一種油菜促分裂原活化蛋白激酶基因及其編碼蛋白的製作方法
2023-09-19 22:49:00 2
專利名稱：一種油菜促分裂原活化蛋白激酶基因及其編碼蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及油菜促分裂原活化蛋白激酶基因，具體地說是一種來源於油菜滬油15品種(Brassica n即us H)的油菜促分裂原活化蛋白激酶基因。
背景技術：
油菜促分裂原活化蛋白激酶((Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK)是真核生物(油菜)中普遍存在的一類蛋白，是真核生物信號傳遞網絡中的重要元件之一，與油菜的抗病害活性緊密相關。近幾年來研究發現，MAPK信號鏈在茉莉酸信號途徑和水楊酸信號途徑介導的抗真菌、抗病毒等植物防衛反應過程中均起重要作用，但在油菜中的具體功能尚不太清楚，尤其是在殼寡糖誘抗中的作用尚無報導。
發明內容
本發明提供一種油菜促分裂原活化蛋白激酶基因及其編碼蛋白，並揭示了油菜促
分裂原活化蛋白激酶基因與殼寡糖誘導油菜抗病性之間的關係。本發明基因是抗病信號傳
導過程中的重要節點基因，利用過表達等轉基因技術構建其轉基因突變株，並進行後續遺
傳育種，可以開發出提高植物免疫響應能力的新型抗病油菜品種。 為實現上述目的，本發明採用的技術方案為 —種油菜促分裂原活化蛋白激酶基因，其具有序列表SEQ ID NO :1中鹼基序列，其編碼蛋白具有序列表SEQ ID NO :2中胺基酸序列。 —種油菜(甘藍型)促分裂原活化蛋白激酶基因的cDNA的克隆
1). 50mg/L的殼寡糖噴施油菜葉片，噴水作對照，在lh取樣提取總RNA，進一步提取mRNA進行基因晶片雜交實驗，從差異克隆挑選出一個片斷與擬南芥AtMPK4基因同源性高達94% ; 2).利用大連寶生物工程有限公司(TAKARA)公司的RNA PCR KIT (AMV) Ver. 3. 0試劑盒獲得油菜BnMPK4基因的3'端序列； 3).利用TAKARA公司的5' -Full RACE Kit試劑盒獲得油菜BnMPK4基因的5'端及cDNA全長，進一步推導出胺基酸序列； 4).可被殼寡糖誘導的甘藍型油菜MPK4基因具有以下cDNA鹼基和蛋白質的胺基酸序列； 5).根據甘藍型油菜MPK4基因的cDNA全長序列和表達載體pGEX_4T_l的特點，設計MPK4基因原核表達的PCR引物序列，以甘藍型油菜總RNA為模板擴增待表達的基因片段，克隆到表達載體pGEX-4T-l上，轉化表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)誘導表達，表達出與預期蛋白相符的目的蛋白； 6).由原核表達得到的目的蛋白，通過結晶體衍射等方法得到其空間結構。
本發明優點如下對生物農藥的應用具有明顯指導作用；該基因的克隆對於揭示
殼寡糖誘導植物抗性反應的分子信號通路很有價值，並在寡糖生物農藥的應用方面具有重要的理論指導意義。
圖1為RNA電泳圖，C對照，T處理；
圖2為油菜晶片雜交結果； 圖3PCR獲取BnMPK4全長及重組質粒pMD 18-BnMPK4的PCR鑑定； 圖4. BnMPK4基因及其在植物種間同源序列的進化樹； 圖5殼寡糖處理後BnMPK4mRNA水平變化； 圖6重組蛋白GST-BnMPK4純化結果的SDS-PAGE分析； 圖7. BnMPK4空間結構。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的闡述
實施例1 —種油菜(甘藍型)促分裂原活化蛋白激酶基因(MPK4)的cDNA序列，具有序列表SEQ ID NO :1中鹼基序列；序列特徵1332bp、線性雙鏈，最初來源於甘藍型油菜滬油15(Brassica n即us H);—種油菜(甘藍型)促分裂原活化蛋白激酶基因(MPK4)的的胺基酸序列具有序列表SEQ ID N0:2中胺基酸序列，線性、單鏈、373胺基酸。
實施例2基因晶片差異顯示獲得cDNA片斷序列
材料 油菜品種滬油15於溫室中培養至幼苗為4-5片葉時，葉面噴施50mg/L殼寡糖，葉面噴施雙蒸水作為對照，在1小時取材。
