草珊瑚的組培快繁方法

2023-05-25 22:42:41

專利名稱：草珊瑚的組培快繁方法
技術領域：
本發明涉及一種草珊瑚的組培快繁方法，屬於植物組織培養的領域。
前景技術
草珊瑚(又名腫節風、九節茶、接骨木)為常用中藥，主要分布在浙江、江 西、安徽、福建等省。其味辛、苦，性平，有抗菌消炎、清熱解毒、祛風除溼、 活血止痛、通經接骨等功效，用於治療各種炎症性疾病、風溼關節痛、瘡瘍腫毒、 跌打損傷、骨折等。現代藥理和毒理研究表明，腫節風具有抗菌消炎、抑制流感 病毒、抗腫瘤、促進骨折癒合及鎮痛等多種活性，而且腫節風及其提取物具有較 好的安全性，急性毒性試驗結果屬實際無毒，動物精子畸形試驗、小鼠骨髓細胞 微核試驗、Ames試驗均為陰性，未發現致突變。腫節風用於治療腫瘤(胰腺癌、 胃癌、直腸癌、肝癌、食道癌等)、細菌性痢疾、骨折及多種口腔疾病均有較顯 著效果。《中華人民共和國藥典》2005版一部收載其作為法定藥材使用，同時以 腫節風為原料的腫節風片、腫節風注射液、血康口服液也已收入2005版藥典， 腫節風浸膏、萬通炎康片、新癀片、消炎片、三蛇膽川貝液均收入部頒藥品標準 中。全國現有幾十家企業以腫節風為原料生產中成藥，產值達數億元。
長期以來，草珊瑚藥材一直依賴野生資源，資源的利用方式是非可再生性採 挖，導致野生資源急劇減少，藥材質量參差不齊，充分利用優良種質資源，選育 優良品種，進行人工栽培是保障其資源可持續利用、產業可持續發展的必然途徑。 植物組織培養技術是良種繁育最有效的手段之一，對於恢復和發展草珊瑚資源具 有重要的現實意義。
目前國內外有關草珊瑚細胞工程研究報導甚少。據報導1995年，江西省科學院生物資源所塗藝聲、江洪如等人進行了利用植物離體組織培養產生草珊瑚 有效成分的的研究。該項研究技術解決了草珊瑚外植體在誘導培養基進行愈傷組織誘導，從而獲得草珊瑚中的有機酸(延胡索酸等)、異嗪皮啶等有效成分。然而， 由於該項技術的研究目標在於利用組織培養獲得草珊瑚的有效成分，故並未完成 從愈傷組織誘導到植株根、莖、葉的誘導分化過程，即小苗培養過程。至今尚未 見通過愈傷組織的途徑獲得草珊瑚幼苗，從而實現草珊瑚人工大面積栽培的報 道。

