一對檢測弓形蟲dna的引物及其製備的製作方法
2023-05-18 16:08:21
專利名稱：一對檢測弓形蟲dna的引物及其製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及一對能檢測弓形蟲DNA的寡核苷酸引物及其製備，屬生物化學試劑製備的技術領域。
弓形蟲是一種廣泛存在於人和動物體內的、致弓形蟲病的寄生原蟲，能使多種臟器和組織受損。孕婦患弓形蟲病，可造成胎兒畸形、神經系統發育障礙或死亡。在約5%的愛滋病例中，弓形蟲病是人免疫缺陷病毒感染的首要指徵。弓形蟲病是全球性人畜共患病，全世界約有5億人感染此病。快速檢測弓形蟲感染成為醫學界普遍關注的研究課題。已有的檢測弓形蟲感染的方法是在被測樣品中加入一對能檢測弓形蟲DNA的引物，通過多聚酶鏈反應(PCR)進行，因擴增，從而快速而準確地檢測出被測樣品是否受到弓形蟲的感染。如BurgJL等人在題為′用PCR直接而靈敏地檢測致病原蟲，弓形蟲(Directandsensitivedetectionofapathogenicprotozoan，Toxoplasmagondii，bypolymerasechainreaction.J.Clin.，Microbial，1989，27(8)，1787-1792)′一文中提及他們製備的一對能檢測弓形蟲DNA的引物，用於PCR，經3.5-6小時體外擴增，擴增產物經點雜交，再經放射自顯影17小時，最終可測出1個弓形蟲蟲體的裂解液。又如，SavvaD等人在題為′用PCR檢測弓形蟲(PolymerasechainreactionfordetectionofToxoplasmagondii.J.Med.，Micvobial，1990，32(1)，25-31)′一文中提及他們製備的一對能檢測弓形蟲DNA的引物，用於PCR，經體外擴增2.5小時，擴增產物經電泳檢測，可測出10pg弓形蟲DNA，若對擴增產物進行Southern印跡分析和放射自顯影，最終可測出0.5pg弓形蟲DNA。以上二種弓形蟲感染檢測方法的缺點是費時多，至少需2～3天才能得到結果。
本發明的目的是提供一對能快速檢測弓形蟲DNA的寡核苷酸引物及其製備。
圖1是美國AppliedBiosystems公司出品的381ADNA合成儀的外形示意圖，其中1～10是試劑並，11是電源插頭，12是電源開關，13是控制面板，14是鍵盤，15是顯示屏，16是機殼，17是散熱孔，18是反應柱，19是引物收集管，20是主程序按鈕。
本發明人對弓形蟲特異DNA片段的診斷基因的DNA順序進行了分析，該DNA順序為，1GTAGCATCATTTCACCAATCprimer1#▲21CCCCTTTGAGTCAGCTAGGGAlu
41GATTTGCAAGGGCAAGTGTC61CTCGGCCCACTCTGCCGCAC81ATGTTGTCAGAAAAACGCTT101TCGTTATGGAGTTCTGACGG121AGGCCATGACATCCATCTCC141ACGTTCGCGCGCCTTGTTCT161GTTTCTAGTGGAGTCGCTTT181CGCCTCGTCCTCTGTGTACCprimer2#201CCTCTCGATTTTTCATCGTT
221TCGCGCGCCCGTTCCCCGTC241GCACATCTGCTC其中A、G、C和T分別表示脫氧嘌呤核苷酸殘基、脫氧鳥嘌呤核苷酸殘基、脫氧胞嘧啶核苷酸殘基和脫氧胸腺嘧啶核苷酸殘基。參照上列DNA順序，自行設計並用DNA合成儀製備了若干對寡核苷酸引物，通過大量實驗，從弓形蟲DNA檢測特異性、靈敏度和快速性三個方面，對上列諸對寡核苷酸引物進行全面的考察和鑑定，從中選出性能最佳的一對，其引物順序為，引物1＃5′GTAGCATCATTTCACCAAT 3 ′ 19mer引物2#5′ GTACACAGAGGACGAGGCGA 3′ 20mer與上述弓形蟲特異DNA片段的診斷基因的DNA順序對比可知，引物1＃和2＃的順序分別位於該基因的核苷酸1～19和180～199的互補鏈。
本發明涉及的一對能檢測弓形蟲DNA的寡核苷酸引物是利用美國AppliedBiosystems公司出品的381A型DNA合成儀製備的，對照圖1，製備步驟可說明如下1.接通電源。把電源插頭11插入交流市電插孔，381A型DNA合成儀內的微機因得到供電而工作。
