溫鬱金1號的組織培養法的製作方法

2023-05-27 23:48:31 2

專利名稱：溫鬱金1號的組織培養法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種溫鬱金1號的組織培養法。
背景技術：
溫鬱金具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗愛滋病等多種藥理活性，臨床上用於治療肺 癌、肝癌、乳腺癌、胸腹水等。其在浙南有一千多年的栽培歷史，主產地浙江瑞安，且多栽培， 少野生。但因多年種植、管理混亂，並隨著環境汙染及土壤營養貧瘠等日趨嚴重，導致溫鬱 金藥材種質退化、品質下降，這嚴重影響了溫鬱金藥材產業的發展。溫鬱金1號作為溫鬱金的品種之一，可由樂清市源生中藥材種植有限公司提供。 目前現有的溫鬱金1號的培育法為種莖繁殖，該方法具有如下缺陷年繁殖率僅為25倍左 右ο溫鬱金脫毒組織培養技術研究(汪洪，2009，藥物生物技術)公開了一種溫鬱金的 培養方法，該方法具有如下不足之處不定芽的繁殖係數低，僅為2 4倍；增殖周期長，約 為4周；而且在不定芽增殖過程中，根原基被誘導，發育成大量根系，不定芽和不定根的同 時生長不僅嚴重影響了增殖效率，而且使不定芽的繼代分割不易操作，最終導致種苗質量 下降，移栽成活率低，僅達85%。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種溫鬱金1號的組織培養法，採用該方法能快 速獲得大量的溫鬱金1號組培種苗。為了解決上述技術問題，本發明提供一種溫鬱金1號的組織培養法，依次包括以 下步驟1)、將無病斑、無蟲癭且健壯飽滿的溫鬱金1號塊根放入生化培養箱進行催芽，直 至長成0. 5 2. Ocm高的小芽；培養條件為26 28°C暗培養；2)、割取上述小芽進行流水衝洗；3)、將上述流水衝洗後的小芽經常規消毒後，剝取3 5毫米大小的莖尖作為外植 體接種到無菌苗培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30 40μπιΟ1 m_2. s—1，溫度為27 士 1°C ；8小時暗培養，溫度為21 士 1°C ；上述光照和暗培養交替進行；4)、待上述莖尖長至1. 0 2. Ocm高時進行割取作為小苗I ；將上述小苗I接種到 不定芽誘導培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30 40μπιΟ1 nTU， 溫度為27士 1°C ；8小時暗培養，溫度為21 士 1°C ；上述光照和暗培養交替進行；5)、待從小苗I上誘導出的不定芽I長到1.0 3. Ocm高時，割取不定芽I作為 小苗II ；將上述小苗II接種到增殖培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度 30 40 μ mol πΓ2. s—1，溫度為26 28°C ；8小時暗培養，溫度為20 22°C ；上述光照和暗 培養交替進行；6)、待上述小苗II上長出的不定芽II長到3. 0 6. Ocm高時，割取不定芽II作為小苗III ；將此小苗III接種到生根培養基中；培養條件為16小時光照，光照強度40 50μπιΟ1 m_2. s—1，溫度為26 28°C ；8小時暗培養，溫度為20 22°C ；上述光照和暗培養交替進行；7)待上述小苗III長到高4 8cm且具有至少3條長於2cm的根時，得可出瓶種植 的種苗。作為本發明的溫鬱金1號的組織培養法的改進將溫鬱金1號的小芽放入紗袋中， 無菌水衝洗1 2小時。作為本發明的溫鬱金1號的組織培養法的進一步改進步驟3)中的無菌苗培養基為1/2MS基本培養基+白砂糖20 30g/l+瓊脂4 9g/l, pH 為 5. 5 6. 0 ；步驟4)中的不定芽誘導培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖 20 30g/l+ 瓊脂 4 9g/l, pH 為 5. 5 6. 0。步驟5)中的增殖培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+ 瓊脂 4 9g/l，pH 為 5. 