吲哚丁酸類組蛋白去乙醯酶抑制劑及其製備方法和應用與流程

2023-05-03 05:17:46 3

本發明屬於藥物化學
技術領域：
，尤其涉及吲哚丁酸類組蛋白去乙醯化酶抑制劑及其製備方法和應用。
背景技術：
：組蛋白去乙醯化酶(hdacs)是一類功能複雜的水解酶。在細胞核中，由dna鏈纏繞著的組蛋白八聚體構成的核小體是構成染色體的結構單元，組蛋白去乙醯化酶(hdacs)能將組蛋白中的賴氨酸殘基末端氨基上的乙醯基水解掉(如反應式i)，從而導致組蛋白的正電荷密度增高，繼而引起組蛋白與負電性的dna的親和力增強，基因轉錄被抑制，(參見christian,a.h.,etal.curr.opin.chem.biol.,1997,1,300；kouzarides,t.,curr.opin.genet.dev.,1999,9,40)；wolffe,a.p.sci.washington,1996,272,371。此外，核小體組蛋白的去乙醯化還與染色質組裝，dna修復與重組密切相關，(參見polo,s.e.,etal.cancerlett.,2005,220,1；vidanes,g.m.,etal.cell,2005,121,973)。近來，越來越多的非組蛋白被證實為hdacs的底物，如轉錄因子，細胞骨架蛋白，分子伴侶等，(參見glozak,m.a.,etal.gene,2005,363,15)。正是由於hdacs具有如此複雜的功能，它的表達和活性失調與許多疾病密切相關，包括：癌症，神經變性疾病，病毒感染，炎症，白血病，瘧疾和糖尿病等，其中，癌症無疑是對人類生命健康威脅最為嚴重的疾病。研究表明，hdacs與腫瘤細胞發生發展密切相關，如：抑制腫瘤細胞分化和凋亡，促進腫瘤細胞增殖，遷移和血管生成，增強腫瘤細胞對化療藥物的抵抗力等，(參見witt,o.,etal.cancerletter.,2009,277,8)。反應式i目前在人體中發現了hdacs家族有18個成員，根據其結構，功能和分布的不同可分為四類。其中，i類(hdac1，2，3和8)，ii類(iia：hdac4，5，7和9；iib：hdac6，10)，iv類(hdac11)屬於鋅離子依賴性水解酶，而iii類hdacs(sirt1-7)是nad+依賴性的。研究表明，與腫瘤密切相關的主要是鋅離子依賴性hdacs，hdac抑制劑(hdacsinhibitors，hdaci)能有效抑制癌細胞增殖，促進細胞凋亡。而且，hdaci具有抗瘤譜廣，毒副作用低的優點，它們對實體瘤，白血病，淋巴瘤都具有很好的抑制活性。因此，針對hdacs為靶點設計抑制劑已成為抗腫瘤藥物研究的熱點。目前報導的hdaci藥效團大都包括如下三個部分：鋅離子螯合基團(zbg)，疏水性的長鏈(linker)和蛋白表面識別區(surfacerecognitiondomain)。鋅離子螯合基團可以螯合hdacs活性中心的鋅離子，從而抑制酶的活性。目前已知的活性最強，應用最廣的鋅離子螯合基團是異羥肟酸基團。然而，現在很多處於臨床研究的化合物沒有很好的藥效，雖然它們在臨床前的研究中表現出了很優異的活性。而且，上市的hdac抑制劑(saha和fk228)在治療實體瘤方面藥效很差，它們還存在著半衰期短，難吸收和藥物代謝動力學性質較差的缺點。技術實現要素：本發明針對現有技術的不足，提供一種組蛋白去乙醯酶抑制劑及其製備方法和應用，本發明採用異羥肟酸基團為鋅離子螯合基團，吲哚丁酸是一種植物生長激素，已經表現出了抗腫瘤潛力，將其引入到hdaci結構中可以明顯提高其活性，並改善其脂水分配係數，促進藥物的吸收。本發明的技術方案如下：具有結構式i的組蛋白去乙醯化酶抑制劑，其藥學上可接受的鹽，溶劑合物或前藥，結構通式i中：x是-nh-、-nhch2-；y是-co-、-ch＝chco-；ar是苯環、吡啶環、噻唑環；r是-f、-cl、-oh。