耐熱酯水解酶TClipA3及其編碼基因和應用的製作方法

2023-09-14 07:13:45

專利名稱：耐熱酯水解酶TClipA3及其編碼基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及耐熱酯水解酶TClipA3及其編碼基因和應用。
背景技術：
酯水解酶是自然界最廣泛存在的水解酶之一，它們廣泛的分布於動物，植物以及微生物中。此類酶主要是起分解疏水性脂肪和酯類物質作用，在生物體碳源利用，致病和細胞解毒等方面都發揮著重要的生理學機能。酯水解酶的種類繁多，胺基酸序列差別明顯，但從酶分子的三級結構上看它們都具有典型的α/β水解酶摺疊結構，在催化反應上都遵循絲氨酸水解酶的反應機制，既催化結構域包含絲氨酸-組氨酸-穀氨酸(或天冬氨酸)三聯體活性中心結構並在絲氨酸活性位點附近存在絲氨酸水解酶的特徵保守序列G-X-S-X-G。細菌來源的酯水解酶是自然界來源最為豐富，目前研究最多的水解酶群體。截止目前細菌來源的酯水解酶根據其蛋白序列的特徵已經可以劃分成十三個大的家族，其中包括一個真脂肪酶家族和十二個酯酶家族，隨著更多的酯水解酶基因從微生物中發掘出來， 新的家族也將不斷的湧現。細菌來源的酯水解酶具有較高的催化活性，立體選擇性，穩定性等特點，一直以來就是生物催化工業的寵兒，被廣泛的應用於食品加工、去垢劑生產、造紙業、醫藥和化妝品、手性化合物合成等行業。由於在工業加工過程中需要用到較高的反應溫度和高有機溶劑的濃度等惡劣條件，使得常溫微生物來源的酯水解酶快速失活從而制約了此類酶的應用，因此能夠耐高溫和耐有機溶劑等的酯水解酶在工業應用上急待發掘。嗜熱微生物是一類生活在高溫環境中的極端微生物，各個細胞組分都進化出在高溫條件下發揮正常生理學功能的同時也能保持極高的熱穩定性。嗜熱微生物體內各種酶也都往往表現了較好熱穩定性和有機溶劑耐受性，因此嗜熱微生物為工業應用高穩定性酯水解酶資源的挖掘提供了有利條件。已經有多種來源於嗜熱微生物的耐熱酯水解酶已經被純化表徵，其中包括來自發光古球菌，熾熱球菌，嗜熱桿菌嗜酸熱硫化葉菌酯水解酶。

發明內容
本發明的目的是提供耐熱酯水解酶TClipA3及其編碼基因和應用。本發明提供的酯酶TClipA3，來自騰衝嗜熱桿菌(Thermoanaerobactertengconge nsis)MB4，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯水解酶活性的由序列1衍生的蛋白質。序列1所示的蛋白由414個胺基酸殘基組成。為了使(a)中的蛋白便於純化，可在由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1 標籤的序列
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯水解酶活性的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有酯水解酶活性的蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有酯水解酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將權利要求2或3所述基因插入pET28a質粒的多克隆位點得到的重組質粒。
6.如權利要求4所述的重組菌，其特徵在於所述重組菌是將權利要求5所述重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)得到的。
7.一種製備酯水解酶的方法，是培養權利要求4或6所述的重組菌，得到酯水解酶。
8.擴增權利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對。
9.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因、權利要求4、5或6所述重組表達載體、所述表達盒、所述轉基因細胞系或所述重組菌中的任意一種在降解酯類中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於應用權利要求1所述蛋白降解所述脂類時，溫度為60-90°C，pH為8. 5-11 ；所述脂類為如下任意一種對硝基苯酚乙酸酯、對硝基苯酚丁酸酯、對硝基苯酚己酸酯、對硝基苯酚辛酸酯、對硝基苯酚癸酸酯、對硝基苯酚月桂酸酯、三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯或三辛酸甘油酯。
全文摘要
本發明公開了一種耐熱酯水解酶TClipA3及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯水解酶活性的由序列1衍生的蛋白質。所述蛋白的編碼基因、以及含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的保護範圍。所述蛋白、所述基因、所述重組表達載體、所述表達盒、轉基因細胞系或重組菌均可應用於降解脂類。本發明的蛋白可應用於食品加工、洗滌劑，醫藥化妝品、化合物製備等行業。
文檔編號C12N5/10GK102399761SQ20101028243
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月14日 優先權日2010年9月14日
發明者薛豔芬, 饒朗, 馬延和 申請人:中國科學院微生物研究所