檢測大腸癌血清蛋白質的質譜模型及其構建方法
2023-05-15 02:27:46 2
專利名稱：檢測大腸癌血清蛋白質的質譜模型及其構建方法
技術領域：
本發明涉及惡性腫瘤檢測領域，為一種新的非侵入性的檢測方法，在體外對大腸癌進行早期發現，早期檢測，其敏感性和特異性均達到90％以上。
表面-增強雷射解吸-電離(SELDI)根本的原理是通過使用特異的探針表面俘獲蛋白質表面-增強親合力，是最近兩年才發展起來的一種新的蛋白組學的研究方法。SELDI可以克服二維凝膠電泳存在的內在問題，包括疏水性問題、強酸性、強鹼性的蛋白質的分離、膜蛋白的分離問題、低分子量檢測的靈敏性、低豐度蛋白質的靈敏性問題。蛋白質只要與SELDI蛋白質晶片陣列結合，就可通過電離-解吸飛行時間-質譜儀檢測，並根據蛋白質的質量和電荷比(m/z)每一個蛋白質的峰值明顯地分離並形成一個蛋白質(保留在晶片上的蛋白質)的圖譜。
目前，在非侵入性大腸癌的診斷中常有以下幾種方法①糞便潛血試驗，糞便潛血是最為常見的大腸癌早期指徵之一，但僅有50％的大腸癌和30％腺瘤隱血試驗陽性，假陰性太多，為此不少學者致力於改進隱血試驗的方法，如愈創木脂法，免疫隱血試劑法等。其特異性雖然提高了，但敏感性卻降低，且費用也增加了。②糞便生化與免疫學試驗，應用免疫膠乳清蛋白試劑盒檢測糞便中高於正常量的清蛋白，對隱血陰性的大腸癌的檢測起到補充的作用，但其在大腸癌中的陽性率為55.4％，腺瘤為27.1％。此外，大腸癌患者糞便中的促腐因子，各種腫瘤伴隨抗原和腫瘤相關產物的檢測，在大腸癌早期診斷中也起到一定的幫助。③糞便中癌基因的檢測，Doolittle等發現在46-50％的大腸癌病人的糞便中檢測到K-Ras基因的突變。Dong等在大腸癌病人的糞便中對TP53，BAT26，and K-Ras基因進行檢測也發現有71％的大腸癌中同時發生突變。④血液中腫瘤標記物的檢測，Barillari等88例大腸癌患者的血清進行了CEA，TPA and CA 19-9的檢測，發現它們的敏感性和特異性分別為72％、62％、38％和78％、86％、97％。Nicolini等對90例大腸癌病人的血清進行CEA，TPA，GICA，CA 72.4，和CA 195的檢測，同樣發現他們的敏感性與特異性仍徘徊在50-70％之間。⑤血液中癌基因的檢測，Hibi等發現在44例大腸癌病人的血清中檢測到22例有K-Ras或p53基因的微衛星不穩定性。Salbe等也在35例病人中的血清中發現40％的病人有K-Ras基因的突變。Lauschke等的研究也證實在病人的血清中可檢測到K-Ras和APC基因的突變。可見大腸癌早期診斷的方法很多，但均存在特異性與敏感性之間的矛盾，假陽性率和假陰性率高的問題。這也是困擾我們對大腸癌進行早期診斷的最重要的問題。
本發明提供的模型由人血清蛋白質質譜、質譜儀及人工神經網絡分析組成。
本發明提供的人血清蛋白質質譜由四個質荷比(M/Z)位於5910±15Da，8930±15Da，4476±15Da和8817±15Da的蛋白質(包括磷酸化，甲基化，乙醯基化修飾前或修飾後)所組成。
本發明的第二個目的是提供這種質譜模型的構建方法，包括①血清準備，②質譜數據的收集，③質譜數據的人工神經網絡分析。
本發明提供的質譜模型的構建方法，血清準備包括白蛋白親和樹脂CibacronBlue 3GA(Sigma)，以1％CHAPS作為去垢劑，20mM HEPES的緩衝液，採用H4蛋白質晶片(Ciphergen)。
本發明提供的質譜模型的構建方法，質譜儀採用表面-增強雷射解吸-電離-飛行時間-質譜儀(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry SELDI-TOF-MS)進行質譜數據收集，其中雷射強度為130，檢測敏感性為6。
本發明提供的質譜模型的構建方法，採用反向傳播(BP)人工神經網絡的方法進行質譜數據的分析。
本發明與其他非侵入性大腸癌的診斷方法比較具有以下優點(1)本發明提供的質譜模型，為早期診斷大腸癌提供了新的途徑和方法，並為進一步發現新的腫瘤標記物提供了基礎。(2)與以往的傳統的非侵入性方法比較具有極高的特異性與敏感性，其敏感性與特異性均達到90％以上，是一種在蛋白質組學水平上的診斷，對大腸癌的早期發現，早期診斷提供了新的方法與標準。(3)本發明模型的構建方法設計合理，可行，是為降低我國大腸癌的病死率、提高大腸癌的治癒率、進一步篩查大腸癌提供了一種新的方法。