總RNA提取，定量與完整性檢測 用雙蒸水洗去葉表面塵土，在液氮中研磨，用TRIZOL(Gibco BRL)試劑提取RNA。(1)定量測260、280nm處的吸光值，計算A26。/A28。的值以估計總RNA的純度。通過A26。的值計算總RNA的量。(2) RNA完整性檢測在1 %甲醛變性瓊脂糖凝膠上分離總RNA，有兩條清晰的帶，且大分子量(28SrRNA)的亮度近似為小分子量(18SrRNA)的亮度的2倍，說明總RNA完整(圖1)。
基因晶片差異顯示 利用上海聯合基因公司的甘藍型油菜cDNA晶片，分別與殼寡糖處理組及對照組進行雜交實驗(圖2)，得到393個差異片斷。從中篩選出一個與擬南芥MPK4基因同源性高達94%的446bp的基因序列片斷 圖2油菜晶片雜交結果。殼寡糖處理樣品標記紅螢光(Cy5)，對照標記綠螢光
4(Cy3);晶片上紅色點代表殼寡糖處理樣品中表達水平高，綠色點代表對照樣品中表達水平
高，黃色點代表兩者表達水平相當 實施例3:3'末端的克隆 利用Takara的RNA PCR KIT (AMV) Ver. 3. 0試劑盒，使用依據上文中得到的cDNA片斷設計的引物TTGTATCAATTGTTGCGTGGA及試劑盒自帶引物M13Primer M4，利用Takara的LA Taq酶進行PCR(95。C變性5分鐘；92。C 30秒，52°C 30秒，72°C 2分鐘為一個反應循環，重複30次；72t:延伸10分鐘；)得到了此片段的3'端。瓊脂糖凝膠檢測後，進行膠回收，回收產物連接到PMD 18-T載體(Takara)上。將連接產物轉化大腸桿菌ToplO，經藍白斑篩選，挑取10個白斑液體擴大培養並提取質粒，經PCR(95t:變性5分鐘；92°C 30秒，52°C 30秒，72t: 2分鐘為一個反應循環，重複30次；72t:延伸10分鐘；)鑑定後，由上海生工生物工程公司測序，得到了此cDNA片斷的3'端 實施例4:5'末端的克隆 cDNA5'末端快速擴增按照TAKARA公司的5'-Full RACE Kit擴增試劑盒說明書進行。擴增產物經1 %瓊脂糖電泳檢測並純化後連接到PMD18-T載體上，轉化大腸桿菌ToplO，藍白斑篩選及PCR鑑定後，由上海生工生物工程公司測序。獲得5'端序列
AACGCTT 實施例5 :全長的克隆 依據上文得到的5 ' 、3 ' 端序列，設計引物對GTGCGTCTTGGTTTCCGAT，ACTCTCCCTTACTGAGGATTGAACT利用Takara的LA Taq酶進行PCR，同上膠回收、轉化質粒、PCR驗證後(圖3)，由上海生工生物工程公司測序，結合5' 、3'端序列信息得到了此cDNA全長；
0041] 序列表SEQ ID NO :1中鹼基序列CTGAGAAATTAAAACGCAAAAAAAAAAAAAA 將所獲得的cDNA全長利用NCBI的Blast程序與基因資料庫Genebank進行比對，發現其與植物MAPK基因具有同源性(圖4)，與擬南芥的MPK4基因(NM_116367)同源性最高達93%。在其胺基酸序列中發現含有保守的MAPK保守區域TEY。故將此基因命名為BnMPK4登陸到Genebank (DQ206628)。 實施例6 :殼寡糖誘導下不同時間BnMPK4的mRNA表達水平變化 油菜品種滬油15於溫室中培養至幼苗為4-5片葉時，葉面噴施50mg/L殼
寡糖，對照植株葉面噴施雙蒸水，在15、30分鐘、1-168小時分別取材。設計引物對
5' GCGTCTTGGTTTCCGATTC 3' ;5' CGAGGTTTGGTTAGAGCGTAT 3'利用Takara的rTaq酶進行
PCR擴增，1X瓊脂糖電泳檢測；以油菜Actin基因作為內標。結果顯示BnMPK4的mRNA水
