一種多倍體牛大力品種的培育方法與流程
2023-07-01 16:57:21 3
本發明涉及植物領域，具體而言，涉及一種多倍體牛大力品種的培育方法。
背景技術：
牛大力為豆科植物美麗崖豆藤(millettiaspeciosachamp.)的塊根。又名山蓮藕、大力薯。主產於廣西，分布於廣東、海南以及越南北部，素有南方高麗參之稱，為《廣西中藥材標準》所收載。歸肺、腎經，具有平肝、潤肺，養腎補虛，強筋活絡之功效，中醫臨床用於清肺止咳、滋陰壯陽，風溼骨痛、急慢性肝炎等，飲片年需求量折合鮮品達1200多噸。全國有二十多個製藥企業用於生產治療風溼骨痛、腰肌勞損、婦科炎症、心腦血管疾病等中成藥在全國廣泛應用，原料年需求量折合鮮品達8000多噸。牛大力味甘、性平，補而不燥。長期以來，桂、粵、港、澳、臺地區民間普遍用牛大力煲湯。現代研究發現：牛大力多糖具有增強免疫的作用，且對正常細胞沒有毒副作用；生物鹼和香豆素具有鎮痛、鎮靜、解痙、鎮咳的作用。在開發抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒等健康食品、天然藥物方面有特殊優勢。吸引了多家企業開發飲料、口服液、保健茶、超微粉等產品。
多倍體植株一般具有根、莖、葉、花、果的巨型性，抗逆性強，藥用成分含量高，安全可靠等特性，這正是藥材優質、高產育種所希望達到的目標。利用試管苗進行多倍體誘導，容易控制實驗條件、實驗結果重複性好、工作效率高、減少嵌合體、誘變效果好，變異類型多，選擇餘地大，可以在短期內迅速組培繁育大量純度高、質量好，沒有病蟲害的試管苗，這對提高藥材產量和質量十分有利。
有鑑於此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明的第一目的在於提供一種多倍體牛大力品種的培育方法，所述培育方法採用剛萌發的種子苗作為誘導材料，剛萌發的種子苗分生能力強。秋水仙素可抑制紡錘絲的合成，從而使染色體加倍，二甲基亞碸是滲透型細胞保護劑，起到保護細胞的作用。本發明以特定的濃度的秋水仙素溶液對種子苗浸泡特定的時間，經過從培養後得到的植株中，篩選即可得到多倍體牛大力植株，誘導率在70％-85％之間，得到的多倍體植株性狀優良。
為了實現本發明的上述目的，特採用以下技術方案：
本發明的一個方面涉及一種多倍體牛大力品種的培育方法，所述方法包括以下步驟：
1)培育二倍體牛大力種子，得到牛大力種子苗；
2)選取生長勢強的牛大力苗浸泡在二甲基亞碸混和秋水仙素合溶液中進行多倍體誘導；
3)對誘導後的牛大力苗進行增殖培養；
4)將增殖得到的叢生芽剪成單芽並轉接，進行生根培養，培養得到根莖葉完整的組培苗；
5)篩選所述組培苗，得到多倍體植株。
採用剛萌發的種子苗作為誘導材料，剛萌發的種子苗分生能力強。秋水仙素可抑制紡錘絲的合成，從而使染色體加倍，二甲基亞碸是滲透型細胞保護劑，起到保護細胞的作用。
本發明以特定的濃度的秋水仙素溶液對種子苗浸泡特定的時間，經過從培養後得到的植株中，篩選即可得到多倍體牛大力植株，誘導率高，得到的多倍體植株性狀優良。
優選地，所述步驟1)中，培育種子的具體過程包括，選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，剝去種皮，用升汞消毒處理3-5min，無菌水清洗4-6次，轉接到1/2ms培養基中，暗培養3-8d。
優選地，所述二甲基亞碸的質量百分濃度為0.05-0.15％。
優選地，所述二甲基亞碸的質量百分濃度為0.08-0.12％。
優選地，所述秋水仙素的質量濃度為0.01-0.2％。
優選地，所述秋水仙素的質量濃度為0.05-0.15％。
優選地，所述步驟2)中，浸泡處理的時間為12-72h。
優選地，所述步驟2)中，浸泡處理的溫度為15-20℃。
優選地，所述增殖培養和所述生根培養均在23-27℃的條件下進行。
優選地，所述增殖培養和所述生根培養均在光照強度1300-1700lx的條件下進行，優選地，光照時間為8-12h/d。
與現有技術相比，本發明的有益效果為：
(1)本發明的方法中選用剛萌發的牛大力種子苗作為誘導材料，剛萌發的牛大力種子苗具有很強的分生能力，經過秋水仙素誘導處理，可使細胞中的染色體成倍數性變化，本發明經過多次試驗，誘導率70％-85％之間，得到的多倍體牛大力植株形狀優良。
