合浦珠母貝外套膜外上皮細胞的分離方法
2023-05-17 21:32:31 1
專利名稱：合浦珠母貝外套膜外上皮細胞的分離方法
技術領域：
本發明涉及組織細胞培養分離技術，具體地說是從一種珍珠貝——合浦珠母貝原代培養 的組織塊遷出細胞中分離單一類型細胞的技術。
背景技術：
合浦珠母貝(/^cto由/wcaf"MartenssO，又稱馬氏珠母貝，屬於軟體動物門(Mollusca)， 瓣鰓綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，珍珠貝科(Pteriidae)，珠母貝屬(Pinctada)，主 要分布在我國沿海，是目前世界上用於海水珍珠生產的主要貝類。近年來，由於全球氣候變 化的影響，以及養殖貝類經濟目的導致珍珠貝的質量和珍珠的品質下降。進行合浦珠母貝組 織細胞的培養及其分離對珍珠貝的質量和珍珠的品質有重要意義。
由於合浦珠母貝原代細胞培養過程中遷出的細胞較多，不利於細胞的分離培養和單一細 胞群性質的分析。目前，對合浦珠母貝組織細胞分離純化的研究非常少，相關技術比較薄弱。
發明內容
本發明旨在提供一種從合浦珠母貝原代培養的組織塊遷出細胞中分離單一類型細胞的方法。
本發明提出的合浦珠母貝外套膜外上皮細胞的分離方法，其特徵在於，所述方法含有以
下步驟
(1) 配製細胞分離液梯度溶液在離心管中，將9份細胞分離液原液與1份無鈣鎂離子 的組織清洗液混合，得到100%細胞分離液溶液；將100%細胞分離液溶液與無鈣鎂離子的組 織清洗液溶液以不同比例混合，製備所需的不同濃度和不同體積的細胞分離液梯度液；
(2) 製備梯度層取離心管，預先用牛血清白蛋白溶液浸泡管壁，傾去牛血清白蛋白溶 液，加入上述細胞分離液梯度液製備梯度管；將濃度漸減的細胞分離液梯度液從離心管底部 輕輕地逐層鋪；
(3) 加入細胞懸液用毛細管將待分離細胞懸液鋪至梯度管中最輕地細胞分離液溶液之
上；
(4) 細胞分離離心後取出離心管，將各梯度層之間界面上的細胞分部收集於離心管中， 加入無鈣鎂離子的組織清洗液溶液，離心，棄上清，加入無鈣鎂離子的組織清洗液溶液洗滌， 重新懸浮後計數細胞。在上述的分離方法中，步驟(1)和(4)所述無鈣鎂離子的組織清洗液溶液，其配方是: NaCl 26.22 g/L, KC1 1.08 g/L,, NaHC03 0.35g/L， Na2HP04 0.09g/L， KH2P04 0.06g/L, MilliQ水， 調整PH為7.2-7.4，無菌過濾後使用。
在上述的分離方法中，步驟(2)所述牛血清白蛋白溶液，其配方是將牛血清白蛋白加 入到100毫升磷酸鹽緩衝(PBS)溶液中，待充分溶解後使用。
本發明有如下優點-
1. 本發明能從原代培養的組織塊中遷出的細胞中分離出單一類型的細胞群。在一定得梯 度層內能得到單一類型細胞，可以避免細胞碎片以及較大的細胞混合團的汙染。
2. 對細胞損傷較小，能最大限度地保持細胞的活力，分離後的細胞還能繼續培養。分離 後的細胞可以進行生理生化等後續研究。
3. 易於操作。無需特殊設備，成本較低。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。 實施例:外套膜外上皮細胞細胞分離
(1) 配製Percoll梯度溶液在離心管中，將9份Percoll原液與1份D-MBSS混合，即得 到100%Percoll溶液。將100%Percoll原液與D-MBSS溶液以不同比例混合，配製15%、 30%、 36%的Percoll梯度液。
(2) 製備梯度層取離心管，預先用1MBSA溶液浸泡管壁一段時間，傾去BSA溶液，有 注射器由下至上加入上述36%、 30%、 15%的Percoll梯度液製備梯度管。
(3) 加入細胞懸液用毛細管將2ml待分離細胞懸液(含約5><107個細胞)輕輕鋪至梯度 管中15%的Percoll溶液之上，在室溫下以1000 rpm/min離心5 min，繼續以2000 rpm/min離心15 min。
(4) 細胞分離取出離心管，用毛細吸管將36%和30%界面上的細胞收集於離心管中，加 入3倍體積的D-MBSS溶液，1500 rpm/min離心10 min，棄上清，加入D-MBSS溶液 洗滌2次，重新懸浮後計數細胞。
(5) 進行細胞鑑定或者其他研究。.
權利要求
1、合浦珠母貝外套膜外上皮細胞的分離方法，其特徵在於，所述方法含有以下步驟(1)配製細胞分離液梯度溶液在離心管中，將9份細胞分離液原液與1份無鈣鎂離子的組織清洗液混合，得到100％細胞分離液溶液；將100％細胞分離液溶液與無鈣鎂離子的組織清洗液溶液以不同比例混合，製備所需的不同濃度和不同體積的細胞分離液梯度液；(2)製備梯度層取離心管，預先用牛血清白蛋白溶液浸泡管壁，傾去牛血清白蛋白溶液，加入上述細胞分離液梯度液製備梯度管；將濃度漸減的細胞分離液梯度液從離心管底部輕輕地逐層鋪；(3)加入細胞懸液用毛細管將待分離細胞懸液鋪至梯度管中最輕地細胞分離液溶液之上；(4)細胞分離離心後取出離心管，將各梯度層之間界面上的細胞分部收集於離心管中，加入無鈣鎂離子的組織清洗液溶液，離心，棄上清，加入無鈣鎂離子的組織清洗液溶液洗滌，重新懸浮後計數細胞。
2、 按照權利要求1所述的分離方法，其特徵在於步驟(1)和(4)所述無鈣鎂離子的 組織清洗液溶液，其配方是NaCl 26.22 g/L, KC11.08 g/L,, NaHC03 0.35g/L， Na2HP04 0.09g/L, KH2P04 0.06g/L， MilliQ水，調整pH為7.2-7.4，無菌過濾後使用。
3、 按照權利要求1所述分離方法，其特徵在於步驟(2)所述牛血清白蛋白溶液，其 配方是將牛血清白蛋白加入到100毫升磷酸鹽緩衝(PBS)溶液中，待充分溶解後使用。
全文摘要
本發明涉及合浦珠母貝外套膜外上皮細胞的分離方法，屬於組織細胞培養分離技術領域。主要包括以下幾個步驟(1)配製Percoll梯度溶液將9份Percoll原液與1份D-MBSS混合，得到100％Percoll溶液；將100％Percoll原液與D-MBSS溶液以不同比例混合，得到Percoll梯度液；(2)製備梯度層預先用BSA溶液浸泡離心管管壁，然後製備梯度管。(3)加入細胞懸液將待分離細胞懸液加入到梯度管中。(4)細胞分離離心後，取出細胞，洗滌，重懸。本發明能從原代培養的組織塊中遷出的細胞中分離出單一類型的細胞群，對細胞損傷較小，能最大限度地保持細胞的活力，分離後的細胞還能繼續培養，易於操作。
文檔編號C12N5/06GK101608173SQ20091008769
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者上官俊龍, 劉曉軍, 周玉娟, 張榮慶, 琪 李, 謝莉萍 申請人:清華大學