本發明所述的吲哚丁酸類組蛋白去乙醯酶抑制劑，是下述化合物之一：4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-n-羥基苯甲醯胺(i1)；4-((4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)亞甲基)-n-羥基苯甲醯胺(i2)；(e)-n-(4-(3-(羥基胺基)-3-羰基丙-1-烯-1-基)苯基)-4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺(i3)；4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-3-氟-n-羥基苯甲醯胺(i4)；6-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-n-羥基煙醯胺(i5)；4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-3-氯-n-羥基苯甲醯胺(i6)；3-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-n-羥基苯甲醯胺(i7)；4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-n,3-二羥基苯甲醯胺(i8)；2-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-n-羥基噻唑-4-甲醯胺(i9)。本發明還提供了這些化合物在預防或治療與組蛋白去乙醯化酶活性異常表達相關的哺乳動物疾病的藥物中的應用。所述的與組蛋白去乙醯化酶活性異常表達的相關哺乳動物疾病包括：癌症，神經變性疾病，病毒感染，炎症和糖尿病等。因此，本發明還涉及含有結構式i化合物的藥物組合物。發明詳述所用的定義和術語本文中所用的術語和定義含義如下：「藥學上可接受的鹽」是指化合物具有療效且無毒的鹽形式。其可由任一酸性基團(如羧基)形成陰離子鹽，或由任一鹼性基團(如氨基)形成陽離子鹽。本領域已知許多這樣的鹽。在任何酸性基團(如羧基)上形成的陽離子鹽，或是在任何鹼性基團(如氨基)上形成的陰離子鹽。這些鹽有許多是本領域已知的，如陽離子鹽包括鹼金屬(如鈉和鉀)和鹼土金屬(如鎂和鈣)的鹽以及有機鹽(如銨鹽)。還可通過使用相應的酸處理鹼性形式的(i)方便地獲得陰離子鹽，這樣的酸包括無機酸如硫酸、硝酸、磷酸等；或有機酸如乙酸、丙酸、羥基乙酸、2-羥基丙酸、2-氧代丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、2-羥基-1,2,3-丙三酸、甲磺酸、乙磺酸、苯甲磺酸、4-甲基苯磺酸、環己基亞磺酸、2-羥基苯甲酸、4-氨基-2-羥基苯甲酸等。這些鹽是熟練技術人員熟知的，熟練的技術人員可製備本領域知識所提供的任何鹽。此外，熟練技術人員可根據溶解度、穩定性、容易製劑等因素取某種鹽而舍另一種鹽。這些鹽的測定和最優化在熟練技術人員的經驗範圍內。「前藥」是指藥物經過化學結構修飾後得到的在體外無活性或活性較小、在體內經酶或非酶的轉化釋放出活性藥物而發揮藥效的化合物。結構式(i)化合物還可以其它被保護的形式或衍生物的形式存在，這些形式對本領域技術人員而言是顯而易見的，均應該包含於本發明的範圍內。所述吲哚丁酸類組蛋白去乙醯酶抑制劑的製備方法，反應步驟及反應式如下：製備方法包括如下步驟：合成路線：以3-吲哚丁酸為原料，先進性縮合反應，再引入異羥肟酸得到終產物，反應式如下：上述合成路線1反應式中的試劑：(1)tbtu，相應胺基酸甲酯，et3n，dcm；(2)nhok，ch3oh。