發明內容
本發明的目的在於提供一種草珊瑚組培快繁的方法，實現在短期內獲得大量 優質的試管苗，從而解決草珊瑚苗木規模化生產問題。 本發明是通過下述方式實現的 一種草珊瑚的組培快繁方法，其步驟為-
(1) 選取草珊瑚無菌播種或莖段腋芽誘導獲得的試管苗為試材，待小苗
長出2-4張葉，根長l-1.5cm時，用無菌刀片環割其根系待用；
(2) 培養基準備
A:誘導培養基以MS培養基為基本培養基，附加的細胞分裂素為
l-2mg丄"6-節基氨基嘌呤(benzylaminopurine，簡稱BA)，生長素為0.1-0.2 mg丄-1 的萘乙酸(naphthylene acetic acid，簡稱NAA);
B:增殖、分化培養基以MS培養基為基本培養基，附加3-5 mg丄'1的BA 和0.1-0.2 mg丄-1的NAA;
C:生根培養基基本培養基為1/2MS，附加生長素為0.1-0.5 mg丄"吲哚丁 酸(indolebutyric acid，簡稱IBA);
其特徵在於
以無菌的小苗的根系作為外植體進行愈傷組織的誘導培養，用無菌刀片環割 根系，在培養溫度為25±2°C，光照強度為1000-1500Lux，光照周期為16h/d， 將外植體置於誘導培養基中培養，獲得草珊瑚愈傷組織後，將誘導出的愈傷組織 從根系上剝離下來，置入增殖、分化培養基中進行愈傷組織增殖、分化培養，獲 得草珊瑚叢苗，當叢苗長至3-4cm時，切取單苗置入生根培養基，進行生根培 養，最終獲得小苗。
所述的試管苗移栽時以用50%多菌靈可溼性粉劑的800-1000倍液進行基質 消毒，移栽後搭建塑料拱棚保溼。
所述的誘導培養基中還包含4.5 g丄"瓊脂粉、30 g丄"蔗糖和1.5 g丄"活性炭 (activatedcharcoal,簡稱AC)， PH值5.8。
所述的增殖、分化培養基中還包含4.2 g丄"瓊脂粉、30 g丄"蔗糖，PH值5.8。
所述的生根培養基中還包含4.5 g丄"瓊脂粉、30 g丄—1白砂糖和1.5 g丄—'活性 炭activated charcoal,簡稱AC)， PH值5.8。
本發明的有益效果是以無菌的小苗的根系作為外植體進行愈傷組織的誘導 培養，通過愈傷組織增殖、分化培養等過程，最終獲得小苗，從而解決了常規的 草珊瑚組培過程中，用莖尖、莖段、葉片誘導胚性愈傷組織過程中出現的誘導難 及培養物內生菌汙染嚴重的問題，對實現草珊瑚種苗的規模化育苗具有現實的意 義。
具體實施例方式
選取草珊瑚優良單株的成熟種子為外植體，在0—4t:下低溫儲藏45天後， 在無菌條件下用0.2%的HgCl2進行表面消毒，用無菌水衝洗後，放在1/2MS(MS 培養基的大量元素減半)培養基中進行發芽培養。培養溫度為25士2'C，光照強 度為800-1000Lux，光照周期為16h/d;待草珊瑚小苗長出2-4張葉，根長l-1.5cm 時，用無菌刀片環割根系，環割深度不達木質部，然後將小苗轉接到MS+BA2 mg丄"+NAA0.1 mg丄"+4.5 g丄"瓊脂粉+30 g丄-1蔗糖+1.5 g丄-1活性炭(activated charcoal，簡稱AC)， PH值5.8的誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，45天時 愈傷組織誘導率為65.6%。將誘導出的愈傷組織從根部剝離，放在 MS+BA4mg丄"+NAA0.1mg丄—'+4.2 g丄"瓊脂粉+30 g丄"蔗糖，PH值5.8的增殖、 分化培養基中培養，至50天時，愈傷組織的月增殖倍數為3.35，芽苗分化率為 68%。待叢苗長至3-4cm時，切取單苗放入1/2MS+IBA0.5 mg丄-'+4.5 g丄"瓊脂 粉+30 g丄"白砂糖+1.5 g丄"活性炭activated charcoal,(簡稱AC) PH值5.8的生 根培養基中進行生根培養，培養至40天時生根率79.6%，平均根長2.1cm和平均
根數為2.21根。以上各階段培養條件為培養溫度為25±2°C，光照強度為 800-1500Lux，光照周期為16h/d。待根長至l-3cm時，將封口膜打開，煉苗1 周，取出苗用自來水洗淨試管苗根部的培養基，稍晾乾表面的水分，即可進行試 管苗移栽。移栽基質為泥炭加蛭石加沙，三者體積比為2: 2: 1，基質移栽前用 50%多菌靈可溼性粉劑的800倍液進行基質消毒，消毒後將基質裝入50孔的穴 盆中，移入試管苗，搭建塑料拱棚，將溼度保持在85%以上，移栽10天後逐漸 降低溼度，30天後行常規管理。
權利要求
1、一種草珊瑚的組培快繁方法，其步驟為(1)選取草珊瑚無菌播種或莖段腋芽誘導獲得的試管苗為試材，待小苗長出2-4張葉，根長1-1.5cm時，用無菌刀片環割其根系待用；(2)培養基準備A誘導培養基以MS培養基為基本培養基，附加的細胞分裂素為1-2mg.L-16-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，簡稱BA)，生長素為0.1-0.2mg.L-1的萘乙酸(naphthylene acetic acid，簡稱NAA)；B增殖、分化培養基以MS培養基為基本培養基，附加3-5mg.L-1的BA和0.1-0.2mg.L-1的NAA；C生根培養基基本培養基為1/2MS，附加生長素為0.1-0.5mg.L-1吲哚丁酸(indolebutyric acid，簡稱IBA)；(3)待根長至1-3cm時，將封口膜打開，煉苗1周，用自來水洗淨試管苗根部的培養基，即可進行試管苗移栽。移栽基質為泥炭加蛭石加沙，三者體積比為2∶2∶1。其特徵在於以無菌的小苗的根系作為外植體進行愈傷組織的誘導培養，用無菌刀片環割根系，在培養溫度為25±2℃，光照強度為1000-1500Lux，光照周期為16h/d，將外植體置於基本培養基培養，再將誘導出的愈傷組織從根系上剝離下來，進行愈傷組織增殖、分化培養，最終獲得小苗。
2、 根據權利要求1所述的草珊瑚組培快繁方法，其特徵還在於所述的誘導培 養基中還包含4.5 g丄"瓊脂粉、30 g丄"蔗糖和1.5 g丄"活性炭(activated charcoal,簡稱AC)， PH值5.8。
3、 根據權利要求1所述的草珊瑚組培快繁方法，其特徵還在於所述的試管苗移栽時以用50%多菌靈可溼性粉劑的800-1000倍液進行基質消毒，移栽後搭 建塑料拱棚保溼。
4、 根據權利要求1所述的草珊瑚組培快繁方法，其特徵還在於所述的增殖、 分化培養基中還包含4.2gl/'瓊脂粉、30g丄—'蔗糖，PH值5.8。
5、根據權利要求1所述的草珊瑚組培快繁方法，其特徵還在於所述的生根培養基中還包含4.5 g丄"瓊脂粉、30 g丄—1白砂糖和1.5 g丄—1活性炭activated charcoal,簡稱AC)， PH值5.8。
全文摘要
本發明公開了一種草珊瑚的組培快繁方法，以無菌的小苗的根系作為外植體進行愈傷組織的誘導培養，通過愈傷組織增殖、分化培養等過程，最終獲得小苗，從而解決了常規的草珊瑚組培過程中，用莖尖、莖段、葉片誘導胚性愈傷組織過程中出現的誘導難及培養物內生菌汙染嚴重的問題，對實現草珊瑚種苗的規模化育苗具有現實的意義。
文檔編號A01H4/00GK101194593SQ200710164778
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者斯金平, 朱玉球 申請人:斯金平