檢測水中銅綠假單胞菌和toxA的引物、試劑盒和方法與流程
2023-04-24 14:04:06
本發明涉及一種檢測水中銅綠假單胞菌和toxa的引物，本發明還涉及一種檢測水中銅綠假單胞菌及其重要毒力因子外毒素蛋白a，toxa的雙重微滴式數字pcr檢測試劑盒，本發明還涉及一種採用上述試劑盒檢測食水中銅綠假單胞菌及toxa的方法。
背景技術：
銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosa原稱綠膿桿菌。在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見的細菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌存在的重要條件是潮溼的環境。該菌是一種常見的環境微生物，因對營養要求不高，善於利用各種碳源和氨化化合物作為氮源，所以在水、土壤、食品以及醫院等環境中廣泛存在。美國、加拿大、歐洲、日本、巴西及世界衛生組織對飲用水中銅綠假單胞菌含量的限定mpn<3/l或每250ml不得檢出。我國《食品安全國家標準包裝飲用水》(gb19298-2014)，則規定5個水樣中，每個樣中250ml都不得檢出銅綠假單胞菌。
2009年10月開始，《飲用天然礦泉水》等水相關的食品安全國家標準先後都將菌落總數這一指標刪除。這一改革雖然具有實際意義，但客觀來說，使得水生產企業簡化了消毒程序，大大提高了銅綠假單胞菌超標概率。2015年9月23日，北京市食品藥品監督管理局下架4款「銅綠假單胞菌」超標嚴重的純淨水、礦泉水。近年來，各地更是頻現飲用水中銅綠假單胞超標的情況。
銅綠假單胞菌的急性感染過程中，細菌表面蛋白如鞭毛、脂多糖、粘多糖等促進細菌對宿主上皮細胞的黏附和定植，而細菌的擴散和組織損傷則主要由ⅱ型和ⅲ型分泌系統分泌的主要毒力因子、蛋白酶等所致。其中，外毒素a，即toxa由ⅱ型分泌系統產生，是銅綠假單胞菌最主要的致病因子，通過使靶細胞的延長因子-2核糖基化失活，從而抑制靶細胞的蛋白質合成，導致靶細胞的壞死。
飲用水生產質量的嚴格把控需要對銅綠假單胞菌準確、快速檢測，同時對銅綠假單胞菌傳播風險進行評估。本發明通過設計針銅綠假單胞菌和toxa基因的特異引物、探針組合，可了解水中銅綠假單胞菌的分布和菌株中toxa基因的流行情況。
目前，各類食品安全標準都要求對銅綠假單胞菌的進行定量檢測，但對於銅綠假單胞菌的定量檢測主要還是通過傳統方法進行培養後計數，但傳統方法存在過程繁瑣，周期長等缺點。而常規pcr方法需要pcr擴增後進行電泳，不僅操作繁瑣，而且不能實現定量檢測。目前，southernblot和實時螢光定量pcr是常用的兩種外源基因拷貝數分析技術，已廣泛用於外源基因拷貝數分析。但這兩種方法也存在一定缺陷。例如，southernblot方法分析時工作量大、周期長、操作要求高、準確性較差，特別是對於多拷貝基因的分析，結果容易偏小。螢光定量pcr在分析外源基因拷貝數時必須依賴於標準曲線和已知拷貝數的基因，只是一種相對定量方法，且標準曲線的質量易受到dna純度、引物和探針的濃度、反應抑制因子等諸多因素影響；另外，標準曲線必須基於標準物質建立，而標準物質的種類有限和昂貴价格不能適用於所有的研究。
微滴數字pcr是近年來興起的一種新的絕對定量技術，它基於單分子pcr方法來進行計數的核酸定量，是一種絕對定量的方法。主要採用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋後的核酸溶液分散至晶片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少於或者等於1個。這樣經過pcr循環之後，有一個核酸分子模板的反應器就會給出螢光信號，沒有模板的反應器就沒有螢光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的基因拷貝數。
但基於微滴數字pcr平臺的拷貝數的分析工作報導較少，針對銅綠假單胞菌及toxa基因的檢測就更未見報導了。本發明基於微滴式ddpcr平臺，建立了銅綠假單胞菌及其toxa基因拷貝數分析方法，研究結果為分析食品安全生物源性風險因子的定量檢測提供了新的方法和借鑑，也為食品安全質量控制提供了一個技術支撐手段。
技術實現要素：
本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種引物且組分和配比合理，使用方便，檢測快捷，準確，適用於雙重ddpcr檢測水中銅綠假單胞菌及toxa基因的試劑盒；
本發明另一個目的是提供一種採用上述試劑盒檢測水中銅綠假單胞菌及toxa基因的方法，該方法操作簡便、快速，檢測結果準確。
為了達到上述目的，本發明採用以下方案：
一種水中銅綠假單胞菌及toxa基因引物，其特徵在於該引物的序列和探針序列分別為：
上遊引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下遊引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上遊引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下遊引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
一種ddpcr檢測水中銅綠假單胞菌及toxa基因的試劑盒，其特徵在於該試劑盒中反應體系包括以下組分：其中2×ddpcrsupermix10.0μl，銅綠假單胞菌和toxa正反向引物各0.1-1.0μl、探針各0.1-1.0μl，dna模板4.0μl。
