白細胞介素－2前體脂質體及其製備方法
2023-04-27 00:45:11
專利名稱：白細胞介素－2前體脂質體及其製備方法
技術領域：
本發明屬於藥物製劑技術領域。具體涉及白細胞介素-2前體脂質體及其製備方法。
背景技術：
白細胞介素-2(IL-2)是一種由輔助性T淋巴細胞分泌的水溶性蛋白質(糖蛋白)，由活化的淋巴細胞所產生，含133個胺基酸殘基的糖蛋白，其精確分子量為15420，在hIL-2胺基酸的第58位和105位的兩個半胱氨酸之間形成的鏈內二硫鏈，對IL-2的構象和生物學活性有重要的作用。白細胞介素-2是淋巴細胞對抗原或絲裂原刺激後發生增殖反應再產生的淋巴因子。白細胞介素-2能夠促進殺傷性T細胞(TC)、自然殺傷細胞(NK)及其它殺傷效應細胞的增殖活化，而且能直接或間接地影響B淋巴細胞及巨噬細胞的功能，誘導和促進幹擾素產生，刺激產生淋巴因子激活的細胞(LAK)和腫瘤侵潤淋巴細胞(TIL)，從而起到抗腫瘤、抗病毒的作用。但是白細胞介素2(IL-2)作為藥物存在著用藥劑量大、生物半衰期短並引起發熱不適、間接性肺水腫、低血壓和心動過速、貧血症等一系列循環、呼吸、泌尿、神經系統的較嚴重的毒性反應。
前體脂質體作為脂質體中的一類新型的脂質體，系將脂質體組成成分和賦形劑製成脫水形式，為乾燥、具有良好流動性能的粉末，應用前與水混合，即可分散或溶解成等張的重建脂質體。其特點為①靶向性前體脂質體作為一種新型的脂質體，屬於靶向給藥系統，脂質體具有類細胞結構，進入人體主要被網狀內皮系統吞噬而激活機體的自身免疫功能，並改變被包封藥物的體內分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積，進而實現靶向給藥；②長效緩釋作用前體脂質體製劑能夠降低藥物的清除速率，延長藥物作用時間，增加藥物在體內的穩定性；③藥物包封於前體脂質體，能夠降低藥物毒性，提高藥物的治療指數，減少藥物的治療劑量並且使大劑量臨床治療成為可能；④前體脂質體能夠保護包封的藥物，提高藥物的穩定性；⑤前體脂質體解決了脂質體分散系統的物理不穩定性如藥物的滲漏、粒子的聚集以及磷脂在液態下的氧化、水解問題；⑥前體脂質體解決了工業化生產的一系列技術難點，使產業化成為可能。
現有前體脂質體的製備方法是將脂質吸附於極細的水溶性載體上，如氯化鈉、山梨醇或其他聚合糖類，以增加脂質的分散的表面積，當這種「前體脂質體」與水接觸時，脂質溶漲而載體迅速溶解，在水相中形成多層脂質體。
目前刊物雜誌對前體脂質體也有相關的報導，但是真正形成產品的還沒有，大多處於理論研究和實驗室階段。有關水溶性藥物脂質體報導很少，特別是穩定性不是很好的水溶性大分子藥物前體脂質體，目前在相關資料上還沒有看到有關報導。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於解決水溶性大分子蛋白藥物白細胞介素-2前體脂質體的活性回收和包封率問題，提高白細胞介素-2藥物的穩定性，提供一種更適合採用噴霧形式的肺部給藥劑型，使白細胞介素-2大劑量臨床應用成為可能。
本發明公開的白細胞介素-2前體脂質體是由重量百分比為0.01～0.5％白細胞介素-2、8.0～30.0％磷脂類和膽固醇類脂質體載體、0.1～5.0％抗氧劑、15.0～40.0％水溶性載體和24.5～76.89％填充劑製成的粒徑小於900nm的粉末。
本發明所述磷脂類脂質體載體優選豆磷脂和卵磷脂。
本發明所述膽固醇類脂質體載體選自膽甾醇、膽固醇棕櫚酸酯和膽固醇硬脂酸酯。