製備所述組蛋白去乙醯酶抑制劑的中間體，中間體包括：甲基4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)苯甲酸酯，甲基4-((4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)亞甲基)苯甲酸酯，(e)-甲基3-(4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)苯基)丙烯酸酯，甲基4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-3-氟苯甲酸酯，甲基6-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)煙酸酯，甲基4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-3-氯苯甲酸酯，甲基3-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)苯甲酸酯，甲基4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-3-羥基苯甲酸酯，甲基2-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)噻唑-4-甲酸酯。本領域技術人員可以對上述步驟進行變動以提高收率，他們可據本領域的基本知識確定合成的路線，如選擇反應物，溶劑和溫度，可以通過使用各種常規保護基以避免副反應的發生從而提高收率。這些常規的保護方法可參見例如t.greene,protectinggroupsinorganicsynthesis.。由於鋅離子依賴性組蛋白去乙醯化酶(hdacs)各亞型催化中心的高度同源性，我們選擇含有組蛋白去乙醯化酶的hela細胞提取物(包含hdac1,hdac2,hdac3和hdac8)來進行酶活性測試。hdacs活性螢光分析方法(兩步法)，能快速、方便檢測hdacs活性，操作簡單，靈敏度高。第一步，含一個乙醯化側鏈的賴氨酸hdacs螢光底物(boc-lys(acetyl)-amc)，用含有組蛋白去乙醯化酶的hela細胞提取物樣本孵育，使底物脫去乙醯基，激活底物。第二步，用胰酶水解boc-lys-amc，產生amc這一螢光基團(即發色團)，在發射波長/激發波長(390nm/460nm)測定螢光強度，從而根據抑制劑組及對照組的螢光強度計算抑制率，並求算ic50值。酶活性測試原理見反應式ii。化合物的細胞活性的測試使用噻唑蘭檢測方法(mtt法)，人組織細胞淋巴瘤細胞株(u937)，人紅白血病細胞株(k562)，人急性白血病細胞株(hl60)的細胞懸液分別接種於96孔板，每孔中加入含不同濃度化合物的培養基，經孵育後，用mtt染色，繼續孵育後，於酶標儀上在570nm處測定每孔的吸光度(od值)，計算出細胞生長抑制率，從而確定化合物的活性。通式(i)的化合物的體外抑酶試驗證明該類化合物為有效的組蛋白去乙醯化酶抑制劑。含有本發明化合物的藥物組合物本發明的部分衍生物可以游離形式或以鹽形式存在。本領域技術人員已知許多化合物類型的藥學上可接受的鹽及其製備方法。藥學上可接受的鹽包括常規的無毒性的鹽，包括這樣的化合物鹼與無機或有機酸形成的季銨鹽。本發明的化合物可形成水合物或溶劑合物。本領域熟練人員已知將化合物與水一起凍幹時所形成的水合物或在溶液中與合適的有機溶劑濃縮時形成溶劑合物的方法。本發明包含含有治療量本發明化合物的藥物，和一種或多種藥學上可接受載體和/或賦形劑的藥物組合物。載體包括如鹽水，緩衝鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它們的結合物，下文更詳細地論述。如果需要，該組合物還可以包含較小量的潤溼劑或乳化劑，或ph緩衝劑。該組合物可以是液體，懸浮液，乳劑，片劑，丸劑，膠囊，持續釋放製劑或粉末。該組合物可以用傳統的黏合劑和載體如三酸甘油酯配製成栓劑。口服製劑可以包括標準載體如藥物品級的甘露糖醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素和碳酸鎂等等。