一種ddpcr檢測銅綠假單胞菌及toxa基因的方法，其特徵在於包括以下步驟：
a、提取樣品dna；
b、將各反應組分加入上述20.0μl反應體系，然後加入70.0μl礦物油，混勻後轉移到微滴發生器上自動產生微滴；
c、將產生的微滴細全部轉移到96孔反應板pcr反應管中；再將96孔反應板在封膜儀上封膜，並置於普通pcr儀進行pcr反應。
d、打開微滴螢光檢測器應用軟體，將pcr反應結束後的96孔反應板直接插入設備，檢測每pcr反應管中微滴的pcr反應情況,最後根據珀松分布定律算出待測基因的拷貝數。
如上所述檢測銅綠假單胞菌及toxa基因的方法，其特徵在於步驟b中pcr擴增的反應程序按以下步驟進行：
(1)94℃預變性3min；
(2)94℃變性10s，60℃退火1min，共進行40個循環；
(3)98℃酶熱失活10min；
(4)4℃停止反應。
如上所述檢測銅綠假單胞菌及toxa基因的方法，其特徵在於步驟a中所述提取樣品dna的具體步驟如下：
50ml水樣直接10000rpm立心10分鐘，或者取50ml水樣通過濾膜過濾，用鑷子夾取濾膜在50ml的離心管用2ml超純水衝洗後再10000rpm離心10分鐘，去上清；加入5mlctab提取液，充分混勻。65℃孵育30min，不時振蕩；後8000r/min室溫離心10min，取1ml上清液入2ml離心管中；加入700μl氯仿後用力振蕩，13000g離心10min，轉移上清液600μl到新的2ml離心管中；加入2倍體積的ctab沉澱溶液顛倒數次後室溫靜置60min，13000×g離心10min，棄去上清，加入350μlnacl溶液將沉澱進行懸浮，再加入350μl氯仿，渦旋振蕩進行混勻，13000g離心10min，轉移上清後加入0.8倍體積的異丙醇用來沉澱核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於50μlte溶液中。
本發明中敏感性和特異性試驗：
採用測序等方法對陽性擴增產物進行測序驗證，結果陽性擴增產物序列進行blast比較時，序列均與genbank目的序列高度同源。將10倍稀釋的參考菌株基因組dna加入前述反應體系，重複試驗顯示檢測樣品過程中具有很好重複性。稀釋模板濃度對數值和拷貝數值之間也呈良好的線性關係r2≥0.95。說明該方法具有較好的精確度和良好的穩定性。
本發明與現有技術相比，具有以下優點:
1)本發明試劑盒組分和配比合理，使用方便，檢測快捷，準確，適用於ddpcr定量檢測銅綠假單胞菌及toxa基因；
2)本發明檢測方法簡化了檢測流程，而且無需製作標準曲線，大大縮短了檢測周期，檢測時間比傳統培養計數方法縮短兩天左右；
3)本發明檢測方法整個過程無需使用標準曲線，且與新一代測序無縫對接直接，對基因拷貝數可執行絕對定量分析。
4)數字pcr檢測系統通過微滴化處理，可以大大減少背景和基質的幹擾，靈敏度可以低至1個拷貝,因此,對低濃度基因濃度的細微變化進行準確及重複性佳的檢測。
5)採用本發明檢測方法在同一反應體系即可實現同時銅綠假單胞菌和toxa基因進行精準檢測，操作簡便、快速。具有較好產業化前景。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明做進一步描述：
實施例1
本發明檢測水中銅綠假單胞菌及toxa基因的引物，序列分別為：
上遊引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下遊引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上遊引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下遊引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
實施例2
本發明一種檢測水中銅綠假單胞菌及toxa基因的試劑盒，其中20μl反應體系包括以下組分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，銅綠假單胞菌和toxa正反向引物各1.0μl、探針各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
上遊引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下遊引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上遊引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下遊引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
實施例3
本發明檢測水中銅綠假單胞菌及toxa基因方法，包括以下步驟：
a、提取樣品dna；
b、將各反應組分加入上述20.0μl反應體系，然後加入70.0μl礦物油，混勻後轉移到微滴發生器上自動產生微滴；
c、將產生的微滴仔細全部轉移到96孔反應板pcr反應管中；再將96孔反應板在封膜儀上封膜，並置於普通pcr儀進行pcr反應。
d、打開微滴螢光檢測器應用軟體，將pcr反應結束後的96孔反應板直接插入設備，檢測每pcr反應管中微滴的pcr反應情況,最後根據珀松分布定律算出待測基因的拷貝數。
其中引物序列如下:
上遊引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下遊引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上遊引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下遊引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
