一種基於分裂鎖式探針的多重rca方法
2023-05-25 20:26:16
專利名稱：一種基於分裂鎖式探針的多重rca方法
技術領域：
本發明涉及一種分子探針的RCA方法，具體說是一種基於分裂鎖式探針的多重RCA方法。
背景技術：
鎖式探針(padlock probes)也稱為環式寡核苷酸 探針(circularizingoligonucleotide probes, OCP),是一種能滿足生命科學需要的敏感、準確、特異的分子診斷方法。滾環放大擴增(rolling circle amplification, RCA)是模仿卩遼菌體感染細菌後進行自我複製形式的一種擴增方法，這種複製形式可在恆溫下對環狀單鏈DNA進行相對無限單鏈擴增。在一定條件下，我們利用鎖式探針形成的環狀單鏈DNA，對其進行滾環複製，從而實現在恆溫條件下的核酸擴增。近年來在一些基因檢測技術研究中被廣泛採用，並將與之有關的技術統稱為滾環放大技術。核酸連接檢測(Oligo ligation assay, 0LA)用於點突變和SNP (單核苷酸多態性)的檢測，其特異性是由連接酶的高特異性決定的。當檢測的DNA或者RNA樣本中含有與兩條相鄰的直鏈探針(即探針兩端的檢測臂)互補的靶序列時(突變靶點即在兩段探針相鄰處，突變靶點互補鹼基位於等位特異性探針3'上)，T4連接酶或E. coli連接酶在37°C恆溫條件下可將雜交在DNA或者RNA樣本上相鄰的兩條探針間的切口連接起來。然後利用線性RCA的放大作用，將這一點突變的特異信號擴增放大，然後通過生物傳感器(表面等離子體共振傳感器)等檢測手段進行突變位點的無標記檢測。滾環擴增(rolling circle amplification, RCA)是一種恆溫的核酸擴增方法。是模擬噬菌體感染細菌後進行自我複製普遍採取的一種形式，因為滾環複製的模板必須是封閉的單鏈環狀DNA，我們將這種特性用於單核苷酸的檢測研究中，與核酸連接檢測(OLA)和生物傳感器相結合，在具有鏈置換活性的DNA多聚酶(phi29DNA polymerase)作用下，將滾環的無限複製作為一種信號放大系統。目前常用的點突變檢測技術主要有序列特異性引物聚合酶鏈式反應(PCR-SSP)法，該方法是針對等位基因設計特異性引物，僅擴增突變基因而不擴增其他等位基因，擴增產物仍需凝膠電泳檢測以判斷有無擴增，或者螢光等標記以判斷擴增。對引物設計要求較高，多位點要設計多重引物，需要對不同反應進行條件優化；對空氣中DNA氣溶膠汙染比較敏感，易造成假陽性或假陰性；對少量樣品的多位點分型特別是低頻率位點的特異性較低。單鏈構象多態性(SSCP)，該方法是基於相同長度的單鏈DNA鹼基順序或單鹼基差異所形成的空間構想不同，導致凝膠電泳速度不同以檢測。缺陷需PCR擴增後電泳，對儀器條件要求較高；不能檢測變異的位置；隨0嫩片段長度增加，檢測的敏感性降低；假陰性高；對八丁檢出率無CG好，有局限性。限制性片段長度多態性(RFLP)，該方法是需要和PCR技術聯合應用(PCR擴增目的基因一限制性內切酶酶切目的基因片段一電泳分離)。缺陷序列多態性座位中大約只有1/3的鹼基涉及限制酶識別序列，對多位點檢測的範圍有限；限制酶消化條件較高，步驟繁瑣。測序技術(sequencing)該方法是多重PCR擴增含有檢測位點的區域一分離PCR產物並變性為單鏈座位延伸反應的模板進行單鏈延伸一電泳分離延伸產物或者通過螢光等標記方法檢測。缺陷成本較高，耗時較長。
發明內容
本發明提供了一種基於分裂鎖式探針的多重RCA方法，該方法是綜合鎖式探針技術和滾環複製的原理髮明的一種新型的檢測特定DNA序列的方法。使用該方法檢測特定的DNA序列不需要設計特定的引物，通用引物即可實現擴增，反應過程不需要反覆的升溫降溫，操作方便，特異性強，其擴增產物含有設計好的標籤探針序列，可直接採用基因晶片進行檢測。本發明中的新型分裂鎖式探針(cleavable padlock probes, c-PLPs)長約IOObp,其結構如圖I，包括4個部分I)檢測臂探針的5'端和3'端為檢測臂，檢測臂與靶序列完全互補，只有當與靶序列完全鹼基互補結合時，才可在連接酶作用下使探針兩端連接環化；2)通用引物區探針的引物結合區為滾環擴增的通用引物區，實現混合靶序列的多重滾環擴增；3)酶切區域探針右側的酶切區域包含一個硫代磷酸化的HhaI內切酶位點，生成的單鏈產物攜帶該位點，將在擴增的同時被HhaI內切酶切成與環狀探針相同大小的單鏈DNA片段產物，而探針本身由於硫代磷酸化的保護而不會被酶切，從而始終作為模板進行複製；4)特異性標籤序列探針左側的標籤序列區使RCA單鏈DNA產物帶有各自的特異性標籤序列，可與晶片表面固定的互補標籤序列探針特異性鹼基互補結合，實現多重擴增產物的特異性檢測，部分特異性標籤序列如序列表序列I-序列表序列9，其特性參數如表 Io表I特異性標籤序列特性參數表