5 6. 0。步驟6)中的生根培養基為=IAMS基本培養基+白砂糖15 20g/l+瓊脂4 10g/l, pH 為 5. 5 6. 0。在本發明中無菌苗培養基的製作方法具體如下以1/2MS基本培養基(即溶液中所有物質的 含量為MS基本培養基的一半)為基礎，分別加入白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH 或lmol/L的HCl調節pH為5. 5 6. 0 ；每IL的1/2MS基本培養基中加20 30g白砂糖、 4 9g瓊脂。不定芽誘導培養基的製作方法具體如下以MS基本培養基為基礎，分別加入N-苯 基-N' -1,2, 3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L 的HCl調節pH為5. 5 6. 0 ；每IL的MS基本培養基加入0. 05 0. 5mg的TDZ、20 30g 白砂糖、4 9g瓊脂。增殖培養基的製作方法具體如下以MS基本培養基為基礎，分別加入N-苯 基-N' -1,2, 3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L 的HCl調節pH為5. 5 6. 0 ；每IL的MS基本培養基加入0. 05 0. 5mg的TDZ、20 30g 白砂糖、4 9g瓊脂。生根培養基的製作方法具體如下以1/2MS基本培養基(即溶液中所有物質的含 量為MS基本培養基的一半)為基礎，分別加入白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或 lmol/L的HCl調節pH為5. 5 6. 0 ；每IL 1/2MS基本培養基中加15 20g白砂糖、4 IOg瓊脂。本發明的溫鬱金1號組織培養法，屬於一種離體快速繁殖的組織培養方法。依照 植物組織培養中細胞全能性的原理，可以在短時間內生產大量遺傳背景相同、長勢一致的 優質種苗(種子)，而且依靠實驗室可以實現周年的長期提供優質種苗。在本發明的方法 中，將健康飽滿的溫鬱金1號塊根進行催芽，並割取小芽進行消毒；再通過合適的誘導培養 基進行誘導不定芽以及增殖不定芽，可以獲得大量的無菌苗。採用本發明的方法，一般僅需 45 60天即可得到可出瓶種植的種苗；因此溫鬱金1號組培苗一周年內的繁殖係數理論 上為61(1倍以上。所以，本發明的溫鬱金的組織培養法，是一種不受季節等因素影響，高效、快速提供優質溫鬱金種苗的方法，可以加速良種推廣速度，提高田間品種種植產量。綜上所述，本發明建立的溫鬱金1號組織培養體系將為良種(溫鬱金1號)工廠 化育苗提供理論依據和技術支撐。本發明所得的種苗可採用以下常規方法進行種植待種苗高4 8cm且具有至少 3條長於2cm的根時，進行煉苗馴化，在室溫下(25°C左右)放置2 3d後開瓶，然後在自 然光下放置2 3d後取出小苗，用溫水(30°C左右)洗淨根部瓊脂，並晾乾至根系發白，移 栽入營養土中，(泥炭珍珠巖蛭石=4 3 3的重量比)，於人工氣候箱室培養，培養 條件溫度20 25°C，溼度85% 90%，光照強度15 25μπι01 πΓ2. s—1 ；3 5周後光照 強度30 40 μ mo 1 πΓ2. s—1 ；2個月後，存活率達到95%以上。
具體實施例方式實施例1 一種溫鬱金1號的組織培養法，依次進行以下步驟1)、將無病斑、無蟲癭且健壯飽滿的溫鬱金1號塊根放入生化培養箱進行催芽，直 至長成0. 5 2. Ocm高的小芽；培養條件為26 28°C暗培養。2)、割取上述小芽轉入紗袋，無菌水流水衝洗1 2小時。3)、將上述流水衝洗後的小芽經常規消毒後(即0. w/v HgCl2處理6 10分 鍾後，無菌水衝洗5 8遍，然後用無菌濾紙吸乾)，剝取3-5毫米大小的莖尖作為外植體接 種到無菌苗培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30 40μπιΟ1 nrU， 溫度為27士 1°C ；8小時暗培養，溫度為21 士 1°C ；上述光照和暗培養交替進行；無菌苗培養基為1/2MS基本培養基+白砂糖25g/l+瓊脂7g/l，pH為5. 5 6.0。4)、待上述莖尖長至1. 