本發明所述抗氧劑選自製劑中常用的各種抗氧劑，包括無機硫化物、烯醇類、苯酚類和氨基類抗氧劑，優選無機硫化物如亞硫酸氫鈉、硫脲等。
本發明所述水溶性載體選自粉末氯化鈉和山梨醇。
本發明所述填充劑選自甘露醇、葡萄糖和海藻酸。
本發明所要解決的另一技術問題在於提供了上述白細胞介素-2前體脂質體的製備方法，該方法包括下列步驟(1)配製PH6.8的磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉緩衝液，取白細胞介素-2原料溶於重量比為1∶1000～20000的磷酸緩衝液中，得到白細胞介素-2溶液W1；(2)取磷脂類和膽固醇類脂質體載體混合，於40～80℃熔融，得到混合物W2，趁熱加入溶液W1，迅速攪拌混合均勻，冰浴降溫，加入水溶性載體與抗氧劑，乳化均勻；(3)加入適量的磷酸緩衝液和填充劑，高速剪切機乳化混合均勻，得到乳白色的混合液W3；(4)將混合液W3真空冷凍乾燥或者噴霧乾燥，即得白色流動性良好的白細胞介素-2前體脂質體粉末，粒徑小於900nm。
本發明所述乳化方法包括採用電動攪拌器，超聲波乳化器，膠體磨，高壓乳勻劑，高速剪切乳化機等設備乳化。
在本發明製備過程中特別要注意熔融的效果、噴霧乾燥的溫度以及乳化的程度。這些都會不同程度地影響藥物的包封率和回收率。熔融的充分程度很大程度上影響包封率，必要時可以加入少量有機溶劑助熔如乙醇或乙醚等，這些有機溶劑在下一步操作之前要揮幹。噴霧乾燥的進口溫度不能高於160℃，收集瓶溫度採用冰浴處理保證收集的白細胞介素-2前體脂質體不長時間受熱空氣的影響，提高活性回收率。乳化條件的選擇主要包括乳化強度和時間的選擇，高強度長時間乳化會造成活性回收率的降低，而且在操作過程中要注意操作溶液溫度控制在-10～20℃左右。在應用低熔點的脂質時則特別要注意溫度不能太高，否則顆粒容易結塊，製備時也可使用任何能溶解脂質的溶劑。根據本發明方法製得的白細胞介素-2前體脂質體包封率和活性回收率達到90％以上，並經穩定性試驗證明，本發明白細胞介素-2前體脂質體質量穩定。
小分子藥物是目前最為實際、效果最理想的製藥目標，小分子藥物的作用位置、作用機理確切，專一性強，人體生理利用度和適應性好，已成為較為理想的創新藥物模式。本發明的白細胞介素-2前體脂質體由於粒徑小可採用噴霧方式肺部局部給藥，肺組織的表面積很大(≈140m2)，能迅速吸收藥物直接進入大循環，有利於提高藥物的生物利用度，有效地發揮藥物的局部和全身治療作用，實現藥物的靶向性，同時提高人體對白細胞介素-2的耐受劑量，增加白細胞介素-2的臨床應用範圍。
本發明白介-2前體脂質體劑型，可用於腎癌、惡性黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、腸癌、膀胱癌、肝癌、多發性骨髓瘤、頭頸部腫瘤、白血病、癌性胸腹水、嚴重聯合免疫缺陷病(SCID)，以及B型肝炎、C型肝炎、中毒性休克和燒傷感染的恢復期治療。白細胞介素-2前體脂質體還可以肺部給藥，進行局部或全身治療。
本發明白細胞介素-2前體脂質體具有下述特點(1)前體脂質體為固體，穩定性極好，適合大規模的工業化生產；(2)前體脂質體水化後的粒徑達到納米級，小於900nm，可改善藥物對黏膜組織的滲透性，減少對組織的刺激性，增加藥物的吸收；(3)包封率和活性回收率高，達到90％以上；(4)肺部給藥的安全性高進入呼吸道及肺部的脂質體，大多通過黏膜纖毛運動或巨噬細胞內吞等方式清除，內吞的外源性磷脂能被再吸收利用，與肺部的內源性磷脂一起被循環更新。
具體實施例方式