標籤序列j溶解溫度(Tm值;V)G+C含量(GC%)
序列表序列I63.660
序列表序列261.960
序列表序列362.960
序列表序列460.460
序列表序列558. I60
序列表序列660.660
序列表序列766. I60
權利要求
1.一種基於分裂鎖式探針的多重RCA方法，其特徵在於具體操作步驟為步驟一、連接反應將靶序列DNA片段與終濃度為O. I μ mol/L的四種分裂鎖式探針混合煮沸變性後，立即置於冰上冷卻5min，升溫至37°C，雜交15min，加入2. 5U的T4DNA連接酶和IyL的T4DNA連接酶緩衝液，去離子水補足IOuL反應體系，連接反應時間45min，再加入IOUexonuclease I和lOUexonuclease III，37°C,反應15min,製備出含有環狀模板的連接產物；其中 T4DNA連接酶緩衝液的成份為 40mmol/L Tris-HCL, IOmmoI/L MgCL2, IOmmoI/L DTT和 O. 5mmol/L ATP ； 步驟二、滾環擴增反應反應取步驟一製得的混合連接產物IOyL,與通用引物，其鹼基序列如序列表序列10，混合煮沸變性後，分別加入摩爾濃度為的10mmOl/LdNTP2l·! L，phi29DNA 聚合酶 10U, HhaI 限制性內切酶 IOU 和由 33mmol/Ltris-AcU0mmol/LMgAC2,6mmol/LKAC和O. I μ g/ μ LBSA組成的緩衝液2 μ L，去離子水補足20uLRCA反應體系，溫度37°C，反應時間60min ； 步驟三、RCA單鏈DNA產物檢測RCA反應結束後，取反應產物採用1%瓊脂糖凝膠電泳、RCA單鏈產物測序、螢光定量RCA擴增或表面等離子體共振生物傳感器檢測方法中的一種方法進行檢測。
2.如權利要求I所述的一種基於分裂鎖式探針的多重RCA方法，其特徵在於所述的分裂鎖式探針，包括以下4個部分 1)檢測臂探針的5'端和3'端為檢測臂，檢測臂與靶序列完全互補，只有當與靶序列完全鹼基互補結合時，才可在連接酶作用下使探針兩端連接環化； 2)通用引物區探針的引物結合區為滾環擴增的通用引物區，實現混合靶序列的多重滾環擴增； 3)酶切區域探針右側的酶切區域包含一個硫代磷酸化的HhaI限制性內切酶位點，生成的單鏈產物攜帶該位點，將在擴增的同時被HhaI限制性內切酶切成與環狀探針相同大小的單鏈DNA片段產物，而探針本身由於硫代磷酸化的保護而不會被酶切，從而始終作為模板進行複製； 4)特異性標籤序列探針左側的標籤序列區使RCA單鏈DNA產物帶有各自的特異性標籤序列，可與晶片表面固定的互補標籤序列探針特異性鹼基互補結合，實現多重擴增產物的特異性檢測。
全文摘要
一種基於分裂鎖式探針的多重RCA方法，新型分裂鎖式探針長約90bp左右，包括4個部分，即檢測臂、通用引物區、的HhaI內切酶位點、標籤序列區；其擴增系統由連接體系和RCA體系兩部分組成，具體檢測方法為，首先進行連接反應將靶序列DNA片段與終濃度為1mol/L的四種分裂鎖式探針混合，煮沸變性後雜交15min，加入T4DNA連接酶和T4DNA連接酶緩衝液，補足10uL反應體系，37℃，45min，exonucleaseI和exonuclease III外切，製備出環狀模板，然後RCA反應將10μL連接產物和通用引物混合煮沸變性後，分別加入dNTP，phi29DNA聚合酶和HhaI限制性內切酶和緩衝液，共20μL反應體系，置於37℃，60min；最後對攜帶特異性標籤序列的RCA單鏈DNA產物檢測，根據結果得出相應的實驗結論。
文檔編號C12Q1/68GK102719550SQ201210237758
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者向陽, 府偉靈, 黃慶 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院