圖2為部分健康人與大腸癌血清的蛋白質質譜圖。
圖3為質荷比(M/Z)位於(A)5910Da，(B)8930Da，(C)4476Da和(D)8817Da的部分健康人與大腸癌血清的蛋白質質譜圖。
圖4為人工神經網絡訓練圖。
圖5為人工神經網絡訓練參數設置。
實施例1 本發明的一種檢測大腸癌血清蛋白質的質譜模型及構建方法1、技術路線血清標本在冰浴中解凍後3000rpm離心5分鐘，取10ul加入90ul0.5％CHAPS(pH7.4)溶液中充分混勻(10分鐘)，白蛋白親和樹脂(Cibacron Blue3GA(Sigma))預先用0.5％CHAPS平衡3次×5分鐘，將Cibacron Blue 3GA與血清樣本在4℃搖床上60分鐘，12000rpm離心5分鐘(4℃)，取上清溶液40ul。H4晶片(Ciphergen)預先用20mM HEPES(pH7.4)平衡2次×5分鐘，將去除白蛋白後的血清標本用20mM HEPES(pH7.4)稀釋至200ul，加至96孔的Bioprocessor(Ciphergen)，振蕩平臺上振蕩60分鐘。甩去血清標本，20mM HEPES(pH7.4)200ul清洗晶片3次×5分鐘，再用去離子水清洗晶片2次×1分鐘，乾燥後加入0.5ul CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)×2次。上機檢測。
2、數據收集與處理應用PBS-II SELDI質譜儀(Ciphergen)，分析軟體為Proteinchip Software3.0版。設定雷射強度為150，靈敏度為6，收集數據的範圍為1000-200000，收集位置從20-80，平均每點收集20次，收集總點數為140次。在收集每次實驗數據前用標準蛋白晶片校正分子量。
所有原始數據先用Proteinchip Software 3.0做校正(總離子強度及分子量的均一化)。先對訓練組的2k-20k的峰值，用Proteinchip Software 3.0的biomark wizard過濾噪音，設置初始的噪音過濾值為5，第二次的噪音過濾值為2，以10％為最小閾值聚類共產生多個分子量的質譜圖。然後用相同方法獲取測試組的多個相同分子量的質譜圖。
3、網絡參數的優化對訓練集用這多個變量建立一個神經網絡。神經網絡採用反向傳播算法(用共軛梯度學習函數改進Trainscg)。具體設置為共有4層，輸入輸出層，和兩個隱含層，每個隱含層有20個神經元。每一層都採用正切S形傳遞函數(Tansig)。隨機初始化。輸出神經元為1個，對應健康人和大腸癌患者的期望輸出值，分別設為-1和1。首先對訓練標本進行人工神經網絡訓練，得出一個模型，對模型進行檢驗，並利用此模型對未知血清進行盲法分析。
實施例2 部分實例1、樣本與儀器147例血清標本，其中55例大腸癌的血清標本均來自浙江大學醫學院附屬第二醫院腫瘤科，92例健康人的血清標本取自經本院體檢的健康人群。55例大腸癌均經術後病理報告確定，其中Dukes A8例；Dukes B20例；Dukes C15例；Dukes D12例。其中男性35例，女性20例，平均年齡57.6歲(31-84歲)。92例健康人均經常規體檢項目確定健康的人群，以年齡和性別配對，其中男性60例，女性32例，平均年齡55.3歲(28-78歲)。所有的血清標本均在清晨空腹下抽取，分離血清後儲存於-80℃低溫冰箱中。大腸癌的血清標本須在進行所有治療前留取。147例標本隨機分成訓練組87例，與測試組60例。
PBS-II表面-增強雷射解吸-電離飛行時間-質譜儀(SELDI-TOF)及實驗所需的H4蛋白質晶片由美國Ciphergen公司研製。人工神經網絡軟體採用Matlab的NNTools，預先將數據進行矩陣轉換後輸入NNTools。。
2、技術路線血清標本在冰浴中解凍後3000rpm離心5分鐘，取10ul加入90ul0.5％CHAPS(pH7.4)溶液中充分混勻(10分鐘)，Cibacron Blue 3GA(Sigma)預先用0.5％CHAPS平衡3次×5分鐘，將Cibacron Blue 3GA與血清樣本在4℃搖床上60分鐘，12000rpm離心5分鐘(4℃)，取上清溶液40ul。H4晶片(Ciphergen)預先用20mM HEPES(pH7.4)平衡2次×5分鐘，將去除白蛋白後的血清標本用20mM HEPES(pH7.4)稀釋至200ul，加至96孔的Bioprocessor(Ciphergen)，振蕩平臺上振蕩60分鐘。甩去血清標本，20mM HEPES(pH7.4)200ul清洗晶片3次×5分鐘，再用去離子水清洗晶片2次×1分鐘，乾燥後加入0.5ul CHCA(Ciphergen)×2次。上機檢測。
