甘藍型油菜小孢子簡化高效培養方法

2023-05-15 03:19:21

專利名稱：甘藍型油菜小孢子簡化高效培養方法
技術領域：
本發明涉及油菜小孢子培養方法，尤其涉及甘藍型油菜小孢子簡化高效培養方法，屬植物新品種培育新方法。
背景技術：
甘藍型油菜是我國主要油料作物，其遺傳育種、基因組學研究、代謝組學研究、種質資源創新、細胞遺傳學研究和分子遺傳學研究十分活躍。油菜小孢子離體培養在上述領域有著十分廣泛的應用。Lichter於1982年利用甘藍型油菜游離小孢子培養獲得再生植株，隨後各國學者對影響油菜小孢子培養及其成苗的諸多因素進行了廣泛的研究，使得油菜小孢子培養技術更為簡化、效率更高、便於操作。我國學者根據我國溫室栽培條件不足、取材主要來自大田的實際情況，研究了大田油菜小孢子培養的制約因素及相關技術，形成了一套有別於國外的甘藍型油菜小孢子培養技術體系。但是，儘管如此，甘藍型油菜小孢子培養技術仍然繁瑣，效率低下，存在進一步簡化和提高效率的要求和餘地。目前甘藍型油菜小孢子培養技術主要來自Lichter的方法，主要包括初花期從主花序和上部一次分枝花序上摘取處於單核晚期的花蕾16個，用75%的酒精進行Imin的表面消毒，再在0. 的升汞中消毒lOmin。用無菌水洗滌3次，在含13%蔗糖的B5液體培養基(含B5大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，pH5. 8)中研磨成勻漿，用40 μ m的尼龍網過濾，濾液經800r/min離心5min，除去上清液，重複3次。加8mL含16%蔗糖和50mg/L 的秋水仙素的NLN液體培養基中，於32°C恆溫培養箱中暗培養2天，使小孢子加倍。將加倍後的小孢子懸浮液經800r/min離心5min，除去上清液。再加8mL含16%蔗糖的NLN液體培養基，將上述小孢子懸浮液分裝於10個直徑9cm的一次性無菌培養皿中，添加NLN液體培養基將培養皿底部覆蓋。密封后將培養皿置於32°C恆溫培養箱中熱激暗培養2天，然後移到25°C恆溫培養箱中暗培養至有肉眼可見的胚狀體出現，轉至搖床繼續培養(40r/min， 25°C，黑暗)至胚狀體長大。之後將胚狀體轉移到含2%蔗糖的B5固體培養基(含B5大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，0.8%瓊脂，pH5.8)的培養瓶中，在2°C低溫生長箱中春化處理10d，再在25°C、16h光照及弱光下光照培養，長大後移栽到大田。從上述的小孢子培養過程可以看出，甘藍型油菜小孢子培養過程繁瑣、複雜、效率低、成本高。尤其是每次取樣折斷整個花序，使得每個單株只能取樣一次，取樣的群體要求較大。對於只有少數種子的材料難以進行小孢子培養，而且由於取樣來自不同的單株，單株間基因型的差別影響利用小孢子培養獲得的DH群體用來研究遺傳規律。而且，為了加快研究進程，我國大部分科研、教學單位在夏季到青海加代進行小孢子培養，胚狀體苗的長途無菌運輸也成為制約油菜小孢子培養成敗的一個因素。針對上述油菜小孢子培養中存在的問題進行研究，簡化培養過程、提高培養效率、 降低培養成本是決定油菜小孢子培養能否推廣普及的關鍵。

發明內容
針對目前甘藍型油菜小孢子培養中存在的問題，本發明在取樣時期、時間、方式、 提取液、培養方法、加倍方法和長途無菌運輸等技術方面分別行了改進，目的是大幅度提高甘藍型油菜小孢子培養效率、簡化培養方法和培養程序、降低培養成本。為實現本發明目的，技術方案如下
1、將取樣時期由過去的初花期提前到現蕾期目前油菜小孢子培養的取樣時間通常在油菜初花後。由於油菜花期升溫快、可供取樣的適合培養時間短，往往造成小孢子的培養時間緊，後期田間大量試驗任務與室內小孢子培養工作重疊。為了增加小孢子培養時間、緩解開花後期田間與室內工作的矛盾，我們改進了取樣時期，將現在的初花後取樣提前到現蕾以後，提前的時間大約9天左右。具體方法為在青海省西寧市青海農科院試驗田，在現蕾期、氣溫在20°C的上午或下午，選取 31005(H155XQva)每個單株上所有2. 8mm 3. 5mm單核靠邊期的花蕾40個，放入裝有碎冰的50mL離心管中，置於冰盒中帶回實驗室。去掉碎冰，將30mL 84消毒液倒入50mL離心管中，蓋上蓋子，滅菌lOmin，其間反覆上下搖晃，使84消毒液與花蕾和管壁充分接觸滅菌。 在超淨工作檯內將滅過菌的花蕾移入另外一個無菌的50mL離心管中，用4°C無菌水洗滌3 次。然後按照小孢子培養程序進行小孢子培養。表1取樣時期對小孢子培養效果的影響
距離群體初花的時間(大)接種花蕾數出胚數山胚率(枚/個)
Days after first flower in No.of No. of obtained Yield of embryos
population bloomed_inoculated buds embryos_(embryo no. /bud)_
-92050625.29
-63083927.99
-340126831.71
O(CK)40136334.08
340131032.76
640103725.94
940115728.93
123576521.87
153046815.60由表1可以看出，在初花前9天(見附


