方法鑑定其純度，分子量測定採用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardmentmass spectrometry，FAB-MS)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。
棕點湍蛙活性多肽具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用，可以作為製備病原微生物感染疾病的治療藥物的應用。
本發明的有益效果在於由棕點湍蛙活性多肽編碼基因推導其胺基酸結構，合成的棕點湍蛙活性多肽具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用。該棕點湍蛙活性多肽具有結構簡單、人工合成方便、抗菌譜系廣的有益特點。
具體實施例方式實施例一棕點湍蛙活性多肽基因克隆I、棕點湍蛙皮膚總RNA提取A.活體棕點湍蛙用水清洗乾淨，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩衝液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產品)，於20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。
B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉澱。
C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉澱用75％乙醇洗一次，晾乾，管底沉澱物即為棕點湍蛙皮膚總RNA。
II、棕點湍蛙皮膚mRNA的純化棕點湍蛙皮膚mRNA分離純化採用美國PROMEGA公司的PolyATtractmRNA Isolation Systems試劑盒。
A.取棕點湍蛙皮膚總RNA 500μg溶於500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最後加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。
C.將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最後棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的棕點湍蛙皮膚mRNA。
D.加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，於-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉澱溶解於10μl DEPC水中。
III、棕點湍蛙皮膚cDNA文庫構建採用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit質粒cDNA文庫構建試劑盒。
A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄)1.在0.5ml無菌的離心管加入1μl棕點湍蛙皮膚mRNA、1μl SMARTIV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3』PCR引物，加2μl去離子水使總體積達到5μl。
2.混勻離心管中的試劑並短暫離心，72℃保溫2分鐘。
3.將離心管在冰上孵育2分鐘。
4.在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩衝、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉錄酶。
5.混合離心管中試劑並短暫離心，在42℃保溫1小時。
6.將離心管置於冰上中止第一鏈的合成。
7.從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。
B.採用長末端聚合酶鏈式反應(LD-PCR)方法擴增第二鏈1.95℃預熱PCR儀。
2.將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩衝、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5』PCR引物、2μl CDS III/3』PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進行反應。
3.在PCR儀中按以下程序擴增①95℃20秒鐘②22個循環95℃ 5秒鐘68℃ 6分鐘4.循環結束後，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。C.PCR產物用PROMEGA公司的WizardSV Gel and PCR Clean-UpSystem試劑盒進行抽提回收，步驟如下1.將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結合緩衝顛倒混勻，然後將混和液轉入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與矽膠膜結合。16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
2.加入700μl的洗脫液(含乙醇)於離心純化柱中，16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
3.重複步驟2。
4.16,000g離心5分鐘。
5.將離心純化柱置於新的離心管中。
6.加入30μl超純水，在室溫下靜置5分鐘。
7.16,000g離心1分鐘，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。
D.大腸桿菌DH5α感受態細胞的製備1.挑取單個DH5α菌落，接種於3ml不含氨苄青黴素的LB培養基中，37℃培養過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種於50ml LB培養液中，37℃振蕩2小時。當OD600值達到0.35時，收穫細菌培養物。
2.將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培養物冷卻至0℃。
3.於4℃以4100r/min離心10min，以回收細胞。
4.倒出培養液，將管倒置1min以使最後的痕量培養液流盡。
5.每50ml初始培養液且30ml預冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉澱。
6.於4℃以4100r/min離心10min，以回收細胞。
7.倒出培養液，將管倒置1min以使最後的痕量培養液流盡。
8.每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份細胞沉澱，分裝後備用。
E.酶切、連接以及連接產物的轉化1.在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl棕點湍蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。
2.加入5μl(等量)的連接酶緩衝混合物。
3.16℃反應2小時。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態細胞中，冰中放置30分鐘。
5.42℃加熱90秒鐘後，再在冰中放置1分鐘。
6.加入37℃溫浴過的LB培養基890μl，37℃緩慢振蕩培養60分鐘。
7.取200μl塗布於含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養基上37℃培養16小時，形成單菌落。
8.每個LB平皿用5ml LB液體培養基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構建的cDNA大約含1×106個單獨克隆。
IV、棕點湍蛙活性多肽基因克隆篩選擴增引物長度為25個核苷酸，其序列為5』ATAAGACATCTGATGTGCATTTAGC 3』，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTTMeDNA Library Construction Kit中的5』PCR Primer引物，其序列為5』AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3』。
PCR反應在如下條件下進行94℃30秒鐘，52℃45秒鐘和72℃2分30秒鐘，35個循環。
首先滴定構建的細菌cDNA文庫，然後用含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基稀釋至適當的細菌濃度(大約5000個細菌/毫升，和30個細菌/毫升分別用於首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養。按行、列分別合併細菌培養液，有16個樣品進行PCR鑑定，交叉陽性孔細菌樣品進入第二輪篩選。
V、棕點湍蛙活性多肽基因序列測定和結果提取質粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國AppliedBiosystems373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBESTTMSequencingPrimer RV-M和BcaBESTTMSequencing Primer M13-47，BcaBESTTMSequencingPrimer RV-M序列5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3』，BcaBESTTMSequencing Primer M13-475』CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3』。基因測序結果自5』端至3』端序列為taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aactacccga acccaaagat gttcaccttg120aagaaatccc tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgcgagcaa180gagagagatg ccgatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccacttgc ggtcagtctg gccgctaatt tcttgcccaa actattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgaa aatggaattg gaaatcatct gatgttgaat360atcatttagc taaatgcaca tcagatgtct tataaaaaaa taaagatatc tcaaacatca420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448棕點湍蛙活性多肽基因核苷酸的序列表為序列長度為448個鹼基，序列類型核酸，鏈數單鏈，拓撲學直鏈狀，序列種類cDNA，來源棕點湍蛙皮膚。