實施例1白細白介素-2 2.5千萬單位，卵磷脂0.60g，膽固醇0.15g，山梨醇0.80g，甘露醇2.60g，氯化鈉0.20g，葡萄糖0.6g，亞硫酸氫鈉0.05g。
製備工藝配製0.01M/PH6.8的磷酸緩衝液(磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉)，取2.5千萬單位白細胞介素-2加5.0～10.0ml緩衝液溶解；取卵磷脂0.60g和膽固醇0.15g混勻，60.0℃熔融，將白細胞介素-2溶液加入熔融物中，攪拌混合均勻；加入山梨醇0.80g和亞硫酸氫鈉0.05g，高速剪切乳化均勻；然後加入甘露醇2.6g，氯化鈉0.2g，葡萄糖0.6g，超聲波乳化分散均勻，在-20℃條件下預凍4小時，在-50℃條件下冷凍真空乾燥24小時，即得具有流動性的白色粉末狀態的前體脂質體，水化後粒經小於800nm，4.65×106單位/g製劑，活性回收93％，包封率94.8％。
實施例2白細胞介素-2 2.5千萬單位，卵磷脂0.50g，二棕櫚醯卵磷脂0.50g，膽固醇0.10g，山梨醇1.00g，甘露醇1.80g，葡萄糖1.05g，硫代乙酸0.02g，L-穀胱甘肽0.03g。
製備工藝配製0.1M/PH6.8的磷酸緩衝液，取2.5千萬單位白細胞介素-2加5.0～10.0ml緩衝液溶解；取豆磷脂0.5g，二棕櫚醯卵磷脂0.5g和膽固醇0.1g混勻水浴中加熱熔融(70.0℃)，將白細胞介素-2溶液加入熔融物中，攪拌混合均勻；加入山梨醇1.0g，硫代乙酸0.02g和L-穀胱甘肽0.03g，高速剪切乳化均勻；然後加入甘露醇1.8g，葡萄糖1.05g，超聲波乳化分散均勻，噴霧乾燥，進口溫度150℃，出口溫度105℃，流速10m/min，風速600m3/hour，即得具有流動性的白色粉末狀態的前體脂質體，水化後粒經小於600nm。4.50×106單位/g製劑，活性回收率90％，包封率93.5％。
實施例3白細胞介素-2 2.5千萬單位，氫化卵磷脂0.75g，膽固醇0.05g，山梨醇0.75g，甘露醇2.82g，葡萄糖0.60g，羥基甲烷磺酸鈉0.01g，維生素C棕櫚酸酯0.02g。
製備工藝配製0.01M/PH6.8的磷酸緩衝液，取2.5千萬單位白細胞介素-2加5.0～10.0ml緩衝液溶解；取氫化卵磷脂0.75g和膽固醇0.05g混勻熔融(50.0℃)，將白細胞介素-2溶液加入熔融物中，攪拌混合均勻；加入山梨醇0.75g，羥基甲烷磺酸鈉0.01g和維生素C棕櫚酸酯0.02g，高速剪切乳化均勻；然後加入甘露醇2.82g，葡萄糖0.6g，乳化分散均勻，在-20℃條件下預凍4小時，在-50℃條件下冷凍真空乾燥24小時，即得具有流動性的白色粉末狀態的前體脂質體，水化後粒經小於850nm，4.87×106單位/g製劑，活性回收97.4％，包封率90.8％。
實施例4白細胞介素-2前體脂質體穩定性考察數據比較。
表1.IL-2穩定性試驗 貯存條件為4℃(溼度75％)20030606-3#和020030825-6#採用上述實施例1和3的冷凍乾燥方法製備的白細胞介素-2前體脂質體。
20030626-2#採用上述實施例2的噴霧乾燥方法製備的白細胞介素-2前體脂質體。
實施例5白細胞介素-2前體脂質體包封率比較試驗。
表2.IL-2包封率比較試驗 其中對照品1為採用空白前體脂質體法製備的白細胞介素-2前體脂質體。即首先製備未包封藥物的空白脂質體，冷凍乾燥前將待包封的藥物加入混合，迅速冷凍製備前體脂質體。活性回收率為90％以上，包封率為52.0％。
