一種沉默小鼠seps1基因的siRNA的製作方法

2023-05-11 11:10:41 1

專利名稱：一種沉默小鼠seps1基因的siRNA的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種siRNA，具體而言涉及一種抑制s印Si基因表達的siRNA及其製備方法。
背景技術：
RNA 幹擾(RNAinterference, RNAi)是由小幹擾 RNA(smallinterferingRNAs，siRNAs)引起的轉錄後基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing, PTGS),廣泛存在於生物體中。RNA幹擾技術可用於基因功能研究及生物遺傳改良等多方面用途。自2001年Tuschl等證明合成的雙鏈siRNA在哺乳動物細胞中可實現靶基因特異沉默作用後，siRNA因其特異性、高效性以及作為基因治療藥物的巨大潛力而備受青睞。作為基因治療工具，siRNA與傳統反義藥物相比更加具有高效、特異等優勢。此外，siRNA還可進行多元化改造，如可以通過與細胞特異性啟動子及可誘導系統結合，實現組織特異性基因沉默，因此具有廣闊的應用前景。研究表明RNAi技術可大大縮短從鑑定靶基因到認識其功能的時間，促進了在藥物發現過程中對已知靶基因功能的高通量分析，還加快了對藥物特異性及其作用機制的評估，以便較快地篩選出候選藥物分子。siRNA的有效性和優勢在神經系統疾病、炎症、代謝疾病(肥胖症，高膽固醇血症)、腫瘤、感染性疾病等的體內治療實驗中已得到初步證實。siRNA技術是在不破壞或不引起遺傳物質改變的情況下對相關基因進行轉錄抑制的，因此可更完整地闡明該基因的功能。更重要的是，在人類疾病的治療方面，siRNA可與靶基因序列之間產生特異性結合，發揮最佳的治療效果，而且也 不會產生明顯的不良副作用。可以預見，一旦siRNA在體內的穩定性、有效性、靶向性等瓶頸問題得到解決，RNAi技術在臨床的應用必將產生質的飛躍。人類sepsl基因位於染色體15q26.3,包含6個外顯子，編碼一個有189個胺基酸的蛋白質。15號染色體的這個區域以前被認為包含影響炎性疾病的數量性狀遺傳位點(quantitative trait loci QTLs),這些炎性疾病包括胰島素依賴型糖尿病,Alzheimer』 s病和腹部疾病。這樣，SEPSl有可能是炎症相關疾病多樣性的功能因素和位置因素。近來的研究結果顯示SEPSl與炎症細胞因子的產生存在直接的聯繫，可能在炎症介導的疾病以及一些其他的免疫異常中起主要作用。許多常見疾病的發生機制都包含了免疫系統的激活，例如糖尿病，腫瘤和心血管疾病。新近的研究顯示炎症反應持續作用的結果是導致這些疾病的發生。細胞暴露於應激條件下會激活免疫，由此導致循環中促炎症因子水平升高，這與Selenoprotein SI (sepsl)基因下調相關。SEPSl在保護內質網功能完整性以抵禦潛在的代謝應激中的重要作用是最近才明確的。SEPSI被分類為一個新的內質網膜蛋白，參與錯誤摺疊蛋白質由內質網向溶酶體的清除，在溶酶體中通過蛋白酶體進行遍蛋白化和降解。SEPSl也調節細胞氧化還原平衡並保護內質網免受氧化應激的有害作用。功能受損的內質網對這些副作用的反應是誘使一些基因表達，這將導致轉錄因子NF- κ B的活化。活化的NF- κ B進入細胞核，激活那些編碼促炎性細胞因子的基因轉錄。sepsl在2002年被識別，Northern blot分析顯示sepslmRNA表達於肝臟，骨骼肌，脂肪組織，下丘腦，睪丸，心臟和腎臟。sepsl在3個主要胰島素靶組織中高表達:肝臟，脂肪，和骨骼肌，提示其在調解胰島素活性和/或糖代謝中的可能作用。通過細胞裂解和免疫組織化學研究，Gao等人定位SEPSl蛋白在人類肝細胞的細胞膜和微粒體上。培養的肝腫瘤細胞中sepsl基因表達的過度會導致胰島素抵抗，包括葡萄糖攝取下降，糖原合成減少，以及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)胰島素依賴性降低的弱化。慢性炎症在許多常見疾病中都有病理作用並且受基因和環境因素的雙重影響。炎症反應增強，促炎因子的高分泌或者是抗炎分子的減少這些進化中的有利面，會導致慢性炎症狀態，例如肥胖，II型糖尿病和心血管疾病，給現代社會增加負擔。然而，上調sepsl基因可能是解決這些疾病的新希望。膿毒症是最古老的疾病之一，近50年來發病率及病死率逐漸升高，有報導1979年 1999年間患病率增加了 300%，目前全世界每天約有1400人死於本症。