(2)本發明在誘導過程中還添加了二甲基亞碸，起到保護細胞的作用，從而減少了秋水仙素對細胞的毒害，提高了誘導率。
(3)本發明選擇了特定的秋水仙素濃度，該濃度能夠提高對於牛大力的誘導成功率。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
本發明涉及一種多倍體牛大力品種的培育方法，所述方法包括以下步驟：
1)培育二倍體牛大力種子，得到牛大力種子苗；
2)選取生長勢強的牛大力苗浸泡在二甲基亞碸混和秋水仙素合溶液中進行多倍體誘導；
3)對誘導後的牛大力苗進行增殖培養；
4)將增殖得到的叢生芽剪成單芽並轉接，進行生根培養，培養得到根莖葉完整的組培苗；
5)篩選所述組培苗，得到多倍體植株。
採用剛萌發的種子苗作為誘導材料，剛萌發的種子苗分生能力強。秋水仙素可抑制紡錘絲的合成，從而使染色體加倍，二甲基亞碸是滲透型細胞保護劑，起到保護細胞的作用。
本發明以特定的濃度的秋水仙素溶液對種子苗浸泡特定的時間，經過從培養後得到的植株中，篩選即可得到多倍體牛大力植株，誘導率高，得到的多倍體植株性狀優良。
在本發明的一個優選實施方式中，所述步驟1)中，培育種子的具體過程包括，選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，剝去種皮，用升汞消毒處理3-5min，無菌水清洗4-6次，轉接到1/2ms培養基中，暗培養3-8d。
在本發明的一個優選實施方式中，所述二甲基亞碸的質量百分濃度為0.05-0.15％。
在本發明的一個優選實施方式中，所述二甲基亞碸的質量百分濃度為0.08-0.12％。
在本發明的一個優選實施方式中，所述秋水仙素的質量濃度為0.01-0.2％。
在本發明的一個優選實施方式中，所述秋水仙素的質量濃度為0.05-0.15％。
在本發明的一個優選實施方式中，所述步驟2)中，浸泡處理的時間為12-72h。
在本發明的一個優選實施方式中，所述步驟2)中，浸泡處理的溫度為15-20℃。
在本發明的一個優選實施方式中，所述增殖培養和所述生根培養均在23-27℃的條件下進行。
在本發明的一個優選實施方式中，所述增殖培養和所述生根培養均在光照強度1300-1700lx的條件下進行，優選地，光照時間為8-12h/d。
實施例1
按照以下步驟培育多倍體牛大力：
(1)選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，在超淨工作檯上，用手術刀剝去種皮，放入滅菌瓶中，用0.1％升汞消毒處理3min，無菌水清洗4次，轉接到1/2ms培養基中，暗培養誘導3d後開始萌芽；
(2)將步驟1)剛萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亞碸和0.01％秋水仙素的混合溶液中進行處理72h，處理溫度15℃；
(3)將步驟2)中經過誘導的牛大力苗用無菌水清洗1次，轉接到常規的增殖培養基中進行增殖培養，培養溫度25±2℃，光照強度1300lx,光照時間10h/d，培養40d後開形成叢生芽；
(4)將步驟3)叢生芽剪切成單芽，轉接到常規的生根培養基中，暗培養5-7d後進行光照培養，培養溫度25±2℃，光照強度1700lx,光照時間10h/d，培育成完整植株；
(5)切取步驟4)篩選的目標植株的莖尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(無水乙醇：乙酸體積比＝3:1)固定15min，清水洗淨，用解離液(濃鹽酸：甲醇體積比＝1:1)解離1min，清水洗淨，切取分生組織0.1mm，用卡寶品紅染色，壓片觀察，計算染色體數目，確定多倍體植株，誘導率為70％。
實施例2
按照以下步驟培育多倍體牛大力：
(1)選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，在超淨工作檯上，用手術刀剝去種皮，放入滅菌瓶中，用0.1％升汞消毒處理5min，無菌水清洗6次，轉接到1/2ms培養基中，暗培養誘導5d；
