測定飼料中25－羥基膽鈣化醇的方法
2023-12-05 19:59:41 1
專利名稱：測定飼料中25－羥基膽鈣化醇的方法
技術領域：
本發明涉及定量測定動物飼料中25-羥基膽鈣化醇(25-羥基維生素D3)的方法。25-羥基膽鈣化醇可作為Hy-DTM(ROCHE VITAMINS AG，Basel，Switzerland)購得，其用作動物飼料的添加劑以改善動物(例如家畜和寵物)的健康狀況。考慮到其生理藥力以及狹窄的治療窗口，該化合物的劑量是十分關鍵的，因此需要可靠的分析手段來監測飼料中該化合物的量及其在飼料中的均勻分布。現有技術描述了各種定量測定血漿中25-羥基膽鈣化醇的方法，這些方法基於免疫測定技術(參見W099/67211)或基於使用衍生物或同位素作為內標的HPLC/質譜法(參見Biological Pharmaceutical Bulletin(2001)，24(7)，738-743)。然而，當用於分析飼料樣品時，這些已知方法並不能令人滿意。
已有方法均已表明，對飼料樣品中的25-羥基膽鈣化醇進行分析是困難的，原因在於飼料中存在大量的固態化學物質和生物物質，而血漿則主要由水組成。兩類方法是可用的。使用HPLC和UV檢測的物理化學方法以及使用樣品淨化HPLC和放射性標記免疫試劑的免疫化學方法(參見Bruce.W.Hollis，Calcif.Tissue Int.(1996)584-5)。另一方法也是費力的並包括分析步驟，其為了定量而使用放射性材料。此方法由以下步驟組成添加3H-25-羥基膽鈣化醇作為內標，用甲醇萃取，在反相SEP-PAK柱上淨化樣品，在正相SEP-PAK柱上進一步淨化，在正相HPLC及最終內部分析反相HPLC上進一步淨化。通過閃爍計數3H-25-羥基膽鈣化醇來確定總回收率。通過外標法及264nm處的UV檢測來進行定量化。由於最終定量是通過UV完成的，因此樣品淨化過程十分費力。如此複雜的萃取液純化要求回收率的確定通過使用放射性標記25-羥基膽鈣化醇來完成。這兩類方法都十分繁瑣，操作特性不良且重現性差。
本發明提供了一種新的多步驟但簡單的定量測定25-羥基膽鈣化醇的方法，該方法可用於動物飼料樣品且能得到滿意結果。
更具體地，本發明涉及定量測定動物飼料中25-羥基膽鈣化醇的方法，該方法包括步驟a)將飼料樣品分散於水中並向該樣品中添加定量的內標化合物，該內標化合物的質量不同於25-羥基膽鈣化醇且其極性近似但不同於25-羥基膽鈣化醇；b)用叔丁基甲醚萃取該水分散液；c)將醚萃取液進行半製備HPLC；d)收集含25-羥基膽鈣化醇和內標化合物的級分(fraction)；e)將d)中收集的級分或其一部分進行與質譜聯用的HPLC；f)測定25-羥基膽鈣化醇以及添加的內標化合物的質譜峰面積；和g)通過計算所測質譜峰面積來計算25-羥基膽鈣化醇的量。
步驟a)中使用的內標化合物是例如25-羥基膽鈣化醇的異構體或衍生物或其同位素標記物(例如氘標記同位素)，例如26，27-六氘-25-羥基膽鈣化醇(Tetrahedron Lett.Vol.32，No.24，2813-2816(1991))；或25-羥基麥角鈣化醇，或1α-羥基膽鈣化醇。優選的內標化合物是26，27-六氘-25-羥基膽鈣化醇。內標化合物適宜在飼料樣品在水中分散或溶解之前以在甲醇中的溶液形式添加。添加的內標化合物的量並不十分關鍵。適宜地，添加的內標化合物的量可提供基於25-羥基膽鈣化醇約0.05m至約等摩爾的濃度。