連接豌豆營養生長特異因子基因序列和啟動子的方法
2023-06-20 19:15:31
專利名稱：連接豌豆營養生長特異因子基因序列和啟動子的方法
技術領域：
本發明所屬的技術領域為生物技術。
本發明提供一種編碼控制植物生長發育的膜蛋白的基因的應用方法，並由此提供一條能夠人為控制細胞衰老特性的易於操作的途徑。
本發明的背景1995年，Gan和Amasino首次發表研究報告，證實用受發育過程特異誘導表達的啟動子(SAG12)指導細菌異戊烯轉移酶(isopentenyl transferase)基因，可導致轉基因植物發育後期細胞分裂素含量顯著提高，從而延緩葉片衰老(Gan，S.和Amasino，R.M.，Science，1995，271986-1988)。1999年，Ori等人又發表論文，證實用SAG12啟動子指導同源域基因Knotted1表達，也能明顯延緩轉基因菸草葉的衰老(Ori，N等，The Plant Cell，1999，111073-1080)。同年，Dai等人也發表論文，宣稱在番茄中過量表達擬南芥己糖酸化酶基因，導致轉基因植物衰老研究，已成為一個熱門課題(Dai，N.和Schaffer，S.等，The Plant Cell，1999，111253-1266)。不少作者相續報導了不同基因或不同成份對植物生長發育的調控作用(Gan，S.和Amasino R.M.，Plant Physiology，1997，113313-319；Lers，A.和Khalhalchitski，A.，1998，Plant Molecular Biology，36439-449)。但是，除了極少數報導，如擬南芥己糖磷酸化酶基因之外，現有基因的主要功能是延緩植物葉片衰老，而能夠對植物生長發育全過程起調控作用的並不多見。即使上述己糖磷酸化酶，也只能被用來誘導植物衰老，而不能被用來延緩植物衰老。因為一旦破壞己糖磷酸化酶的功能，植物就不能正常生長發育。
長期以來，G2豌豆突變體由於其獨特的遺傳性狀而成為植物生理學研究的一個熱點問題。該豌豆的主要特徵如下(1)長日照(long-day，LD)條件下，G2豌豆的生長發育特性與野生型豌豆相同，開花後頂端很快衰老，導致整個植株死亡。短日照(short-day，SD)條件下，G2豌豆則表現出無限生長的趨勢；(2)無論在LD還是SD條件下，G2豌豆都能順利地進行生殖生長。雖然長日照條件下種子發育速率顯著快於短日照植物，但SD條件下G2豌豆同樣能產生大量的花和種子，說明發育與生殖生長並不是決定植物細胞衰老進程的根本原因；(3)G2豌豆對光周期的反應是定量的，黑暗條件下短暫時間的光處理不會逆轉其生長習性；(4)G2豌豆的光周期反應是可遺傳的、永久性的，不會因為植物的世代交替而丟失。
對不同的G2豌豆進行細胞學分析表明，該突變株系經LD誘導後發生不可逆程序性變化，植株頂端由非決定態花序結構轉變為決定態花序結構，導致頂芽不可能進一步產生新的節位，從而由發育上的衰老非決定態轉變為衰老決定態。SD條件下生長的G2豌豆，其頂芽在發生從營養芽向花序結構的轉變後滯留在非決定態，而不是進一步發育成決定態花序。那麼，引起這一不可逆程序性變化的根本原因是什麼，主要有哪些基因參與控制了這一決定性的形態變化？本發明希望運用現代分子生物學技術，特別是生物工程技術，克隆控制該豌豆短日不衰老性狀的基因或基因群，從而闡明單花期植物生長發育與衰老的基本規律。
