核心蛋白聚糖在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用的製作方法

2023-04-25 11:48:31 1

專利名稱：：核心蛋白聚糖在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫藥
技術領域：
，是核心蛋白聚糖(decorin，DCN)在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用。
背景技術：
：Decorin是富含亮氨酸硫酸的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)家族的成員，它的核蛋白是由12個重複的序列組成，這一重複序列是由一個富含亮氨酸的24個胺基酸殘基區域構成的，這一核蛋白構成了80。/。的蛋白部分。(Cabello-VerrugioC,BrandanE.Anovelmodulatorymechanismoftransforminggrowthfactor-3signalingthroughDecorinandLRP-1.JBiolChem.2007;282:18842-18850)其實早在1986年已報導其蛋白序列並克隆出人源的decorin蛋白聚糖(TKrusiusandERuoslahti.PrimarystructureofanextracellularmatrixproteoglycancoreproteindeducedfromclonedcDNA.ProcNatlAcadSciUSA.1986October;83(20):7683-7687.)。之後，在研究其生物學功能上，大量研究集中在其抑制腫瘤生長、防止腎小球、肺、肝等組織纖維化的作用上。(ReedCC,WaterhouseA,Ki勿S,KayP，OwensRT,McQuillanDJ,IozzoRV.Decorinpreventsmetastaticspreadingofbreastcancer.Oncogene.2005;24:1104-1110;RUhlandC,Sch6nherrE，RobenekH,HansenU，IozzoRV,BrucknerP,SeidlerDG.Theglycosaminoglycanchainofdecorinplaysanimportantroleincollagenfibrilformationattheearlystagesoffibrillogenesis.FEBSJ.2007Aug;274(16):4246-55)此外，還有報導decorin參與中樞神經系統損傷後的修復，實驗表明，當給予外源性decorin時，可促進損傷的神經軸突的再生。(Stichel，C.C.,Kappler,J.，Junghans,U.,Koops,A.,Kresse，H.andMuller,H.W"Differentialexpressionofthesmallchondroitin/dermatansulfateproteoglycansdecorinandbiglycanafterinjuryoftheadultratbrain，BrainRes，704(1995)263-74.)尚未見decorin用於治療缺血性腦血管疾病方面的文獻報導。
發明內容本發明的目的是提供核心蛋白聚糖(decorin)的藥學新用途。本發明提供了核心蛋白聚糖(decorin)在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用。本發明中的核心蛋白聚糖(decorin)直接購買自Sigma生物試劑公司生產的核心蛋白聚糖(decorin)，此核心蛋白聚糖(decorin)是從牛關節軟骨提取的，濃度為0.5mg核心蛋白聚糖(decorin)溶於0.25ml磷酸鹽緩衝液。本發明通過體內動物實驗表明decorin對小鼠腦缺血再灌注損傷引起的腦梗塞有顯著保護作用。本發明通過體外細胞實驗表明decorin通過與MMP-2相互作用，降低血管通透性，減少炎症反應及血栓的形成，從而發揮治療缺血性腦血管疾病作用。本發明提供的核心蛋白聚糖(decorin)在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用，其中的缺血性腦血管疾病是指腦梗塞、腦動脈硬化……。本發明的核心蛋白聚糖可以按照常規藥劑學方法製備成注射液形式。圖1為TTC染色後的腦切片掃描圖，顯示不同組別小鼠腦缺血模型中腦梗死面積。其中A為假手術組；B為手術組；C為核心蛋白聚糖(decorin)藥物組。圖2為免疫印跡圖，即不同濃度的溶血性磷脂醯膽鹼(LysoPC)刺激腦微血管內皮細胞MMP-2的表達以及核心蛋白聚糖(decorin)作用於腦微血管內皮細胞被LysoPC刺激後MMP-2的表達差異。圖3為凝膠定量統計圖，利用QuantityOne軟體分析圖2中MMP-2在免疫印跡反應中的表達差異。具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細描述。實施例1:核心蛋白聚糖(decorin)用於治療缺血性腦血管疾病的體內動物實驗小鼠線栓法製作局灶性腦缺血模型的藥理實驗是驗證藥物具有防治缺血性腦血管病作用常用的動物實驗，因此用其驗證核心蛋白聚糖(decorin)對實驗性動物腦缺血的保護作用。1.動物ICR小鼠，25-28g,雄性，每組8隻/籠群養，共分3組。購於中國科學院上海實驗動物中心(動物合格證號中科滬動管字99一003號)。詞養於清潔級動物房。2.藥物根據不同的組合，將實驗小鼠進行分組假手術組(A):不給予任何藥物。手術組(B):給予與藥物實驗組等量的生理鹽水。核心蛋白聚糖(decorin)藥物組(C):給予0.2ml0.2y。核心蛋白聚糖(decorin)(Sigma公司生產，濃度為0.5mg/0.25ml)。3.實驗方法將小鼠用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，頸部正中切口，逐層分離並暴露右側頸總動脈，小心分離右側頸總動脈頸內動脈、頸外動脈，分離右側頸外動脈，用6—0號絲線結紮其遠端，在右頸總動脈分叉至前一頸外動脈結紮線之間打一松結，游離右頸內動脈並用微血管夾夾閉；用胰島素針頭挑破頸內動脈，將拴塞線插入小鼠頸內動脈向前徐進約lcm直至感受到砠力；將尼龍線與頸外動脈同時結紮以固定尼龍線，防止出血和栓子滑出。