鹿茸細胞的工業化生產方法
2023-05-15 03:00:01
專利名稱：鹿茸細胞的工業化生產方法
技術領域：
本發明涉及細胞株的人工培養方法，具體地講涉及鹿茸細胞的工業化大規模生產方法。
鹿茸細胞是自然界中一種特殊的哺乳動物細胞，在鹿體上正常分裂生長速度超過癌細胞。我國人民發現鹿茸藥用已有悠久歷史，臨床療效，保健作用卓著。現代醫學研究確證了鹿茸的活性物質和藥理機制，國內外倍受推崇。
鹿茸生產自有始以來均依賴於野生獵取或以人工家養方式獲得鹿茸，受自然界和養殖條件束縛，質量優劣懸殊，生產水平有限。
本發明的目的在於尋找一種大規模工業化生產鹿茸細胞的方法，該方法操作簡便，成本低，並且產品應該具有天然鹿茸的相同藥理作用，本發明人經過幾十年反覆試驗，多次選擇，逐漸摸索出了一種鹿茸細胞的轉瓶工業生產方法，該方法採取鹿茸生長點的組織為原始材料，於特定的細胞生長培養液中連續傳代培養獲得適於大規模轉瓶生產的種細胞株。本發明以生物工程轉瓶工業化生產鹿茸細胞，獨創了鹿茸物質生產新方式，使其產品完全達到「臘片」水平，經濟開發源力深遠。
本發明的目的是這樣實現的一、原始母細胞株的培養從幼嫩鹿茸生長點採取生茸細胞原始材料，特徵為稜形，圓形不同分化階段的異形細胞，在無菌操作條件下，將原始材料排列於細胞培養瓶中，做貼壁培養，加少量(十分之一容量)細胞生長液，生長液(一)配方Eagle氏最低要素營養液(E-MEM)78％新生犢牛血清20％卡那黴素1％碳酸氫鈉1％於34℃培養，從鹿茸組織周邊外延生長細胞，細胞形態不一，根據生長適應情況不斷更換生長液，先傾出原培養液，添加新生長液，待長出單層，棄去原始組織，分散細胞，從原代細胞做次代接種培養，細胞生長分裂增殖良好，以0．25％胰酶液消化分散細胞做連續傳代培養，根據細胞數量逐步分瓶擴大，並向較大培養瓶過度，溫度由34℃升高至37℃。當傳代達20代左右出現滯生現象，生長緩慢，細胞分裂現象不夠旺盛，有終止傳代危險，要採限促生措施，使用生長液(二)，使細胞延續傳代達到30代。
細胞生長液(二)配方E-MEM 90％
新生犢牛血清7％細胞生長促進物(鹿血漿鹿肝浸出液2％1∶10 Eagle液)卡那黴素1％碳酸氫鈉調PH7．0-7．2二、種細胞株的培養將上述獲得的傳代30代的鹿茸母細胞株接種於裝有十分之一量生長液(一)的培養轉瓶中，轉瓶容量為3升，生長溫度調節至34-37℃，培養旋轉數為6-30轉／小時，培養時間為3-7天，然後做次代接種培養，培養條件相同，連續傳代30-150代，達到生長周期一致，長勢旺盛，生命力強，得到理想的種細胞株，該細胞株已於1997年6月18日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No．0308，可將該細胞株直接用於生產或於-75℃～-195℃超低溫保存備用。
三、鹿茸細胞轉瓶工業化生產採用3升、10升或15升培養轉瓶，加入十分之一容量的細胞生長液(一)，取種細胞株接種，接種量約為20萬／ml，在34-37℃恆溫下，每5-8分鐘旋轉-周(每小時8-12轉)，培養24-72小時完成分裂增殖，每毫升可獲得細胞106以上，每臺體積2．7-3．00M3轉機生產13，500毫升細胞液，在2000M2配備24臺轉機的生產車間可年產15，500立升鹿茸細胞。
四、鹿茸細胞的活性、藥理作用活性分析證實含有臨床療效相對應的基礎物，主要有18種以上胺基酸，其中有7種人體必需胺基酸，2種半必需胺基酸含有磷脂、多肽、尤其是含有次磺嘌呤以及精脒，精胺等多胺物質。
藥理試驗證鹿茸細胞具有顯著的抗疲勞和抗衰老作用，能促進核酸(RNA)和蛋白質合成，有抑制單胺氧化酶活性作用，抗氧化作用以及雄性激素樣作用。
藥理作用、藥用功效，活性物質均與天然鹿茸相一致。
權利要求
1.一種鹿茸細胞的工業化生產方法，其特徵在於取經傳代培養得到的鹿茸種細胞株接種至細胞生長液(一)中，34-37℃恆溫下，每5-8分鐘旋轉一周，培養24-72小時。
2.根據權利要求1所述的方法，其中鹿茸種細胞株是經過原代細胞培養，次代接種培養得到母細胞株，母細胞株連續傳代得到種細胞株。
3.根據權利要求2所述的方法，其中母細胞株是按下列方式得到的從幼嫩鹿茸生長點採取生茸細胞，排列於細胞培養瓶做貼壁培養，加細胞生長液(一)，34℃培養待長出單層，棄去原始組織，用0.25％胰酶液消化分散細胞，連續傳代培養至20代，使用生長液(二)，傳代至30代
4.根據權利要求2所述的方法，其中種細胞株是按下列方式培養得到的將母細胞株接種於裝有生長液(一)的培養瓶中，溫度為34-37℃，培養轉數為6-30轉/小時，培養時間為3-7天，連續傳代30-150代，得到理想的種細胞株。
5.根據權利要求1、3或4所述的方法，其中細胞生長液(一)的配方為E-MEH78％新生犢牛血清 20％卡那黴素 1％碳酸氫鈉液 1％細胞生長液(二)的配方為E-MEM90％新生犢牛血清 7％細胞生長促進物 2％卡那黴素 1％碳酸氫鈉 調pH7.0-7.2
6.一種鹿茸細胞系，其特徵在於其保藏號為CGMCC No.0308。
全文摘要
鹿茸細胞的工業生產技術,摘取鹿茸生長的組織為原材料,培養出貼壁原代鹿茸細胞,並使其完全適應轉瓶大規模旋轉培養,每毫升培養液獲得100萬以上鹿茸細胞,一個培養單位(瓶)的一次周期生長的細胞量,可超過一支天然鹿茸所含的生茸細胞數。
文檔編號C12N5/06GK1203946SQ9711185
公開日1999年1月6日 申請日期1997年6月26日 優先權日1997年6月26日
發明者梁國堅, 康中影, 張桂珍 申請人:梁國堅, 康中影