0 2. Ocm高時，割取成單株的小苗I ；將上述小苗I接種 到不定芽誘導培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30 40μπιΟ1 m_2. s—1，溫度為27 士 1°C ；8小時暗培養，溫度為21 士 1°C ；上述光照和暗培養交替進行；不定芽誘導培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 2mg/l+白砂糖25g/l+瓊脂7g/l，pH 為 5. 5 6. 0。5)、待從小苗I上誘導出的不定芽I長到1.0 3. Ocm高時，割取成2 5株叢生 的小苗II ；將上述小苗II接種到增殖培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強 度30 40 μ mol πΓ2. s—1，溫度為26 28°C ；8小時暗培養，溫度為20 22°C ；上述光照和 暗培養交替進行；增殖培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 25mg/l+白砂糖25g/l+瓊脂6g/l，pH為 5. 5 6. O06)、待上述小苗II長出的不定芽II長到3. 0 6. Ocm時，割取得小苗III ；將此小苗 III接種到生根培養基中；培養條件為16小時光照，光照強度40 50μπιΟ1 nTU，溫度為 26 28°C ；8小時暗培養，溫度為20 22°C ；上述光照和暗培養交替進行；生根培養基為:1/2MS基本培養基+白砂糖17g/l+瓊脂7g/l，pH為5. 5 6. 0。7)待上述小苗III長到高4 8cm且具有至少3條長於2cm的根時，得可出瓶種植 的種苗。依照上述方法，只需45 50天即可獲得試管苗；因此採用本發明的方法可以長期 得到大量的試管苗。
實施例2、一種溫鬱金1號的組織培養法，僅對培養基的配方進行如下更改，其餘 同實施例1 無菌苗培養基為1/2MS基本培養基+白砂糖20g/l+瓊脂9g/l，pH為5. 5 6.0。不定芽誘導培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 05mg/l+白砂糖30g/l+瓊脂4g/l， pH 為 5. 5 6. 0。增殖培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 45mg/l+白砂糖30g/l+瓊脂4g/l，pH為 5. 5 6. O0生根培養基為:1/2MS基本培養基+白砂糖15g/l+瓊脂10g/l, pH為5. 5 6. 0。依照上述方法，只需45 50天即可獲得試管苗；因此採用本發明的方法可以長期 得到大量的試管苗。實施例3、一種溫鬱金1號的組織培養法，僅對培養基的配方進行如下更改，其餘 同實施例1 無菌苗培養基為1/2MS基本培養基+白砂糖30g/l+瓊脂4g/l，pH為5. 5 6.0。不定芽誘導培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 5mg/l+白砂糖20g/l+瓊脂9g/l，pH 為 5. 5 6. 0。增殖培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 06mg/l+白砂糖20g/l+瓊脂9g/l，pH為 5. 5 6. O0生根培養基為:1/2MS基本培養基+白砂糖20g/l+瓊脂4g/l，pH為5. 5 6. 0。依照上述方法，只需45 50天即可獲得試管苗；因此採用本發明的方法可以長期 得到大量的試管苗。綜上所述，本發明的溫鬱金1號的組織培養法具有如下特點1、繁殖係數高(5-8 倍)，增值周期短(14-20天)；2、增值階段不誘導根原基發育，不定芽的增殖一致性好。3、 激素TDZ的成本降低50倍左右，且種苗質量好，移栽成活率高達95%以上。對比例將溫鬱金1號塊根改成按照現有的溫鬱金脫毒組織培養技術研究(汪洪， 2009，藥物生物技術)進行培養，然後進行相同的移栽種植，結果為不定芽的繁殖係數低， 僅為2-4倍，增值周期長，約為4周；而且在不定芽增殖過程中，根原基被誘導，發育成大量 根系，不定芽和不定根的同時生長不僅嚴重影響了增殖效率，而且使不定芽的繼代分割不 易操作，最終導致種苗質量下降，移栽成活率低，僅達85%。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