然後，在步驟b)中將飼料樣品的水分散液或溶液用約1-10倍量的叔丁基甲醚萃取，優選伴以超聲波處理。通過從步驟b)得到的萃取液蒸發出有機溶劑來完成步驟c)的半製備HPLC，適宜地在排除氧的條件下在矽膠上進行，使用非極性溶劑例如脂族C5-C8烴，例如異辛烷或這樣的溶劑與其它極性溶劑的混合物，極性溶劑例如是低級烷醇(例如異丙醇)和/或酯(例如乙酸乙酯)。優選的半製備HPLC體系是矽膠以及體積比約為1∶10∶89的異丙醇、乙酸乙酯和異辛烷混合物。根據步驟e)的HPLC分析適宜在非極性固定相(例如改性的矽膠)的柱上用極性溶劑(例如水或低級烷醇)進行。本文所用術語「改性矽膠」表示反相矽膠，例如以C18烴片斷醚化的矽膠，例如由Thermo Hypersil-Keystone，Runcom，UK提供的Aquasil C18。
根據步驟g)的質譜測定的樣品中25-羥基膽鈣化醇的量由下列方程計算 其中，RF＝響應因子；RRF＝相對響應因子；ISD＝內標溶液；HD＝25-羥基膽鈣化醇；c＝濃度[ng/ml]。
用25-羥基膽鈣化醇和26，27-六氘-25-羥基膽鈣化醇在甲醇∶水(70∶30)溶液中的濃度均為約5ng/ml的溶液來確定相對響應因子(RRF)。
通過以下實施例進一步描述本發明。
實施例A.萃取稱量10g飼料樣品(包含28.6％大豆、3％魚粉、2％大豆油、57.3％玉米、2％玉米澱粉、2％木素磺化鹽、3.1％大米、2％礦物混合料的混合物)置於錐形瓶中。向其中添加約500ng 26，27-六氘-25-羥基膽鈣化醇(0.01ml的2.5mg 26，27-六氘-25-羥基膽鈣化醇在50ml甲醇中的溶液)和60ml水，將所得漿液在50℃下在超聲波中處理10分鐘。然後，添加40ml叔丁基甲醚，將混合物劇烈振蕩5分鐘，再超聲波處理5分鐘並離心。分離出10ml有機上層清液並在排除氧的條件下蒸發。
B.半製備HPLC將殘餘物溶解於2ml的異丙醇∶乙酸乙酯∶異辛烷(1∶10∶89)的流動相中，離心處理，並將上層清液的100μl部分注射入半製備HPLC柱，該柱為Hypersil Si60，3μm，120，150×4.6mm(Shandon)。流率為1.0ml/min。收集14-16分鐘之間的級分(通過在開始前注射混合標準溶液來檢驗級分分離)，在50℃下在氮蒸汽中蒸發。使用超聲波浴使殘餘物溶解於0.7ml甲醇中。然後，添加0.3ml水，之後將該溶液注射入與質譜聯用的分析HPLC柱中。
C.分析HPLC通過與質量比檢測器聯用的色譜系統來進行分析HPLC。質量比檢測器之前的色譜系統由捕集柱(其上濃縮待測定物質)以及用於分離的分析柱組成。
裝置示意圖見圖4。在圖4中，「TC」代表捕集柱，「AC」代表分析柱，「MSD」代表質量比檢測器。「A」和「B」表示不同操作模式下色譜流動相的容器(receptacle)。
在捕集柱(TC)中，固定相為Aquasil C18，3μm，2.0×10mm。在分析柱(AC)中，固定相為Aquasil C18，3μm，3.0×150mm。流動相為水(含0.05％HCOOH)和甲醇/水(含0.05％HCOOH)梯度溶液。該系統的工作參數如下流率泵10.6ml/min泵20.7ml/min注射體積90μl注射器溫度5℃柱溫40℃停留時間約4min色譜法根據下表1所示的方式進行表1