視需要製劑而定，配製可以設計混合，制粒和壓縮或溶解成分。在另一個途徑中，該組合物可以配製成納米顆粒。使用的藥物載體可以為固體或者液體。典型的固體載體包括乳糖，石膏粉，蔗糖，滑石，凝膠，瓊脂，果膠，阿拉伯膠，硬脂酸鎂，硬脂酸等等。固體載體可以包括一種或多種可能同時作為增香劑，潤滑劑，增溶劑，懸浮劑，填料，助流劑，壓縮助劑，粘合劑或片劑-崩解劑的物質；它還可以是包封材料。在粉末中，載體為精細粉碎的固體，它與精細粉碎的活性成分的混合。在片劑中活性成分與具有必要的壓縮性質的載體以合適的比例混合，以需要的形狀和大小壓縮。粉末和片劑優選包含至多99％活性成分。合適的固體載體包括，例如，磷酸鈣，硬脂酸鎂，滑石，糖，乳糖，糊精，澱粉，凝膠，纖維素，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉鹽，聚乙烯吡咯烷酮烷酮，低熔點蠟和離子交換樹脂。典型的液體載體包括糖漿，花生油，橄欖油，水等等。液體載體用於製備溶液，懸浮液，乳劑，糖漿，酊劑和密封的組合物。活性成分可以溶解或懸浮於藥學上可接受的液體載體如水，有機溶劑，二者的混合物或藥學上可接受的油類或脂肪。液體載體可以包含其他合適的藥物添加劑如增溶劑，乳化劑，緩衝劑，防腐劑，增甜劑，增香劑，懸浮劑，增稠劑，顏料，粘度調節劑，穩定形或滲透壓-調節劑。用於口服和腸胃外給藥的液體載體的合適的例子包括水(部分地包含如同上述的添加劑，例如纖維素衍生物，優選羧甲基纖維素鈉鹽溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)和它們的衍生物，和油類(例如分餾椰子油和花生油)。用於腸胃外給藥的載體還可以為油脂如油酸乙酯和異丙基肉豆蔻酸鹽。無菌的液體載體用於腸胃外給藥的無菌的液態組合物。用於加壓組合物的液體載體可以為滷代烴或其他藥學上可接受的推進劑。無菌溶液或懸浮溶液液體藥物組合物可以用來，例如，靜脈內，肌內，腹膜內或皮下注射。注射時可單次推入或逐漸注入，入30分鐘的經脈內灌注。該化合物還可以以液體或者固體組合物的形式口服給藥。載體或賦形劑可以包括本領域已知的時間延遲材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，還可包括蠟，乙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，異丁烯酸甲酯等等。當製劑用於口服時，公認phosalpg-50(磷脂(phospholipid)與1,2-丙二醇濃縮，a.nattermann&cie.gmbh)中的0.01％吐溫80用於其他化合物的可接受的口服製劑的配製，可以適應於本發明各種化合物的配製。給予本發明化合物時可以使用各式各樣的藥物形式。如果使用固體載體，製劑可以為片劑，被放入硬膠囊中的粉末或小藥丸形式或錠劑或糖錠形式。固體載體的量在很大程度上變化，但是優選從約25mg到約1.0g。如果使用液體載體，製劑可以為糖漿，乳劑，軟膠囊，在安瓿或小瓶或非水的液體懸浮液中的無菌注射溶液或懸浮液。為了獲得穩定的水溶性的劑型，可以將化合物或其藥學上可接受的鹽溶於有機或無機酸的水溶液，0.3m琥珀酸或檸檬酸溶液。選擇性地，酸性的衍生物可以溶於合適的鹼性溶液。如果得不到可溶形式，可將化合物溶於合適的共溶劑或它們的結合。這樣的合適的共溶劑的例子包括，但是不局限於，濃度範圍從0-60％總體積的乙醇，丙二醇，聚乙二醇300,聚山梨酸酯80，甘油，聚氧乙烯脂肪酸酯，脂肪醇或甘油羥脂肪酸酯等等。各種釋放系統是已知的並且可以用於化合物或其他各種製劑的給藥，這些製劑包括片劑，膠囊，可注射的溶液，脂質體中的膠囊，微粒，微膠囊，等等。引入的方法包括但是不局限於皮膚的，皮內，肌內，腹膜內的，靜脈內的，皮下的，鼻腔內的，肺的，硬膜外的，眼睛的和(通常優選的)口服途徑。