革蘭無關(G-)菌感染是引起膿毒症的重要原因之一，G-菌外膜的活性成分內毒素(endotoxin)即脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)與巨噬細胞、內皮細胞等多種細胞膜上相應受體作用後，啟動胞內信號傳導系統，最終激活核轉錄因子-KB(nuclear factor κ B, NF-κ B)，引起多種細胞因子和炎症介質(TNF、IL-1 β、IL-6等)的表達和釋放，導致血管通透性增加、體液滲出和淋巴細胞移行到炎症部位。機體的這種防禦反應有利於清除病原菌，但如反應過度，則會引發「炎症級聯反應」或伴有免疫功能的嚴重抑制，即全身炎症反應綜合症或代償性抗炎反應綜合症(compensatory ant1-1nflammatory reaction syndrome, CARS),表現為胺毒症，膿毒性休克甚至多器官功能障礙症候群(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。由於sepsl基因對促炎因子存在重要調控作用，因此本發明針對sepsl基因序列設計出2對siRNA，並經體內實驗檢測設計的siRNA對sepsl基因的沉默效果，結果顯示本發明設計的siRNAl能有效抑制s印Si基因的表達
發明內容
`本發明設計了 2對沉默小鼠sepsl基因的siRNA序列，同時設計了 I對無關對照SiRNA0本發明是通過如下技術方案實現的:應用 http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx 及GENEBANK等免費網絡資源，經過篩選，設計三對siRNA。siRNAl和siRNA2都具有靶向s印si基因的功能，siRNA3為無關對照。siRNAl，正義鏈序列為 SEQ ID N0.1:5』 > AACAGGAAGGCCTCAGGAAGACCTGTCTC AATCTTCCTGAGGCCTTCCTGCCTGTCTC AAGTTTGAGAATGCAGGAAGACCTGTCTC AATCTTCCTGCATTCTCAAACCCTGTCTC < 3’siRNA3，正義鏈序列為 SEQ ID N0.5:
5』 > AACATCGCAGAGCTCGACAGCCCTGTCTC AAGCTGTCGAGCTCTGCGATGCCTGTCTC < 3』本發明公開了一種幹擾小鼠sepsl基因的表達的試劑盒的組分，還公開了一種沉默小鼠sepsl基因的siRNA使用方法，所述使用方法包括以下步驟:I) siRNA的溶解:特異性靶向序列siRNAl及兩組對照siRNA2和siRNA3的正反義鏈各 40D (132 μ g),分別加入 132 μ I RNase Free water 稀釋溶解。2) siRNA退火複合:特異性靶向序列siRNAl及兩組對照siRNA2和siRNA3的正反義鏈各自等比例混合，100°c煮沸5min，逐漸自然冷卻至室溫。3)雙鏈siRNA的脂質體包被:siRNAl雙鏈、siRNA2雙鏈、siRNA3雙鏈分別與脂質體Lipofectamine 2000輕柔緩慢地混合均勻，使用比例為I μ I Lipofectamine 2000:
0.5 μ gRNA。4)將上一步得到的siRNAl脂質體複合物、兩組對照序列siRNA2和siRNA3脂質體複合物分別加入生理鹽水稀釋，並將其分別注射到不同組實驗小鼠體內，每隻動物尾靜脈注射 10μ gRNA，共 0.3ml。本發明按照上述方法，進行了小鼠體內sepsl基因沉默實驗，結果顯示本發明設計的siRNAl靶向幹擾小鼠sepsl基因的表達效果最好。siRNA進入動物體內細胞，雙鏈解開後反義鏈siRNA可和相應蛋 白質結合形成活化的RNA誘導沉默複合物(RNA inducedxilenceing complex, RISC), RISC進而識別和其中siRNA具有完全互補序列的mRNA,特異地降解sepsl基因。本發明涉及的三組siRNA既可用於體外細胞轉染，也可用於動物注射構建靶向抑制sepsl基因表達的動物模型。注射方法上，為避免常用肝臟高壓注射可能帶來的潛在的臟器損傷，本發明採用小鼠尾靜脈注射方法。本發明的有益效果:siRNAl與siRNA2通過脂質體包裝的方法對膿毒症小鼠進行尾靜脈注射，均可在注射後觀察到小鼠肝組織及肺組織蛋白水平的顯著下降。


