一種裂谷熱病毒rt-lamp的檢測方法

2023-04-25 16:58:06

一種裂谷熱病毒rt-lamp的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測方法檢測過程中：步驟a，建立如下擴增反應體系：5μl?RNA樣品、2.5μl?Bst?DNA聚合酶緩衝液(10x)、1μl?Bst?DNA聚合酶(8U/μl)、1μl?AMV反轉錄酶(10U/μl)、1μld?NTP(25mmol/μl)、5μl?Betaine(5μmol/μl)、1μl?Mg?SO4(100nmol/μl)、對應於L基因的四條引物各1μl引物濃度為F3與B3：5pmol/μl、BIP與FIP：70pmol/μl、H2O補足至25μl；步驟b，將上述各組分混勻後，在65℃水浴中反應1.5～2h；步驟c，用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳，然後觀察結果。本發明新型的RT-LAMP技術具有快速靈敏、操作簡單，安全性高，價格低廉，不需要特殊儀器設備等優點，特別適用於基層檢驗檢疫機構普及應用，為裂谷熱病毒早期診斷提供了一種快速、使用的診斷方法。
【專利說明】—種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及疾病的組織樣品和蟲媒早期診斷和監測，尤其涉及一種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測方法。
【背景技術】
[0002]裂谷熱(RiftValley fever,RVF)是由裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)引起的，由節肢動物傳播的熱性、急性的一種人獸共患病，該病對全球其他地區如歐洲、亞洲等的動物和人類健康的構成嚴重的威脅。在裂谷熱感染區，RVF的流行引起家畜的流產和死亡，對家畜造成難以估量的損失，病毒感染人後，臨床表現為腦炎、視網膜炎(導致失眠)等症狀，個別病例表現為出血熱症狀。RVFV是一種單股負鏈RNA病毒，RNA分為L (大)、M (中)、S (小)三個片段，RVFV為布尼安病毒科白蛉熱病毒屬。通過冷凍電子斷層掃描RVFV呈多晶狀，呈T = 12正20面體結構。
[0003]在RVF流行地區，通常用臨床診斷和兩種以上實驗室診斷方法對RVFV進行檢測。當家畜出現有流產病例，除了考慮RVFV外，這種症狀容易和彎曲桿菌病、牛傳染性鼻氣管炎、藍舌病、布氏桿菌病等引起的症狀相似。RVFV病毒的培養需要在生物安全4級實驗室，診斷檢測需要在實驗室中進行。常用的檢測方法如病毒分離，核酸檢測和抗體檢測。然而病毒分離法時間周期長且費用昂貴，血清學方法主要是ELISA方法，如檢測IgM和IgG抗體，但這些試驗的結果與白蛉熱病毒屬的其他血清型有交叉性。核酸檢測方法如RT-PCR，多重RT-PCR，實時螢光RT-PCR都已經建立和應用。PCR方法敏感、特異、結果可靠，節省時間，適用於臨床確診，但實驗儀器和檢測費用較貴，對人員的操作技能也有一定的要求。
[0004]鑑於上述缺陷，本發明創作者經過長時間的研究和實踐終於獲得了本創作。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一種裂谷熱病毒RT-LAMP的快速檢測方法，用以克服上述技術缺陷。
[0006]為實現上述目的，本發明提供一種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測方法，根據GenBank中登錄的裂谷熱L片段基因分析其保守序列，採用的RT-LAMP引物序列如下:
[0007]F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
[0008]B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
[0009]FIP(Flc+F2):
[0010]5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0011]BIP(Blc+B2):
[0012]5' -TCAGATGATG CAAG GAAGTG GA-TTTAG GAGAG GTGAACTCACA-3'
[0013]F2:5/ -GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0014]Flc:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
[0015]B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'[0016]Blc:5/ -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'。
[0017]進一步，檢測過程中:
[0018]步驟a，建立如下擴增反應體系:5 μ I RNA樣品、2.5 μ I Bst DNA聚合酶緩衝液(IOx)、I μ IBst DNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反轉錄酶(IOU/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ 1)、5μ IBetaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、對應於 L 基因的四條引物各I μ I 引物濃度為 F3 與 Β3:5pmol/y 1、BIP 與 FIP:70pmol/y 1、H2O 補足至 25 μ I ；
[0019]步驟b，將上述各組分混勻後，在65°C水浴中反應1.5~2h ;
[0020]步驟c，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，然後觀察結果。
[0021]與現有技術相比較本發明的有益效果在於:本發明新型的RT-LAMP技術具有快速靈敏、操作簡單，安 全性高，價格低廉，不需要特殊儀器等優點，特別適用於基層檢驗檢疫機構普及應用。本發明建立的RT-LAM P方法特異性和敏感性方面不亞於螢光RT-PCR方法，在快速檢測方面起到一定的作用。檢測RVFV核酸技術能夠用於臨床診斷、風險評估和風險因子的研究。在符合流行病學的情況下，應用分子生物學技術、血清學技術、病毒分離等診斷技術進行綜合檢測，這樣保證檢測結果更加準確和可靠。