圖1)，取樣培養可以獲得胚狀體，只是可以用來培養的合適大小的花蕾較少，所得的胚狀體較少，但是出賠率較高。隨著時間的推移， 可以用於培養的花蕾增多，出胚率也顯著增加。初花前後一周可用於培養的合適大小的花蕾數量大，出胚率達到最高。初花後15天以後適合培養的花蕾數量急劇下降，出胚率也顯著降低。所以，將小孢子培養的時間提前到現蕾期，不僅可以獲得較為理想的培養效果，而且可以將培養時間增加30%左右，緩解油菜初花期後的用工壓力。2、在一天中氣溫達到20°C左右取樣出胚率最高
多年的油菜小孢子培養實踐表明，取樣時的氣溫對出胚率存在較大的影響。為了提高培養效率，需要探究合適的取樣溫度。我們在一天的上午7點、上午10點、下午14點、 下午17點四個不同的時間取樣，發現出胚率明顯不同。由表2可見，一天中，上午7點取樣沒有得到胚狀體，上午10點和下午17點取樣能夠獲得胚狀體，但出胚率較低。下午14點取樣出胚率最高，培養效果最好。在西寧8月中旬，早上7點的氣溫較低(10°C左右)，下午 14點氣溫可達到20°C左右，上午10點和下午17點氣溫都低於20°C。表2取樣時間對小孢子培養效果的影響
權利要求
1.甘藍型油菜小孢子簡化高效培養方法，包括取樣、培養基提取小孢子、小孢子培養、 胚狀體的長途無菌運輸及胚狀體培養，其特徵在於，對各環節進行了改進，具體如下在甘藍型油菜現蕾期、氣溫20°c時，H155XQva選取每個單株上所有2. 8mm 3. 5mm單核靠邊期的花蕾30-50個，放入裝有碎冰的離心管中；去掉碎冰，將84消毒液倒入離心管中，滅菌，其間反覆上下搖晃；將滅過菌的花蕾，用4°C的無菌水洗滌；倒掉無菌水，在離心管中滴入4°C 的無菌13%蔗糖溶液，快速研磨成勻漿，用尼龍網過濾小孢子至另一無菌離心管中，加4°C 的無菌13%的蔗糖溶液，密封，離心，棄上清液，加含16%蔗糖的NLN液體培養基，將小孢子懸浮液分裝於培養皿中，添加NLN液體培養基將培養皿底部覆蓋，密封；然後將培養皿置於 32°C恆溫培養箱中暗培養至有肉眼可見的胚狀體出現，轉至搖床繼續培養至胚狀體長大； 將胚狀體轉入含2 %蔗糖、B5固體培養基的三角瓶中，或者將胚狀體裝入含13 %蔗糖、B5液體培養基的離心管中，密封，運輸；之後將胚狀體轉移到含2%蔗糖、B5固體培養基的培養瓶中，在2°C低溫生長箱中春化處理10d，再在25°C、16h光照及弱光下光照培養，直至移栽到溫室；等再生苗長至5 10片葉時，將苗子挖出，洗淨，用秋水仙素溶液浸根4-5小時，再將苗子栽於溫室；花期將有花粉的單株套袋，自交獲得DH種子。
2.如權利要求1所述的甘藍型油菜小孢子簡化高效培養方法，其特徵在於，取樣時期提前至蕾期、多次反覆取樣、在環境溫度達到20°C以上時取樣、用蔗糖溶液替代B5培養液作提取液、根據胚狀體的多少選擇適當的長途運輸方式等。
全文摘要
本發明涉及油菜小孢子培養方法，公開了一種甘藍型油菜小孢子簡化高效培養方法，屬植物新品種培育新方法。針對目前甘藍型油菜小孢子培養中存在的問題，在取樣時期、時間、方式、提取液、培養方法、加倍方法和長途無菌運輸等技術方面分別行了改進，使得甘藍型油菜小孢子培養效率大幅度提高，培養方法和培養程序簡化，降低了培養成本，方便推廣和應用。
文檔編號A01H4/00GK102217532SQ201010147898
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月16日 優先權日2010年4月16日
發明者張書芬, 文雁成, 朱家成, 王建平, 趙磊 申請人:河南省農業科學院經濟作物研究所