化合物可以通過任何方便的或者其它適當的途徑給藥，例如通過注入或快速濃注，通過上皮的或黏膜線路(例如，口腔黏膜，直腸和腸黏膜，等等)吸收或通過負載藥物的支架以及可以於其他生物活性劑一起給藥。可以全身或局部給藥。用於鼻，支氣管或肺疾病的治療或預防時，優選的給藥途徑為口服，鼻給藥或支氣管煙霧劑或噴霧器。本發明中的吲哚丁酸類化合物對組蛋白去乙醯化酶的抑制活性優於陽性對照藥，具有良好的開發前景，並可作為發現新型高效組蛋白去乙醯化酶抑制劑的先導化合物。此外，此類化合物在體外抗腫瘤細胞增殖的試驗中顯示出優於陽性對照vorinostat(saha)的活性，具有良好的開發前景。附圖說明附圖1為hdacs活性螢光分析方法測試酶活性，其中histonedeacetylase為組蛋白去乙醯化酶，trypsin為胰蛋白酶，4-amino-7-methylcoumarin為4-氨基-7-甲基香豆素。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但不限於此。實施例1.本發明化合物的合成甲基4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)苯甲酸酯吲哚丁酸(1.0g,5mmol)溶於25ml四氫呋喃中，加入三乙胺(0.55g,5.5mmol)，加入o-苯並三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(tbtu)(1.8g,5.5mmol)。室溫反應20分鐘後，加入對氨基苯甲酸甲酯鹽酸鹽(0.94g,5mmol)，再加三乙胺(0.5g,5mmol)。室溫反應6小時後，蒸除反應液中的四氫呋喃，用乙酸乙酯溶解產物，分別用1mol/l的檸檬酸溶液，飽和碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水各洗滌3遍，無水硫酸鎂乾燥，蒸乾溶劑得粗品，粗品經乙酸乙酯重結晶得1.1g淺白色固體。產率：42％，esi-msm/z：337.4[m+h+]。4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)-n-羥基苯甲醯胺(i1)羥胺鉀(nh2ok)溶液的製備：14ml氫氧化鉀的飽和無水甲醇溶液滴加到24ml含有4.67g(67mmol)鹽酸羥胺的無水甲醇溶液中，控制內溫低於40℃，滴加完畢，冷卻反應液，濾除白色氯化鉀沉澱，所得濾液密閉保存備用。甲基4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)苯甲酸酯(0.67g,2mmol)溶於10ml無水甲醇後，向其中加入3.5ml上述羥胺鉀(nh2ok)溶液。0.5小時後，蒸除甲醇，2mol/l的鹽酸溶液酸化至ph3-4，然後用乙酸乙酯萃取，合併乙酸乙酯層後用飽和食鹽水洗滌，經無水硫酸鎂乾燥，蒸乾溶劑得粗品，粗品經乙酸乙酯重結晶得0.34g白色粉末。產率：49％。esi-msm/z：338.4[m+h+]。1hnmr(400mhz,dmso)δ11.07(s,1h),10.77(s,1h),10.08(s,1h),8.91(s,1h),7.70-7.63(m,4h),7.52(d,j＝7.9hz,1h),7.33(d,j＝8.1hz,1h),7.13(d,j＝2.1hz,1h),7.05(dd,j＝11.1,4.0hz,1h),6.96(dd,j＝10.9,3.9hz,1h),2.72(dd,j＝20.2,12.8hz,2h),2.38(dd,j＝20.0,12.6hz,2h),2.12–1.81(m,2h).實施例2.