【具體實施方式】
[0022]以下結合實施例，對本發明上述的和另外的技術特徵和優點作更詳細的說明。
[0023]本發明參照OIE推薦的RT-PCR方法擴增的靶序列設計RT-LAMP引物，並優化反應條件，建立了一種更加穩定的檢測方法。
[0024]根據GenBank中登錄的裂谷熱L片段基因分析其保守序列，設計RT-LAMP擴增所用引物FIP、BIP、F3、B3由本發明設計。RT-LAMP引物序列如下:
[0025]F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
[0026]B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
[0027]FIP(Flc+F2):
[0028]5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0029]BIP(Blc+B2):
[0030]5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
[0031 ] F2:5/ -GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0032]FlC:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
[0033]B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
[0034]BlC:5/ -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'
[0035]在檢測過程中:
[0036]步驟a，建立如下擴增反應體系:5μ I RNA樣品、2.5 μ IBst DNA聚合酶緩衝液(IOx)、I μ IBstDNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反轉錄酶(10U/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ 1)、5μ I Betaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、對應於 L 基因的四條引物各I μ I 引物濃度為 F3 與 Β3:5pmol/y 1、BIP 與 FIP:70pmol/y 1、H20 補足至 25 μ I。
[0037]步驟b，將上述各組分進行混勻後，在65°C水浴中反應1.5~2h ;
[0038]步驟c，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，然後觀察結果。
[0039]本發明新型的RT-LAMP技術具有快速靈敏、操作簡單，安全性高，價格低廉，不需要特殊儀器等優點，特別適用於基層檢驗檢疫機構普及應用。本發明建立的RT-LAMP方法特異性和敏感性方面不亞於螢光RT-PCR方法，在快速檢測方面起到一定的作用。檢測RVFV核酸技術能夠用於臨床診斷、風險評估和風險因子的研究。在符合流行病學的情況下，應用分子生物學技術、血清學技術、病毒分離等診斷技術進行綜合檢測，這樣保證檢測結果更加準確和可靠。
[0040]以上所述僅為本發明的較佳實施例，對發明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。本專業技術人員理解，在發明權利要求所限定的精神和範圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效，但都將落 入本發明的保護範圍內。
【權利要求】
1.一種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測方法，其特徵在於，根據GenBank中登錄的裂谷熱L片段基因分析其保守序列，採用的RT-LAMP引物序列如下:
F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
FIP(Flc+F2):
.5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
BIP(Blc+B2):
.5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
F2:5' -GAGACACATGGCATCAGG-3'
FlC:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3' BlC:5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'。
2.根據權利要求1所述的裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測方法，其特徵在於，檢測過程中: 步驟a，建立如下擴增反應體系:5 μ IRNA樣品、2.5 μ IBst DNA聚合酶緩衝液(IOx)、.1 μ IBst DNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反轉錄酶(10U/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ I)、.5 μ IBetaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、對應於 L基因的四條引物各 I μ I 引物濃度為 F3 與 Β3:5pmol/y 1、BIP 與 FIP:70pmol/y 1、H2O 補足至 25 μ I ； 步驟b，將上述各組分混勻後，在65°C水浴中反應1.5~2h ; 步驟C，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察結果。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952494SQ201410078254
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】王 華, 吳曉東, 徐天剛, 王淑娟, 李林, 王志亮 申請人:中國動物衛生與流行病學中心