2.裝注原料。把作為原料的試劑脫氧腺苷二異丙基亞磷醯胺、脫氧鳥苷二異丙基亞磷醯胺、脫氧胞苷二異丙基亞磷醯胺、脫氧胸苷二異丙基亞磷醯胺、TCA(三氯醋酸)、I2(碘)、四唑、DMAP(二甲基氨基吡啶)、乙酸酐和乙腈分別注入，並注滿試劑並1～10。試劑並1～10的容量均為25毫升。上列10種試劑均為美國AppliedBiosystems公司的產品。
3.鍵入引物順序。利用控制面板13上的主程序按鈕20和鍵盤14，鍵入需製備引物的順序。鍵入的順序顯示於顯示屏15。製備引物1＃時，鍵入該引物的順序，即5′GTAGCATCATTTCACCAAT3′;製備引物2＃時，鍵入該引物的順序，即5′GTACACAGAGGACGAGGCGA3′。
4.鍵入反應時間。利用控制面板13上的主程序按鈕20和鍵盤14，鍵入需製備引物的反應時間。鍵入的反應時間(分鐘數)顯示於顯示屏15。每製備1微摩爾數(μmol)的引物1＃或引物2＃，鍵入反應時間應為228分，合3.8小時。
5.接通工作電源，按一下電源開關12，381A型DNA合成儀內的引物合成部分得到供電，在機內微機的控制下，使原料在反應柱18中自動合成所需的引物，引物合成部分工作時會發熱，熱量通過位於機殼16兩側的散熱孔17散出。
6.收集成品。在反應柱18中合成的所需引物(成品)經橡皮管引出，滴入專用來收集成品的引物收集管19。
由於經以上6個步驟只能製備一個引物，所以一對能檢測弓形蟲DNA的寡核苷酸引物需要分2次製備。
與已有技術相比，本發明涉及的一對能檢測弓形蟲DNA的寡核苷酸引物，用於檢測弓形蟲感染時，PCR擴增耗時較少，僅需2.7小時，加上其他操作，能在1天內測出結果。而使用已有的引物對檢測弓形蟲感染時，至少需2～3天才能測出結果。所以，本發明涉及的一對引物能靈敏而快速地檢驗出弓形蟲感染。
本發明為生物化學試劑製備領域提供了一種能製備一對檢測弓形蟲DNA的寡核苷酸引物的方法。該對引物可用於人畜弓形蟲病早期診斷、治療和預防，也可用於孕婦產前檢查，防止產生先天性弓形蟲病，還可用於愛滋病患者並發感染弓形蟲病的診斷，對優生優育和人畜弓形蟲病的防治具有重要的意義，所以，本發明在醫學、農業及畜牧業方面有廣泛的應用前景。
權利要求
1.一種用DNA合成儀製備一對能快速檢測弓形蟲DNA的寡核苷酸引物的方法，製備步驟包括設計引物順序、接通電源、裝注原料、鍵入引物順序、鍵入反應時間、接通工作電源和收集成品7步，其特徵在於在鍵入引物順序步驟中鍵入的引物順序為在設計引物順序步驟中找到的引物1#或引物2#的引物順序，即5′GTAGCATCATTT CACCAAT3′19mer或5′GTACACAGAGGACGAGGCGA3′20mer，一對引物分2次合成，每次合成一個引物，引物1#和引物2#的引物順序分別為5′GTAGCATCATTTCACCAAT3′19mer和5′GTACACAGAGGACGAGGCGA3′20mer，分別位於順序為1 (GTAGCATCAT TTCACCAATC)/(primer 1#)Δ21 CCCCTTTGAG TCAGCTAGGGAJul41 GATTTGCAAG GGCAAGTGTC61 CTCGGCCCAC TCTGCCGCAC81 ATGTTGTCAG AAAAACGCTT101 TCGTTATGGA GTTCTGACGG121 AGGCCATGAC ATCCATCTCC141 ACGTTCGCGC GCCTTGTTCT161 GTTTCTAGTG GAGTCGCTTT181 (GTAGCATCAT TTCACCAATC)/(primer 1#)201 CCTCTCGATT TTTCATCGTT221 TCGCGCGCCC GTTCCCCGTC241 GCACATCTGC TC的弓形蟲特異DNA片段的診斷基因的核苷酸1～19和180～199的互補鏈；在鍵入反應時間步驟中製備1微摩爾數(μmol)的引物1#和引物2#所對應的鍵入反應時間應均為228分，即3.8小時。
全文摘要
本發明涉及一對能檢測弓形蟲DNA的寡核苷酸引物及其製備，屬生物化學試劑製備的技術領域。該對引物有弓形蟲檢測特異性好、靈敏度高和速度快的優點，對人畜弓形蟲病的防治具有重要的意義。本發明在醫學、農業和畜牧業方面有廣泛的應用前景。
文檔編號C12P19/34GK1071459SQ9110750
公開日1993年4月28日 申請日期1991年10月4日 優先權日1991年10月4日
發明者陳詩書, 夏愛娣 申請人:上海第二醫科大學