編碼棕點湍蛙成熟活性多肽為第247-318位核苷酸，其胺基酸序列為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。
20棕點湍蛙活性多肽基因作為基因工程製備棕點湍蛙活性多肽的應用。
實施例二製備棕點湍蛙活性多肽
I、棕點湍蛙活性多肽的製備方法根據編碼棕點湍蛙活性多肽的基因推斷棕點湍蛙活性多肽的胺基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
II、分子量測定採用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油∶間硝基苄醇∶二甲亞碸(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發射電壓為25Kv。
III、純化的棕點湍蛙活性多肽用高效液相色譜HPLC方法鑑定其純度，分子量測定採用快原子轟擊質譜法，等電聚焦電泳測定等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。
棕點湍蛙活性多肽是中國兩棲類動物棕點湍蛙活性多肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量2664.36道爾頓，等電點9.70，多肽胺基酸全序列一級結構為苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-丙氨酸-纈氨酸-絲氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬醯胺-苯丙氨酸--亮氨酸-脯氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-賴氨酸-醯胺化半胱氨酸(Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys LeuPhe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION)。
實施例三棕點湍蛙活性多肽抑制細菌生長的作用抗菌活性檢測，採用杯碟法，培養基為普通瓊脂培養基。分別注入加熱融化的培養基20ml於平皿中作為底層，使其在皿底內均勻攤布，凝固後，另取培養基適量加熱融化後，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻後，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不鏽鋼杯6個。第一個鋼杯加入0.1-0.3mg/ml濃度的待測化合物溶液0.1ml，其餘鋼杯採用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細菌菌株來源於昆明醫學院第一附屬醫院，此試驗重複四次，取平均值，結果如表1。
表1，棕點湍蛙活性多肽抑制細菌生長的作用
由表1可見，合成的棕點湍蛙活性多肽具有顯著的抑制細菌生長的作用。
棕點湍蛙活性多肽抑制真菌生長的作用抗真菌活性檢測採用杯碟法，培養基為改良沙保氏(Sabousand)培養基。分別注入加熱溶化的培養基20ml於平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固後另取培養基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻後，在平皿中等距離放入已消毒的不鏽鋼杯5個。第一個鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測化合物溶液0.1ml，其餘鋼杯採用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養，24h-48h後測量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細菌菌株來源於雲南大學微生物研究所，此實驗做三個平行，取幾何平均值，結果如表2。
表2.棕點湍蛙活性多肽抑制真菌生長的作用
由表2可見，合成的棕點湍蛙活性多肽具有顯著的抑制真菌生長作用。
棕點湍蛙活性多肽及其基因和在製藥中的應用-序列生成表SEQUENCE LISTING110南京農業大學120棕點湍蛙活性多肽及其基因和在製藥中的應用13011602170PatentIn version 3.32101211448212DNA213棕點湍蛙(Amolops loloensis)4001taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aactacccga acccaaagat gttcaccttg 120aagaaatccc tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgcgagcaa 180gagagagatg ccgatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa 240aaacgatttt taccacttgc ggtcagtctg gccgctaatt tcttgcccaa actattttgt 300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgaa aatggaattg gaaatcatct gatgttgaat 360atcatttagc taaatgcaca tcagatgtct tataaaaaaa taaagatatc tcaaacatca 420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448210221124212PRT213棕點湍蛙(Amolops loloensis)220
221AMIDATION222(24)4002Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION20
權利要求
1.棕點湍蛙活性多肽，其特徵在於該活性多肽是中國兩棲類棕點湍蛙活性多肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量2664.36道爾頓，等電點9.70，多肽全序列為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys LysIle Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。
2.棕點湍蛙活性多肽基因核苷酸序列，其特徵在於cDNA由448個核苷酸組成，其自5』端至3』端序列為taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aactacccga acccaaagat gttcaccttg120aagaaatccc tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgcgagcaa180gagagagatg ccgatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccacttgc ggtcagtctg gccgctaatt tcttgcccaa actattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgaa aatggaattg gaaatcatct gatgttgaat360atcatttagc taaatgcaca tcagatgtct tataaaaaaa taaagatatc tcaaacatca420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448
3.權利要求2所述的棕點湍蛙活性多肽基因核苷酸序列，其特徵在於，編碼棕點湍蛙成熟活性多肽為第247-318位核苷酸，其胺基酸序列為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。20
4.權利要求1所述的棕點湍蛙活性多肽，作為製備病原微生物感染疾病的治療藥物的應用。
全文摘要
本發明涉及一種活性多肽及其基因和在製藥中的應用，屬於生物醫學領域。該活性多肽是從中國兩棲類動物棕點湍蛙基因編碼的一種單鏈多肽，分子量2664.36道爾頓，等電點9.70，多肽全序列一級結構為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys－AMIDATION。編碼棕點湍蛙活性多肽的基因由448個核苷酸組成，其中編碼成熟棕點湍蛙活性多肽為第247－318位核苷酸。人工合成的棕點湍蛙活性多肽具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用，可以作為製備病原微生物感染疾病的治療藥物被應用。
文檔編號C12N15/12GK1803835SQ200610010628
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月12日 優先權日2006年1月12日
發明者賴仞, 徐學清, 梁建國, 韓曜平, 楊海龍, 李建許 申請人:南京農業大學