3、數據收集與處理應用PBS-II SELDI質譜儀(Ciphergen)，分析軟體為Proteinchip Software3.0版。設定雷射強度為150，靈敏度為6，收集數據的範圍為1000-200000，收集位置從20-80，平均每點收集20次，收集總點數為140次。在收集每次實驗數據前用標準蛋白晶片校正分子量。
所有原始數據先用Proteinchip Software 3.0做校正(總離子強度及分子量的均一化)。先對訓練組的2k-20k的峰值，用Proteinchip Sofiware 3.0的biomarkwizard過濾噪音，設置初始的噪音過濾值為5，第二次的噪音過濾值為2，以10％為最小閾值聚類共產生54個分子量的質譜圖。將健康人與大腸癌兩組血清蛋白質質譜數據進行成組資料的多元方差分析(Kruskal-Wallis法)，選擇p值＜0.0000001的四個質荷比(M/Z)位於5910Da，8930Da，4476Da和8817Da的蛋白質作為鑑別大腸癌與健康人血清蛋白質的質譜。
4、網絡參數的優化
對訓練集用這4個變量建立一個神經網絡，參見
圖1。神經網絡採用反向傳播算法(用共軛梯度學習函數改進Trainscg)。具體設置為共有4層，輸入層2、輸出層3，和兩個隱含層3-2、3-2，每個隱含層有20個神經元，有3個連接權重值5、6、7，每一層都採用正切S形傳遞函數(Tansig)。隨機初始化。輸出神經元為1個，對應健康人和大腸癌患者的期望輸出值，分別設為健康人-1和大腸癌1。首先對87例標本進行人工神經網絡訓練，得出一個模型，對模型進行檢驗，並利用此模型對60例未知血清進行盲法分析。
5、盲法分析方法對60例血清標本(包括大腸癌患者與健康人)進行盲法預測，應用相同的技術路線與收集數據的方法，用已確定的聚類模型對60例血清的蛋白質的質譜進行聚類，同樣得到4個分子量的峰值，將數據導出後，進行矩陣轉換，再導入已建立的人工神經網絡模型，輸出預測值。
結果1、血清蛋白質質譜圖所有晶片在PBS-II型SELDI質譜儀(Ciphergen)進行數據的讀取，每個標本均收集140次，共檢測到160個不同質荷比(M/Z)的峰值，所有數據均保存在同一個文件中，部分圖譜參見圖2，在圖2中共有8例樣本，在上方的4例為健康人的血清蛋白質質譜圖，下方的4例為大腸癌患者的。原始數據先用Proteinchip Software 3.0(Ciphergen)做校正(總離子強度及分子量的均一化)。對2k-20k的峰值，用Proteinchip Software 3.0的biomark wizard過濾噪音，設置初始的噪音過濾值為5，第二次的噪音過濾值為2，以10％為最小閾值。聚類共產生54個分子量的峰值圖譜。圖3是將圖2中的質荷比(M/Z)位於5910Da，8930Da，4476Da和8817Da區域放大，圖3A，3B，3C，3D分別是分子量位於5910Da，8930Da，4476Da和8817Da的放大質譜圖，左面為質譜圖，右面為相應的模擬電泳圖。均為4例健康人和4例大腸癌患者的對照。
2、人工神經網絡模型對87例訓練組的血清標本的蛋白質質譜圖數據經矩陣轉換後，輸入MATLAB的NNTools中，進行訓練(訓練結果參見圖4)，經過254次後模型達到我們設定的值(參見圖5)，檢驗模型的誤差低於1×10-8。
將87例血清標本的蛋白質質譜數據用此模型進行檢驗，輸出值為-1和1，-1為健康人，1為大腸癌患者，結果所有大腸癌患者和健康人都被準確地分類，(見表1)。
表1 87例血清標本應用人工神經網絡模型的輸出值樣本 例數 輸出值(1)輸出值(-1) 準確率(％)大腸癌22 22(100％) 0(0％) 100健康人65 0(1％) 65(100％)100總例數87 1003、盲法分析結果60例未知的血清標本應用已確定的方法進行血清蛋白質質譜的測定，對每例血清蛋白質質譜數據導入已建立的人工神經網絡模型中，進行預測，23例大腸癌病人中19例，37例健康人中有34例被準確地預測，結果見表2表260例未知血清標本應用人工神經網絡模型輸出值樣本 例數預測大腸癌(1) 預測健康人(-1)預測率(％)大腸癌23 19(82.6％)4(17.4％)82.6健康人37 3(8.1％) 34(91.9％) 91.9總例數6088.3計算該方法的敏感性為82.6％(19/23)，特異性為91.9％(34/37)。