溫鬱金1號的組織培養法，其特徵是依次包括以下步驟1)、將無病斑、無蟲癭且健壯飽滿的溫鬱金1號塊根放入生化培養箱進行催芽，直至長成0.5～2.0cm高的小芽；培養條件為26～28℃暗培養；2)、割取上述小芽進行流水衝洗；3)、將上述流水衝洗後的小芽經常規消毒後，剝取3～5毫米大小的莖尖作為外植體接種到無菌苗培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30～40μmol m 2.s 1，溫度為27±1℃；8小時暗培養，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養交替進行；4)、待上述莖尖長至1.0～2.0cm高時進行割取作為小苗Ⅰ；將上述小苗Ⅰ接種到不定芽誘導培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30～40μmol m 2.s 1，溫度為27±1℃；8小時暗培養，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養交替進行；5)、待從小苗Ⅰ上誘導出的不定芽Ⅰ長到1.0～3.0cm高時，割取所述不定芽Ⅰ作為小苗Ⅱ；將上述小苗Ⅱ接種到增殖培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30～40μmol m 2.s 1，溫度為26～28℃；8小時暗培養，溫度為20～22℃；上述光照和暗培養交替進行；6)、待上述小苗Ⅱ上長出的不定芽Ⅱ長到3.0～6.0cm高時，割取所述不定芽Ⅱ作為小苗Ⅲ；將此小苗Ⅲ接種到生根培養基中；培養條件為16小時光照，光照強度40～50μmol m 2.s 1，溫度為26～28℃；8小時暗培養，溫度為20～22℃；上述光照和暗培養交替進行；7)待上述小苗Ⅲ長到高4～8cm且具有至少3條長於2cm的根時，得可出瓶種植的種苗。
2.根據權利要求1所述的溫鬱金1號的組織培養法，其特徵是所述步驟2)為將溫鬱 金1號的小芽放入紗袋中，無菌水衝洗1 2小時。
3.根據權利要求2所述的溫鬱金1號的組織培養法，其特徵是步驟3)中的無菌苗培養 基為1/2MS基本培養基+白砂糖20 30g/l+瓊脂4 9g/l，pH為5. 5 6. 0。
4.根據權利要求3所述的溫鬱金1號的組織培養法，其特徵是步驟4)中的不定芽誘 導培養基為MS基本培養基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+瓊脂4 9g/l，pH 為 5. 5 6. 0。
5.根據權利要求4所述的溫鬱金1號的組織培養法，其特徵是步驟5)中的增殖培養基 為MS基本培養基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+瓊脂4 9g/l，pH為5. 5 6. 0。
6.根據權利要求5所述的溫鬱金1號的組織培養法，其特徵是步驟6)中的生根培養 基為1/2MS基本培養基+白砂糖15 20g/l+瓊脂4 10g/l，pH為5. 5 6. 0。
全文摘要
本發明公開了一種溫鬱金1號的組織培養法，依次包括以下步驟1)將無病斑、無蟲癭且健壯飽滿的溫鬱金1號塊根放入生化培養箱進行催芽；2)割取小芽進行流水衝洗；3)將小芽經常規消毒後，剝取3～5毫米大小的莖尖進行培養；4)割取莖尖作為小苗Ⅰ接種到不定芽誘導培養基上進行培養；5)割取小苗Ⅰ上誘導出的不定芽Ⅰ作為小苗Ⅱ進行增殖培養；6)割取小苗Ⅱ上長出的不定芽Ⅱ作為小苗Ⅲ進行生根培養；7)待上述小苗Ⅲ長到高4～8cm且具有至少3條長於2cm的根時，得可出瓶種植的種苗。採用該方法能快速獲得大量的溫鬱金1號組培種苗。
文檔編號A01H4/00GK101953300SQ201010265480
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月24日 優先權日2010年8月24日
發明者毛碧增, 陳麗閩 申請人:浙江大學