本發明化合物的合成甲基4-((4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)亞甲基)苯甲酸酯吲哚丁酸(1.0g,5mmol)溶於25ml四氫呋喃中，加入三乙胺(0.55g,5.5mmol)，加入o-苯並三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(tbtu)(1.8g,5.5mmol)。室溫反應20分鐘後，加入甲基4-(氨基甲基)苯甲酸酯鹽酸鹽(1.0g,5mmol)，再加三乙胺(0.5g,5mmol)。室溫反應6小時後，蒸除反應液中的四氫呋喃，用乙酸乙酯溶解產物，分別用1mol/l的檸檬酸溶液，飽和碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水各洗滌3遍，無水硫酸鎂乾燥，蒸乾溶劑得粗品，粗品經乙酸乙酯重結晶得1.3g淺白色固體。產率：57％，esi-msm/z：351.4[m+h+]。4-((4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)亞甲基)-n-羥基苯甲醯胺(i2)甲基4-((4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)亞甲基)苯甲酸酯(0.81g,2mmol)溶於10ml無水甲醇後，向其中加入3.5ml上述羥胺鉀(nh2ok)溶液。0.5小時後，蒸除甲醇，2mol/l的鹽酸溶液酸化至ph3-4，然後用乙酸乙酯萃取，合併乙酸乙酯層後用飽和食鹽水洗滌，經無水硫酸鎂乾燥，蒸乾溶劑得粗品，粗品經乙酸乙酯重結晶得0.41g白色粉末。產率：48％。esi-msm/z：352.4[m+h+]。1hnmr(500mhz,dmso)δ11.15(s,2h),10.74(s,1h),8.98(s,2h),8.36(t,j＝5.9hz,1h),7.79(dd,j＝96.4,8.2hz,2h),7.45(t,j＝20.7hz,1h),7.32(dd,j＝21.5,12.1hz,3h),7.09(d,j＝1.5hz,1h),7.04(t,j＝7.5hz,1h),6.94(dd,j＝18.3,11.1hz,1h),4.44–4.16(m,2h),2.67(t,j＝7.5hz,2h),2.24(dd,j＝34.7,27.3hz,2h),1.96–1.80(m,2h).實施例3.本發明化合物的合成(e)-甲基3-(4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)苯基)丙烯酸酯吲哚丁酸(1.0g,5mmol)溶於25ml四氫呋喃中，加入三乙胺(0.55g,5.5mmol)，加入o-苯並三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(tbtu)(1.8g,5.5mmol)。室溫反應20分鐘後，加入(e)-甲基3-(4-氨基苯基)丙烯酸酯(1.1g,5mmol)，再加三乙胺(0.5g,5mmol)。室溫反應6小時後，蒸除反應液中的四氫呋喃，用乙酸乙酯溶解產物，分別用1mol/l的檸檬酸溶液，飽和碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水各洗滌3遍，無水硫酸鎂乾燥，蒸乾溶劑得粗品，粗品經乙酸乙酯重結晶得1.2g淺白色固體。產率：49％，esi-msm/z：363.4[m+h+]。(e)-n-(4-(3-(羥基胺基)-3-羰基丙-1-烯-1-基)苯基)-4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺(i3)(e)-甲基3-(4-(4-(1h-吲哚-3-基)丁醯胺基)苯基)丙烯酸酯(0.82g,2mmol)溶於10ml無水甲醇後，向其中加入3.5ml上述羥胺鉀(nh2ok)溶液。0.5小時後，蒸除甲醇，2mol/l的鹽酸溶液酸化至ph3-4，然後用乙酸乙酯萃取，合併乙酸乙酯層後用飽和食鹽水洗滌，經無水硫酸鎂乾燥，蒸乾溶劑得粗品，粗品經乙酸乙酯重結晶得0.35g白色粉末。