平可被殼寡糖迅速誘導(圖5)，在30分鐘時達到高峰。 實施例7 :BnMPK4蛋白的原核表達 根據甘藍型油菜BnMPK4基因的cDNA全長序列設計BnMPK4基因原核表達的PCR引物序列，在引物MPK4es和MPK4ea的5'端引入了 EcoR I和Xholl酶切位點(下劃線部分)，引物序列如下MPK4上遊表達引物(MPK4es) 5' GCGAATTCATGTCGGCGGAGA 3' ;MPK4下遊表達引物(MPK4ea) 5，GCGTCGACCCTTACTCGAGGATTGA 3'，以甘藍型油菜總RNA為模板擴增待表達的基因片段，將PCR反應擴增的目的片段回收後和pGEX-4T-l載體在50ul反應液體系中用EcoR I和Xho I酶切，將酶切後的PCR產物克隆到表達載體pGEX-4T-l上，轉化表達菌株BL21 (DE3)誘導表達。將表達菌BL21 (DE3) /pGEX-4T-l-BnMPK4及相應的空載體菌接在LB液體培養基/Amp中，37t:培養過夜，OD值達到0. 5-0. 6時用終濃度為lmmol/L的IPTG誘導表達，持續振蕩培養4h。將1. 4ml培養液8000rpm離心10min，將上清轉入另一EP管，200iU無菌雙蒸水和50iU的5XSDS上樣緩衝液吹打懸浮細菌，沸水浴10min，12000rpm離心lmin，取15 yl上清液進行SDS-PAGE凝膠電泳。結果擴增出預期的目的蛋白，利用Glutathione S印harose 4B進行純化得到GST-BnMPK4融合蛋白(圖6)。
6
序列表SEQ ID NO :2中胺基酸序列 實施例8 :BnMPK4蛋白的空間結構 BnMPK4蛋白的三維結構如圖7 :保守區域TEY和C端錨定保守區域用粗體標出(圖7)，其三維結構與目前發現的動物及植物MAPK蛋白類似。綜上所述，申請人利用分子生物學技術從油菜中克隆得到了一個新的MAPK基因BnMPK4，研究了其序列及結構特性，確定了其與油菜抗病性之間的關係。 本發明基因是抗病信號傳導過程中的重要節點基因，利用過表達等轉基因技術構
建其轉基因突變株，並進行後續遺傳育種，可以開發出提高植物免疫響應能力的新型抗病
油菜品種。在今後生產實踐中種植此提高抗病性的油菜品種，可以減少農藥使用，從而減輕
環境汙染及農民負擔，對推廣我國綠色農業大有裨益，總而言之，此項發明具有長遠的經濟
和社會價值。 Untitled. ST25 SEQUENCE LISTING 〈110〉中國科學院大連化學物理研究所 〈120〉 一種油菜促分裂原活化蛋白激酶基因及其編碼蛋白 〈130〉 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>1332
〈212>DNA 〈213〉甘藍型油菜滬油15(Brassica napus H) 〈220〉 〈221>CDS 〈222>(70). (1188) 〈223〉 〈400〉 1 gggcgtgcgt cttggtttcc gattcaattc gatttttgte ggggttteaa tcacaaggte 60
agcteagct atg tcg gcg gag aac tgt ttt ggc ggc ggc ggt ggt gat cag 111
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10
Ser Leu Thr Glu Glu Asn lie Lys Glu Leu lie Tyr Arg Glu Thr Val
355 360 365 Asn Phe Asn Pro Gin
370
權利要求
一種油菜促分裂原活化蛋白激酶基因，其特徵在於具有序列表SEQID NO1中鹼基序列。
2. 按照權利要求1所述油菜促分裂原活化蛋白激酶基因的編碼蛋白，其特徵在於具有序列表SEQ ID NO :2中胺基酸序列。
全文摘要
本發明涉及一種油菜促分裂原活化蛋白激酶基因(Mitogen ActivatedProtein Kinase，MAPK)；具體地說是真核生物(油菜)中普遍存在的一類蛋白，是真核生物信號傳遞網絡中的重要元件之一，與油菜抵禦病蟲害緊密相關，其核苷酸序列和胺基酸序列如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本發明優點如下對生物農藥的應用具有明顯指導作用；該基因的克隆對於揭示殼寡糖誘導植物抗性反應的分子信號通路很有價值，並在寡糖生物農藥的應用方面具有重要的理論指導意義。
文檔編號C12N15/10GK101768595SQ20081023031
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月29日 優先權日2008年12月29日
發明者尹恆, 李曙光, 杜昱光, 白雪芳, 趙小明 申請人:中國科學院大連化學物理研究所