檢測分析方法白介-2的分子量為15,000，選用葡聚糖凝膠G-50分離前體脂質體。包封率EN(％)計算EN(％)＝W包封/W總×100％；其中W包封表示總投料量，W包封表示包封的藥物量，白介-2以及白介-2前體脂質體測定方法MTT比色法。
實施例6白細胞介素-2前體脂質體回收率比較試驗。
表3.IL-2回收率比較試驗 其中對照品2為現有的前體脂質體法製備的白細胞介素-2前體脂質體。其中山梨醇與磷脂的重量比為4.3∶1，採用改進的旋轉蒸發器，真空減壓至93-101kPa，水浴溫度35-45℃，先將載體山梨醇放在旋轉蒸發儀中，分部加入類脂-藥物混合液旋轉蒸發除去其中的溶劑。
權利要求
1.白細胞介素-2前體脂質體，其特徵在於該前體脂質體由重量百分比為0.01～0.5％白細胞介素-2、8.0～30.0％磷脂類和膽固醇類脂質體載體、0.1～5.0％抗氧劑、15.0～40.0％水溶性載體和24.5～76.89％填充劑製成的粒徑小於900nm的粉末。
2.根據權利要求1所述的白細胞介素-2前體脂質體，其特徵在於其中所述的磷脂類脂質體載體選自豆磷脂和卵磷脂，膽固醇類脂質體載體選自膽甾醇、膽固醇棕櫚酸酯和膽固醇硬脂酸酯。
3.根據權利要求1所述的白細胞介素-2前體脂質體，其特徵在於其中所述的抗氧劑選自無機硫化物、烯醇類、苯酚類和氨基類抗氧劑。
4.根據權利要求1所述的白細胞介素-2前體脂質體，其特徵在於其中所述的水溶性載體選自氯化鈉和山梨醇。
5.根據權利要求1所述的白細胞介素-2前體脂質體，其特徵在於其中所述的填充劑選自甘露醇、葡萄糖和海藻酸。
6.根據權利要求1所述的白細胞介素-2前體脂質體的製備方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)配製PH6.8的磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉緩衝液，取白細胞介素-2原料溶於重量比為1∶1000～20000的磷酸緩衝液中，得到白細胞介素-2溶液W1；(2)取磷脂類和膽固醇類脂質體載體混合，於40～80℃熔融，得到混合物W2，趁熱加入溶液W1，迅速攪拌混合均勻，冰浴降溫，加入水溶性載體與抗氧劑，乳化均勻；(3)加入適量的磷酸緩衝液和填充劑，高速剪切機乳化混合均勻，得到乳白色的混合液W3；(4)將混合液W3真空冷凍乾燥或者噴霧乾燥，即得。
7.根據權利要求6所述的白細胞介素-2前體脂質體的製備方法，其特徵在於其中所述的高速剪切機乳化混合時溶液溫度控制在-10～20℃。
8.根據權利要求6所述的白細胞介素-2前體脂質體的製備方法，其特徵在於其中所述的混合液W3噴霧乾燥是的進口溫度低於160℃。
全文摘要
本發明涉及白細胞介素－2前體脂質體及其製備方法。本發明公開的白細胞介素－2前體脂質體是由重量百分比為0.01～0.5％白細胞介素－2、8.0～30.0％磷脂類和膽固醇類脂質體載體、0.1～5.0％抗氧劑、15.0～40.0％水溶性載體和24.5～76.89％填充劑製成的粒徑小於900nm的粉末。本發明白細胞介素－2前體脂質體具有穩定性好，包封率和活性回收率高，藥物吸收性好，適合大規模的工業化生產等特點。特別適用於肺部給藥。
文檔編號A61K35/00GK1762487SQ20041006726
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月19日 優先權日2004年10月19日
發明者韓慶惠, 李連會 申請人:上海新藥研究開發中心, 韓慶惠