1)＞＝梯度(流動相組成的變化)質量比檢測器(MSD)的參數如下檢測器Agilent 1946C LC/MSD SL單四極質量比檢測器離子化技術APCI(大氣壓化學離子化)捕獲方式SIM(選擇性離子監測)極性正噴射與乾燥氣體99.999％的氮氣(質量N50)乾燥氣體流量9.5L/min噴霧器氣體壓力50psig乾燥氣體溫度225℃蒸發器溫度250℃毛細管電壓3000V(Vcap＝離子化電壓)電暈電流10μA增益1.5SIM參數
使用上述裝置及操作方式，分析標準溶液、空白飼料樣品(不含25-羥基膽鈣化醇)和普通飼料樣品。標準溶液如下製備1.25-羥基膽鈣化醇將2.5mg 25-羥基維生素D3溶於50ml甲醇。用甲醇稀釋2ml該溶液至200ml以得到濃度為500ng/ml的溶液。
2.d6-25-羥基膽鈣化醇(內標)將2.5mg d6-25-羥基膽鈣化醇溶於50ml甲醇。用甲醇稀釋2ml該溶液至200ml以得到濃度為500ng/ml的溶液。
3.用甲醇∶水(70∶30)將25-羥基膽鈣化醇溶液(1中)與d6-25-羥基膽鈣化醇溶液(2中)各1ml稀釋至100ml，得到羥基化膽鈣化醇濃度為5ng/ml的溶液。
用上面A中所述類似的方法分析空白飼料樣品。
標準溶液、空白飼料樣品和普通飼料樣品的萃取離子色譜圖如
圖1-3所示。通過前面給出的方程計算25-羥基膽鈣化醇的量。
權利要求
1.定量測定動物飼料中25-羥基膽鈣化醇的方法，所述方法包括步驟a)將飼料樣品分散於水中並向該樣品中添加定量的內標化合物，所述內標化合物的質量不同於25-羥基膽鈣化醇且其極性近似但不同於25-羥基膽鈣化醇；b)用叔丁基甲醚萃取該水分散液；c)將醚萃取液進行半製備HPLC；d)收集含25-羥基膽鈣化醇和內標化合物的級分；e)將d)中收集的級分或其一部分進行與質譜聯用的HPLC；f)測定25-羥基膽鈣化醇以及添加的內標化合物的質譜峰面積；和g)通過計算所測質譜峰面積來計算25-羥基膽鈣化醇的量。
2.如權利要求1的方法，其中所述內標化合物為26，27-六氘-25-羥基膽鈣化醇、25-羥基麥角鈣化醇或1α-羥基膽鈣化醇。
3.如權利要求2的方法，其中所述內標化合物為26，27-六氘-25-羥基膽鈣化醇。
4.如權利要求1-3中任何一項的方法，其中所述半製備HPLC在作為固定相的矽膠及作為流動相的異丙醇、乙酸乙酯、異辛烷混合物上進行。
5.如權利要求4的方法，其中所述流動相為體積比1∶10∶89的異丙醇、乙酸乙酯與異辛烷。
6.如權利要求4或5的方法，其中所述固定相為3μm的Hypersil Si60。
7.如權利要求1-6中任何一項的方法，其中所述分析HPLC是在包括其上濃縮待測定物質的捕集柱和用於分離的分析柱的色譜系統中進行的。
8.如權利要求4的方法，其中所述分析HPLC中的固定相為改性矽膠，例如3μm的Aquasil C18。
9.如權利要求7或8的方法，其中所述流動相為含0.05vol％蟻酸的水和含0.05vol％蟻酸的甲醇的梯度溶液。
全文摘要
本發明描述了定量測定動物飼料中25－羥基膽鈣化醇的方法。該方法如說明書所述包括步驟向飼料的水分散液中添加定量的質量不同於25－羥基膽鈣化醇且極性近似該化合物的內標化合物，例如26，27－六氘－25－羥基膽鈣化醇；用叔丁基甲醚萃取該水分散液；以及用HPLC和質譜對萃取液進一步處理。
文檔編號G01N33/82GK1890568SQ200480036788
公開日2007年1月3日 申請日期2004年11月26日 優先權日2003年12月9日
發明者勞倫特·德努, 理察·戈斯勒, 彼得·霍夫曼 申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司