產率：44％。esi-msm/z：364.4[m+h+]。1hnmr(500mhz,dmso)δ10.76(s,1h),10.68(s,1h),10.03(s,1h),8.98(s,1h),7.64(d,j＝8.3hz,2h),7.50(dd,j＝16.6,8.1hz,3h),7.38(d,j＝15.7hz,1h),7.32(d,j＝8.1hz,1h),7.11(d,j＝15.2hz,1h),7.06(dd,j＝16.8,9.5hz,1h),6.96(t,j＝7.4hz,1h),6.34(d,j＝15.8hz,1h),2.88–2.61(m,2h),2.38(t,j＝7.4hz,2h),2.03–1.81(m,2h).實施例4目標化合物抑制組蛋白去乙醯化酶活性試驗(invitro)組蛋白去乙醯化酶(hdacs)活性螢光分析方法主要分兩步：第一步，含一個乙醯化側鏈的賴氨酸hdacs螢光底物(boc-lys(acetyl)-amc)，用含組蛋白去乙醯化酶的hela細胞提取物樣本(包含hdac1,hdac2,hdac3和hdac8)孵育，使底物脫去乙醯基，激活底物。第二步，用胰酶水解boc-lys-amc，產生amc這一螢光基團(即發色團)，在發射波長/激發波長(390nm/460nm)測定螢光強度，從而根據抑制劑組及對照組的螢光強度計算抑制率，並求算ic50值。酶活性測試原理見本專利說明書部分相關內容。實驗結果見表1。表1.體外抑酶試驗結果化合物i1i2i3i4i5i6i7i8i9sahaic50(μm)0.140.210.190.220.350.170.190.250.461.05saha商品名為zolinza，通用名為vorinostat，為美國食品藥品監督管理局(fda)於2006年批准上市的組蛋白去乙醯化酶抑制劑。上述測試結果表明，吲哚丁酸類化合物表現出對組蛋白去乙醯化酶較強的抑制活性，並且在測試中對組蛋白去乙醯化酶的抑制活性優於陽性對照藥vorinostat(saha)，具有良好的開發前景，並可作為發現新型高效組蛋白去乙醯化酶抑制劑的先導化合物。實施例5目標化合物抑制細胞增殖的活性試驗(invitro)對吲哚丁酸類組蛋白去乙醯化酶抑制劑進行體外抑制癌細胞增殖的活性試驗，結果見表2。術語說明：u937：人組織細胞淋巴瘤細胞株。k562：人紅白血病細胞株。hl60：人急性白血病細胞株。saha：商品名為zolinza，通用名為vorinostat，為美國食品藥品監督管理局(fda)於2006年批准上市的組蛋白去乙醯化酶抑制劑。dmso：二甲基亞碸。ic50：半數抑制濃度。1.[材料]u937，k562，hl60細胞株，四甲基偶氮唑藍mtt，10％胎牛血清，96孔板。2.[方法]細胞培養u937，k562，hl60三種腫瘤細胞株都採用常規培養。實驗時均用對數生長期細胞。細胞生長檢測(mtt法)u937，k562，hl60細胞懸液均調整至1×105/ml，分別接種於96孔板(50μl/孔)，5000個細胞/孔。鋪板4h後，每孔中加入50ul含不同濃度化合物的培養基，使孔中化合物終濃度分別為：1000、200、40、8、1.6、0.32ug/ml，每個濃度設三個復孔，不加細胞的孔讀數時作空白，加細胞不加化合物的孔作化合物空白孔，saha作化合物陽性對照。於37℃，5％二氧化碳中孵育48h，每孔加入10μl0.5％的mtt染色液，繼續孵育4h後，2500rpm，離心30min，然後拋棄板孔中培養基，加入二甲基亞碸，200ul/孔。酶標儀上於570nm處測定每孔的吸光度od值，細胞生長抑制率按下式計算：表2細胞增殖實驗結果a表中數值為三次試驗的平均值，「±」後的數值表示標準偏差。上表測試數據表明，多個吲哚丁酸類組蛋白去乙醯化酶抑制劑在體外抗腫瘤細胞增殖的試驗中顯示出優於陽性對照saha的活性，具有良好的開發前景。當前第1頁12