一種甲烷氧化菌的保藏方法

2023-04-24 10:55:51 3

專利名稱：一種甲烷氧化菌的保藏方法
技術領域：
本發明涉及微生物的保藏方法，特別是涉及一種可以有效防止雜菌汙染的甲烷氧化菌的保藏方法。
背景技術：
甲烷氧化菌是自然界中一類非常特殊的微生物，它以甲烷為唯一的碳源及能源。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。研究表明甲烷氧化菌可以廣泛地應用於以甲烷為原料的化工產品(天然氣或沼氣等)的大規模工業化生產中，也可以應用於環境中有機汙染物的治理，甚至可以用來有效地預防煤礦中的瓦斯氣體爆炸。目前，該菌種沒有特殊的保存方法，一般只是像其它微生物一樣加入甘油後於-70℃冷凍保存。因為甘油在後續的操作中被很難完全除去，而甲烷氧化菌的生長速度又遠遠慢於其它雜菌，因此，雜菌就利用其中的甘油作為碳源大量生長，引起雜菌汙染。另一種保藏方法是將甲烷氧化菌菌種保存於含有甲烷的平板培養基上，培養起來後再接種到另一平板上，如此不停。該方法雖然可以避免雜菌汙染且能使甲烷氧化保持較高的活性，但費時費力，實施起來很不方便。
因此迫切需要一種簡便，且可以有效防止雜菌汙染的甲烷氧化菌的保藏方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種操作簡單，且可以有效防止雜菌汙染的甲烷氧化菌的保藏方法。
本發明所提供的甲烷氧化菌的保藏方法，是收集甲烷氧化菌菌體，將其與經滅菌的石蠟油混勻後，在-4℃～-90℃下保存。
在上述保藏方法中，所述甲烷氧化菌與石蠟油混合物的OD600值為0.3-1.5。
所述石蠟油的滅菌條件可為在121℃下加熱15-25分鐘。
可用於保存甲烷氧化菌的容器是多種多樣的，任何經滅菌且耐低溫的容器均可，如容積為200微升～500毫升的塑料容器，優選為500微升～1.5毫升的塑料離心管。
上述保藏方法對經液體培養和固體培養的甲烷氧化菌同時適用。
需要使用時，只需將保藏的菌體連同石蠟油一同倒入培養基中培養即可，因為石蠟油除可用於甲烷氧化菌的菌種保藏外，還具有促進該菌生長的作用。
本發明提供了一種甲烷氧化菌的保藏方法。該方法是用石蠟油代替甘油進行菌種保藏的方法。由於石蠟油不能被大多數雜菌作為碳源利用，因此該方法可以大大地降低雜菌的汙染機會；此外，使用時只需將菌體及石蠟油的混合物直接添加入培養基中進行培養即可，方便、快速。本發明將在甲烷氧化菌的保藏及其工業化生產中發揮重要作用。
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有百分比濃度均為質量百分比濃度，所有培養基中的溶劑均為去離子水。
NMS培養基配方每升培養基中含有NaNO30.85克，KH2PO40.53克，Na2HPO42.17克，K2SO40.17克，MgSO4·7H2O 0.037克，CaCl2·2H2O 0.007克，微量元素貯存液2mL，lmmol/L H2SO40.5毫升，FeSO4·7H2O 11.2毫克，CuSO4·5H2O 2.5毫克(固體培養基再添加1.5％的瓊脂)，pH 7.0。
微量元素貯存液的配方為每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042克，MnSO4·4H2O0.223g，H3BO30.062g，Na2MoO4·2H2O 0.048g，CoCl2·6H2O 0.048g，KI 0.083g。
實施例1、甲烷氧化菌的液體培養一、甲烷氧化菌單菌落的獲得用滅菌的接種環挑取甲烷氧化菌保存液(Methylosinus trichosporium)OB3b(Sullivan JP et al.Methanotrophs，Methylosinus trichosporium OB3b，sMMO，and their application to bioremediation，Crit.Rev.Microbiol.，1998，4(24)335-373；Takeguchi M et al.，Properties of the membranes containing theparticulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b，Biometals，1998，11229-234)，用劃線的方法將其接種於NMS平板固體培養基表面，每天用注射器通過0.2μ的過濾器向培養皿中加入5-10毫升的甲烷氣體，在30℃下培養四周後，平板上有明顯的菌落產生。
二、甲烷氧化菌的液體培養1)取50毫升的培養瓶，裝入NMS液體培養基10毫升，在121℃下滅菌20分鐘；2)挑取一個步驟一在平板上長出的甲烷氧化菌單菌落，將其接種到NMS液體培養基中，每天用注射器通過0.2μ的過濾器加入5-20毫升的甲烷氣體，在30℃、150rpm下振蕩培養四周，培養基的OD600值約為0.1-1.0後，即可用於保存。
實施例2、甲烷氧化菌在石蠟油中的保存將實施例1培養的甲烷氧化菌菌液1.5毫升倒入經滅菌的1.5毫升離心管中，8000rpm離心10分鐘後，棄去上清，在超淨臺中或用無菌操作的方法將收集的菌體加入經滅菌(121℃下加熱20分鐘)的500微升石蠟油中，在旋渦振蕩器上振蕩，使菌體在石蠟油中分散均勻，然後放入-20℃冰箱中保存。
實施例3、石蠟油保藏的甲烷氧化菌的使用取50毫升培養瓶，裝入NMS液體培養基10毫升，在121℃下滅菌20分鐘後，從冰箱中取一管用石蠟油保存90天的甲烷氧化菌，在超淨臺中將解凍的菌液全部倒入到NMS液體培養基中，每天用注射器通過0.2μ的過濾器加入5-20毫升的甲烷氣體，在30℃、150rpm下振蕩培養三天後，培養基呈現混濁狀，其OD600值約為0.1-0.3，甲烷氧化菌培養成功，表明用本發明方法對甲烷氧化菌進行保藏，可使菌體長期維持較高的生物活性。
權利要求
1.一種甲烷氧化菌的保藏方法，是收集甲烷氧化菌菌體，將其與經滅菌的石蠟油混勻後，在-4℃～-90℃下保存。
2.根據權利要求1所述的保藏方法，其特徵在於所述甲烷氧化菌與石蠟油混合物的OD600值為0.3-1.5。
3.根據權利要求1或2所述的保藏方法，其特徵在於所述石蠟油的滅菌條件為在121℃下加熱15-25分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種甲烷氧化菌的保藏方法。該方法是收集甲烷氧化菌菌體，將其與經滅菌的石蠟油混勻後，在－4℃～－90℃下保存。由於石蠟油不能被大多數雜菌作為碳源利用，因此該方法可以大大地降低雜菌的汙染機會；此外，使用時只需將菌體及石蠟油的混合物直接添加入培養基中進行培養即可。本發明將在甲烷氧化菌的保藏及其工業化生產中發揮重要作用。
文檔編號C12N1/26GK1844368SQ200610074530
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月27日 優先權日2006年4月27日
發明者緱仲軒, 邢新會, 趙洪新, 吳昊, 韓冰, 江皓, 王磊 申請人:清華大學