此時插入的尼龍線正好封閉大腦中動脈開口，阻斷大腦中動脈血流。縫合皮膚，術畢。術後2h將尼龍線從頸內動脈中拔出，直至頭端達頸總動脈分叉處。再灌注24h。假手術組除不插線外，其餘步驟同上。再灌注24h後存活的小鼠斷頭取腦，迅速置-20。C冷凍箱中冷凍5min後取出，在操作臺上迅速由前向後行厚2.0mm的冠狀切片，將切片立即置於1^的TTC磷酸鹽緩衝液中，避光常溫孵育30min。每隔10min翻動腦片使均勻接觸到染色液，掃描觀察染色結果。4.試驗結果腦梗死體積觀察由於TTC是脂溶性光敏感複合物，是呼吸鏈中吡啶-核苷結構酶系統的質子受體，與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織內脫氫酶活性下降，不能反應，故不會產生變化呈蒼白。因此，假手術組(A)腦組織無梗塞，手術組(B)缺血側腦組織有明顯梗塞現象，腦片梗塞區佔整個冠面的百分比為32.7±3.0%。核心蛋白聚糖(decorin)治療組(C)可顯著縮小缺血側腦組織梗塞面積，與手術組相比有非常顯著差異(戶O.Ol)，腦片梗塞區佔整個冠面的百分比為19.6±4.6%，如表l。表l:實驗各組小鼠腦缺血模型的梗死面積tableseeoriginaldocumentpage65.結果分析核心蛋白聚糖(decorin)對小鼠腦缺血再灌注損傷引起的腦梗塞有顯著保護作用。實施例2:核心蛋白聚糖(decorin)用於治療缺血性腦血管疾病的體外實驗1.方法空白對照組腦微血管內皮細胞在含有10%胎牛血清DMEM的培養基中培養LysoPC組a)在含有10%胎牛血清DMEM的培養基中加入濃度為l(T7的LysoPC培養腦微血管內皮細胞。b)在含有10%胎牛血清DMEM的培養基中加入濃度為l(T6的LysoPC培養腦微血管內皮細胞。c)在含有10%胎牛血清DMEM的培養基中加入濃度為10—5的LysoPC培養腦微血管內皮細胞。Decorin組在含有10%胎牛血清DMEM的培養基中加入濃度為l(T5的LysoPC和decorin共同培養腦微血管內皮細胞。培養24小時後，將細胞裂解提取蛋白，蛋白定量後，10MSDS-PAGE跑電泳，轉膜，將硝酸纖維素膜在5%脫脂奶粉溶於TBST的溶液中室溫封閉2小時。TBST洗膜3次後，將膜置於抗小鼠MMP-2抗體(1:500稀釋，美國SantaCruz公司)孵過夜。一抗後再用TBST洗膜3次，室溫下孵HRP標記兔抗小鼠抗體(1:5000稀釋，康成生物)2小時。二抗後TBST洗膜3次，ECL顯色，暗室壓片，再經顯影液和定影液手工洗片後，觀察結果。2.實驗結果MMP-2的表達隨著LysoPC濃度升高而上調。當腦血管內皮細胞被10—5濃度的LysoPC刺激後，再將decorin作用於上述內皮細胞，其MMP-2的表達較之前10—5濃度的LysoPC刺激後明顯下調，如圖2所示。利用QuantityOne軟體分析數據，通過MMP-2與GAPDH表達的比值得到MMP-2表達的相對含量。統計分析得到，不同處理組之間MMP-2表達有明顯的差異。"P<0.01，n=3，如圖3所示。3.結果分析基質金屬蛋白酶(MMPs)是分解細胞外基質(ECM)的蛋白酶類中最重要的一類。有文獻報導，IV型膠原酶MMP-2在腦缺血再灌注損傷後通過降解IV膠原，從而破壞細胞外基質和基底膜(MachadoLS,KozakA,ErgulA，HessDC,BorlonganCV,FaganSC。Delayedminocyclineinhibitsischemia-activatedmatrixmetalloproteinases2and9afterexperimentalstroke.BMCNeurosci.2006Jul17;7:56)，造成血管通透性增加，血腦屏障開放，炎細胞侵入缺血受損腦組織，造成局部炎性反應以及形成缺血後梗死灶(NagelS,SuY,HorstmannS,HeilandS:GardnerH,KoziolJ,Martinez-TorresFJ,WagnerS.Minocyclineandhypothermiaforreperfusioninjuryafterfocalcerebralischemiaintherat:effectsonBBBbreakdownandMMPexpressionintheacuteandsubacutephase.BrainRes.2008Jan10;1188:198-206)。本發明通過實驗證明在腦缺血損傷後，Decorin通過與醒P-2相互作用降低MMP-2的表達降低，並進一步降低血管通透性，減少炎症反應及血栓的形成，從而發揮治療作用。權利要求1、核心蛋白聚糖在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用。2、根據權利要求1所述的核心蛋白聚糖在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用，其特徵在於缺血性腦血管疾病是指腦梗塞或腦動脈硬化。3、根據權利要求1或2所述的核心蛋白聚糖在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用，其特徵在於核心蛋白聚糖為注射劑。全文摘要本發明涉及醫藥
技術領域：
。核心蛋白聚糖(Decorin)是富含亮氨酸硫酸的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)家族的成員，其生物學功能方面大量研究集中在其抑制腫瘤生長、防止腎小球、肺、肝等組織纖維化的作用上。本發明通過對腦缺血的整體動物實驗和體外細胞實驗證明，核心蛋白聚糖(Decorin)通過降低血管通透性以及炎症反應減少由於缺血造成的血栓形成，從而發揮治療缺血性腦血管疾病作用。因此，本發明提供的核心蛋白聚糖(Decorin)具有在製備防治缺血性腦血管病藥物中良好的應用前景。文檔編號A61K38/17GK101361966SQ20081020061公開日2009年2月11日申請日期2008年9月27日優先權日2008年9月27日發明者玲盧,宋旭輝,楊鵬遠,熊青卉,芮耀誠申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學