圖1為s印si基因被幹擾後膿毒症小鼠肝組織SEPSl的蛋白表達。ACTIN為內參對照。N組為膿毒症組動物注射無關對照siRNA3後所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6)，B組為膿毒症組動物注射同源對照siRNA2後所取樣本(siRNA序列為SEQID N0.3及SEQ ID N0.4)，A組為膿毒症組動物被注射siRNAl後所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.1 及 SEQ ID N0.2)。圖2為石蠟切片免疫組化檢測siRNA幹擾膿毒症小鼠12h及24h肝組織SEPSl蛋白表達。研究結果顯示棕黃色為SEPSl蛋白表達陽性部位。N組為膿毒症組動物注射無關對照siRNA3後所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6)，B組為膿毒症組動物注射同源對照siRNA2後所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4)，A組為膿毒症組動物被注射siRNAl後所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2)。圖3為石蠟切片免疫組化檢測siRNA幹擾膿毒症小鼠12h及24h肺組織SEPSl蛋白表達。研究結果顯示棕黃色為SEPSl蛋白表達陽性部位。N組為膿毒症組動物注射無關對照siRNA3後所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6)，B組為膿毒症組動物注射同源對照siRNA2後所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4)，A組為膿毒症組動物被注射siRNAl後所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2)。
具體實施例方式實施例1 一種沉默小鼠s印Si基因的siRNA的構建在 http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx 網站提取從GENEBANK獲得s印si的全序列，並選擇起始核苷酸種類，GC含量範圍最後進行blast比對。由此得到的候選序列再根據mRNA的二級結構進一步篩選合適的siRNA序列。較小的空間位阻和較為鬆散的二級結構可以使siRNA更容易與靶mRNA結合，是保證產生較強基因沉默效應的關鍵。與siRNA對應的mRNA靶序列形成複雜二級結構的難易程度可由氫鍵係數進行評定。氫鍵係數可由以下公式計算。
權利要求
1.一種沉默小鼠S印Si基因的siRNAl，其特徵在於，SiRNAl其正義鏈序列為SEQ IDN0.1，反義鏈序列為SEQ ID N0.2。
2.—種幹擾sepsl表達的試劑盒,包括權利要求1所述的siRNAl。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，還包括無關對照序列siRNA3，所述的無關對照序列siRNA3其正義鏈序列為SEQ ID N0.5，反義鏈序列為SEQ ID N0.6。
4.一種小鼠s印Si基因沉默的方法，包括以下步驟: DsiRNA的溶解:將權利要求1或2中任意一項所述的siRNAl的正反義鏈各40D (132 μ g)，分別加入132 μ I RNase Free Water稀釋溶解，並將權利要求3所述的對照序列siRNA3的正反義鏈各40D (132 μ g)，分別加入132 μ I 無菌注射用水稀釋溶解。
2)siRNA退火複合:將權利要求1或2中任意一項所述的siRNAl正反義鏈各40D(132yg)等比例混合，同時將權利要求3中所述的對照序列siRNA3的正反義鏈等比例混合，100°C煮沸5min，逐漸自然冷卻至室溫，得到雙鏈siRNA。
3)雙鏈siRNA的脂質體包被:將上一步製備的雙鏈siRNA分別與脂質體Lipofectamine 2000輕柔緩慢地混合均勻，使用比例為I μ I Lipofectamine 2000:0.5 μ gRNA。
4)將上一步得到的siRNAl脂質體複合物和無關對照序列siRNA脂質體複合物分別加入生理鹽水稀釋，並將其分別注射到不同組實驗小鼠體內，每隻動物尾靜脈注射10μ gRNA，共 0.3ml ο
5.權利要求1所述的siRNAl或權利要求2-3中任意一項所述的試劑盒在製備沉默s印Si基因藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種沉默小鼠seps1基因的siRNA序列，及其使用方法。通過siRNA與脂質體混合對膿毒症小鼠進行尾靜脈注射，可有效降低SEPS1蛋白在膿毒症小鼠肝臟及肺組織中的表達水平。
文檔編號A61K48/00GK103146705SQ20131009362
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月22日 優先權日2013年3月22日
發明者康紅軍 申請人:康紅軍