所述的螢光pcr擴增按以下步驟進行：
(1)(1)94℃預變性3min；
(2)94℃變性10s，60℃退火1min，共進行40個循環；
(3)98℃酶熱失活10min；
(4)4℃停止反應。
實施例4
本發明檢測水中銅綠假單胞菌及toxa基因方法，包括以下步驟：
50ml水樣直接10000rpm立心10分鐘，或者取50ml水樣通過濾膜過濾，用鑷子夾取濾膜在50ml的離心管用2ml超純水衝洗後再10000rpm離心10分鐘，去上清；加入5mlctab提取液，充分混勻。65℃孵育30min，不時振蕩；後8000r/min室溫離心10min，取1ml上清液入2ml離心管中；加入700μl氯仿後用力振蕩，13000g離心10min，轉移上清液600μl到新的2ml離心管中；加入2倍體積的ctab沉澱溶液顛倒數次後室溫靜置60min，13000×g離心10min，棄去上清，加入350μlnacl溶液將沉澱進行懸浮，再加入350μl氯仿，渦旋振蕩進行混勻，13000g離心10min，轉移上清後加入0.8倍體積的異丙醇用來沉澱核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於50μlte溶液中。
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，銅綠假單胞菌和toxa正反向引物各1.0μl、探針各1.0μl，dna模板4.0μl。其中引物序列如下:
上遊引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下遊引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上遊引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下遊引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
進行pcr擴增，按以下步驟進行：
(1)94℃預變性3min；
(2)94℃變性10s，60℃退火1min，共進行40個循環；
(3)98℃酶熱失活10min；
(4)4℃停止反應。
實施例5
本發明檢測水中銅綠假單胞菌及toxa基因方法，包括以下步驟：
50ml水樣直接10000rpm立心10分鐘，或者取50ml水樣通過濾膜過濾，用鑷子夾取濾膜在50ml的離心管用2ml超純水衝洗後再10000rpm離心10分鐘，去上清；加入5mlctab提取液，充分混勻。65℃孵育30min，不時振蕩；後8000r/min室溫離心10min，取1ml上清液入2ml離心管中；加入700μl氯仿後用力振蕩，13000g離心10min，轉移上清液600μl到新的2ml離心管中；加入2倍體積的ctab沉澱溶液顛倒數次後室溫靜置60min，13000×g離心10min，棄去上清，加入350μlnacl溶液將沉澱進行懸浮，再加入350μl氯仿，渦旋振蕩進行混勻，13000g離心10min，轉移上清後加入0.8倍體積的異丙醇用來沉澱核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於50μlte溶液中。
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，銅綠假單胞菌和toxa正反向引物各0.1μl、探針各0.1μl，dna模板4.0μl。其中引物序列如下:
上遊引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下遊引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上遊引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下遊引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
進行pcr擴增，按以下步驟進行：
(1)94℃預變性3min；
(2)94℃變性10s，60℃退火1min，共進行40個循環；
(3)98℃酶熱失活10min；
(4)4℃停止反應。
結果分析
本發明研製過程中，同時採用培養基的傳統培養方法，進行銅綠假單胞菌數量測定的對照。實驗重複三次，銅綠假單胞菌結果取平均值。結果顯示，本發明採用數字pcr方法對水中銅綠假單胞菌的拷貝數，與傳統培養方法檢測出的菌落總數結果相關係數r2≥99％。另外，本發明數字pcr盡歡方法的單樣本全程檢測時間為4小時，遠短於現有傳統的平板培養計數方法，且檢測銅綠假單胞菌同時，還能對其toxa進行定量檢測，能夠準確評價致病菌傳播風險，因此具有良好的技術優勢和產業化發展前景。
以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特徵以及本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
sequencelisting
中山檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
檢測水中銅綠假單胞菌和toxa的引物、試劑盒和方法
檢測水中銅綠假單胞菌和toxa的引物、試劑盒和方法
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