(2)將步驟1)剛萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亞碸和0.1％秋水仙素的混合溶液中進行處理24h，處理溫度20℃；
(3)將步驟2)中經過誘導的牛大力苗用無菌水清洗2次，轉接到常規的增殖培養基中進行增殖培養，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx,光照時間12h/d，培養45d後形成叢生芽；
(4)將步驟3)叢生芽剪切成單芽，轉接到常規的生根培養基中，暗培養5-7d後進行光照培養，培養溫度25±2℃，光照強度1300lx,光照時間10h/d，培育成完整植株；
(5)切取步驟4)篩選的目標植株的莖尖、根尖1mm，用咔喏固定液(無水乙醇：乙酸體積比＝3:1)固定10min，清水洗淨，用解離液(濃鹽酸：甲醇體積比＝1:1)解離3min，清水洗淨，切取分生組織0.1mm，用卡寶品紅染色，壓片觀察，計算染色體數目，確定多倍體植株，誘導率為78.5％。
實施例3
(1)選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，無菌條件下，剝去種皮，用0.1％升汞消毒處理3min，無菌水清洗5次，轉接到1/2ms培養基中，暗培養誘導8d；
(2)將步驟1)剛萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亞碸和0.15％秋水仙素的混合溶液中進行處理20h，處理溫度15℃；
(3)將步驟2)中誘導的牛大力苗用無菌水清洗2次，轉接到常規的增殖培養基中進行增殖培養，培養溫度25±2℃，光照強度1700lx,光照時間10h/d；
(4)將步驟3)叢生芽剪切成單芽，轉接到常規的生根培養基中，暗培養5-7d後進行光照培養，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx,光照時間12h/d，培育成完整植株；
(5)切取步驟4)篩選的目標植株的莖尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(無水乙醇：乙酸體積比＝3:1)固定20min以上，清水洗淨後，用解離液(濃鹽酸：甲醇體積比＝1:1)解離3min，清水洗淨，切取分生組織0.1mm，用卡寶品紅染色，壓片觀察，計算染色體數目，確定多倍體植株，誘導率為85％。
實施例4
(1)選取成熟、飽滿的二倍體牛大力種子，無菌條件下，剝去種皮，用0.1％升汞消毒處理3min，無菌水清洗5次，轉接到1/2ms培養基中，暗培養誘導8d；
(2)將步驟1)剛萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亞碸和0.15％秋水仙素的混合溶液中進行處理20h，處理溫度15℃；
(3)將步驟2)中誘導的牛大力苗用無菌水清洗2次，轉接到常規的增殖培養基中進行增殖培養，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx,光照時間10h/d；
(4)將步驟3)叢生芽剪切成單芽，轉接到常規的生根培養基中，暗培養5-7d後進行光照培養，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx,光照時間8h/d，培育成完整植株；
(5)切取步驟4)篩選的目標植株的莖尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(無水乙醇：乙酸體積比＝3:1)固定20min以上，清水洗淨後，用解離液(濃鹽酸：甲醇體積比＝1:1)解離3min，清水洗淨，切取分生組織0.1mm，用卡寶品紅染色，壓片觀察，計算染色體數目，確定多倍體植株，誘導率為85％。
儘管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和範圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬於本發明範圍內的所有這些變化和修改。