4、血清CEA的檢測我們同時對147例血清標本進行了CEA的檢測(時間分辨螢光分析技術TRF)，結果得到應用血清CEA檢測大腸癌的敏感性與特異性分別為47.3％和93.5％，敏感性遠遠低於質譜法的結果。
本發明涉及的部分參考文獻(1)、李連弟，魯鳳珠，張思維，等.中國惡性腫瘤死亡率20年變化趨勢和近期預測分析.中華腫瘤雜誌，1997，19(1)3-9(2)、Young GP.Prevention and early detection of colorectal cancer.Landon WB Sounders，1996241-250(3)、Hutchens TW，Yip T-T.Rapid Commun Mass Spectrom 1993；7576-80.
(4)、Merchant M，Weinberger SR.Recent advancements in surfaceenhancedlaser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry.Electrophoresis2000；211164-7(5)、劉希永，鄭樹，陳坤，等大腸癌序貫篩檢方案在人群中應用的前瞻性評估 中華流行病學雜誌，2000，21(6)285-287(6)、李世榮，張採蓮，徐恩迪。糞便序貫隱血與微量白蛋白互補對提高大腸腫瘤篩檢率的價值 中華腫瘤雜誌 1995；17381-383(7)、Hu JY.Wang S，Zhu JG et al.Expression of B7 costimulation moleculesby colorectal cancer cells reduces tumorigenicity and indues anti-tumor immunity.World J Gastroenterol.1999；5147-151(8)、Zhao CH，Jiang CY，Zhang YY et al.Analysis of LDH activities and itsisoenzyme pattems in colorectal cancer tissues.China Nati J New Gastroenterol1997；341-42(9)、Guo WJ，Zhou GD，Wu HJ，et al.Ultrastructural localization of glutathioneS-transferase-pi in human colorectal cancer cells World J Gastroenterol2000；6454-455(10)、馮相才，黃文，周殿元，等用抗人結腸癌單克隆抗體檢測血液和糞便中大腸癌相關抗原的研究 新消化病學雜誌，1995；336-38(11)、餘少平，鄭少金，周洪躍 單克隆抗體人群大腸癌普查意義再探討華人消化雜誌。1998；6(特刊7)498(12)、Doolittle，B.R.；Emanuel，J.；Tuttle，C.Detection of the mutated K-Rasbiomarker in colorectal carcinoma J.Natl.Cancer Inst.2001 70(3)289-301(13)、Dong，S.M.；Traverso，G.；Johnson，C.et al.Detecting colorectal cancer instool with the use of multiple genetic targets J.Natl.Cancer Inst.2001 93(11)858-865(14)、Barillari，P.；Ramacciato，G.；de Angelis，R.et al.The role of CEA，TPAand CA 19-9 in the early detection of recurrent colorectal cancer Int.J.ColorectalDis.1989 4(4)230-233(15)、Nicolini，A.；Caciagli，M.；Zampieri，F.Usefulness of CEA，TPA，GICA，CA72.4，and CA 195 in the Diagnosis of primary colorectal cancer and at its relapseCancer Detect.Prev.1995 19(2)183-195(16)、Hibi，K.；Robinson，C.R.；Booker，S.et al.Molecular detection of geneticalterations in the serum of colorectal cancer patients Cancer Res.1998 58(7)1405-1407(17)、Salbe，C.；Trevisiol，C.；Ferruzzi，E.et al Molecular detection of codon 12K-RAS mutations in circulating DNA from serum of colorectal cancer patientsInt.J.Biol.Markers 2000 15(4)300-307(18)、Lauschke，H.；Caspari，R.；Friedl，W.et al.Detection of APC and k-rasmutations in the serum of patients with colorectal cancer Cancer Detect.Prev.200125(1)55-61
本發明提及的所有文獻都在申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻都被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，本發明是結合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發明的上述內容後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種檢測大腸癌血清蛋白質的質譜模型及其構建方法，其特徵是該模型由人血清蛋白質質譜、質譜儀及人工神經網絡分析組成。
2.如權利要求1所述的檢測大腸癌血清蛋白質的質譜模型，其特徵是該蛋白質的質譜由四個質荷比(M/Z)位於5910±15Da，8930±15Da，4476±15Da和8817±15Da的蛋白質所組成。
3.如權利要求1和2所述的檢測大腸癌血清蛋白質的質譜模型的構建方法，其特徵是①血清準備；②質譜數據的收集；③質譜數據的人工神經網絡分析。
4.如權利要求3所述的質譜模型的構建方法，其特徵是血清準備包括白蛋白親和樹脂Cibacron Blue 3GA(Sigma)，以1％CHAPS作為去垢劑，20mMHEPES的緩衝液，採用H4蛋白質晶片(Ciphergen)。
5.如權利要求3所述的質譜模型的構建方法，其特徵是利用表面-增強雷射解吸-電離-飛行時間-質譜儀進行質譜數據收集，雷射強度為130，檢測敏感性為6，。
6.如權利要求3所述的質譜模型的構建方法，其特徵是採用反向傳播(BP)人工神經網絡的方法進行質譜數據的分析。
7.如權利要求1和2所述的檢測大腸癌血清蛋白質的質譜模型及構建方法，其特徵是該模型可用於大腸癌早期檢測和篩查。
全文摘要
本發明提供為一種對大腸癌進行檢測的非侵入性的新方法——檢測大腸癌血清蛋白質的質譜模型及構建方法。該模型由人血清蛋白質質譜、質譜儀及人工神經網絡分析組成，血清蛋白質的質譜由四個質荷比(M/Z)的蛋白質所組成。其構建方法包括血清準備、質譜數據的收集、質譜數據的人工神經網絡分析。本發明提供的模型能夠對大腸癌進行早期檢測，其敏感性與特異性均達到90％以上，是一種在蛋白質組學水平上的診斷，對大腸癌的早期發現，早期診斷提供了新的方法與標準，從而為降低我國大腸癌的病死率，提高大腸癌的治癒率，並進一步為高危人群篩查大腸癌提供一種新的方法。
文檔編號G01N33/68GK1445533SQ0311676
公開日2003年10月1日 申請日期2003年4月28日 優先權日2003年4月28日
發明者陳益定, 鄭樹, 胡汛, 俞捷凱 申請人:浙江大學醫學院附屬第二醫院