本發明所涉及的豌豆營養生長特異因子基因(Pisum Post floral，PPF1基因。其DNA序列如SEQ NO 1所示，本基因序列的EMBL Bank登錄號為Y12618)是一個能明顯延緩植物衰老的基因，它所編碼的蛋白是一個葉綠體膜蛋白(其蛋白質序列如SEQ NO 2所示，本蛋白質序列的EMBL Bank登錄號為Y12618)，據推測具有鈣離子通道蛋白或鈣離子泵的功能。該基因的一個功能性融合基因是由PPF1基因的5』端膜定位區和位於基因中央的4個較為保守的穿膜區融合而成(見圖2所示)。在轉基因植物體內過量表達該基因，葉肉細胞內鈣離子水平就不會在生殖生長開始以後逐漸升高，細胞中核DNA發生降解的時間就會顯著推遲，受體植物的生長發育變慢。分析表明，PPF1基因可能是第一個參與細胞衰老調控並由核DNA編碼的葉綠體蛋白基因。
本發明的目的是提供一種編碼控制植物生長發育的膜蛋白的基因的應用方法，並由此提供一條能夠人為控制植物細胞衰老特性易於操作的途徑。
本發明的技術方案1.對短日不衰老G2豌豆突變系進行cDNA差示分析(cDNA RepresentationalDifference Analysis，RDA)，克隆得到短日照條件下開花後優勢表達的豌豆基因PPF1(如SEQ NO 1所示，EMBL Bank登錄號Y12618)。
用cDNA差示分析(RDA)法進行豌豆基因克隆的基本步驟為(1)提取不同生長期(開花前、開花後)豌豆細胞內的總RNA，反轉錄成cDNA以後用四鹼基切割酶消化，以降低整個cDNA群體的複雜性；(2)分別將上述兩組cDNA加上不同的接頭序列後按1∶100(開花後∶開花前)的比例混合，95℃高溫處理使DNA變性成單鏈，再緩慢降溫到68℃並維持12小時，使體系中的DNA重新成為雙鏈；(3)PCR擴增。由於開花前後豌豆細胞中絕大部分mRNA是相同的，根據反應動力學原理，開花後樣品中的絕大部分cDNA將與開花前樣品形成雜合雙鏈，只有開花後特異表達的基因，因為無法在開花前的樣品中找到相互補的cDNA鏈，無法形成雜合鏈。所以，當用開花後樣品特異性接頭序列作為PCR引物，擴增上述變性後恢復成雙鏈的樣品，絕大部分cDNA只能按線性形式擴增(因為只有一條鏈上帶有與引物相匹配的接頭序列，另一條鏈來自開花前樣品，不能與所用引物相互補)。由於開花後特異表達基因的兩條鏈上都帶有與引物相匹配的接頭序列，它們能被按指數形式擴增，經過20-25個循環，開花後特異表達基因被富集數十萬至上百萬倍，而非特異性表達基因僅僅增加了20-25倍。經過3輪重複性雜交和PCR擴增，反應體系中幾乎百分之百都是開花後特異性表達的基因片段；(4)克隆這些片段後用Northern雜交法驗證其表達特性並以其中一個片段為探針，篩選豌豆cDNA文庫，獲得開花後特異性表達基因PPF1。
研究表明，PPF1基因擁有一個1329鹼基對(bp)的開放讀碼框；PPF1蛋白擁有442個胺基酸，是一個跨膜蛋白。計算機結構預測表明，該蛋白的中央區段可以形成4個穿膜區；該蛋白的氨基端擁有一個信號肽，保證該蛋白能被有效而準確地定位於葉綠體膜上。雖然目前尚不清楚PPF1基因的作用機制，但本發明發現正向表達PPF1的轉基因擬南芥細胞內，鈣離子濃度長期保持比較低的水平，而對照組植物開花後細胞內鈣離子濃度迅速升高，導致DNA過早降解，保衛細胞氣孔關閉。因此，可以認為PPF1基因產物是一個鈣通道蛋白或者是鈣離子泵，細胞通過調節鈣離子水平來控制個體的生長發育與衰老進程。
2.將用上述方法所克隆的PPF1基因按正方向或反方向分別插入帶有35S啟動子的植物轉化中間載體pE3中(如附圖1A、1B所示)，用農桿菌法轉化模式植物擬南芥，連續自交3代，篩選純合的具有明顯表現型的轉基因植物並進行育種和應用推廣工作。
本發明的本實驗步驟所用的實驗試劑包括(全部要求無菌)(1)LB培養基10g胰化蛋白腖，5g酵母提取物，5g氯化鈉，1mL 1mol/lNaOH，加水定容到1000ml；(2)1/2MS培養液2.22g MS粉末，15g蔗糖，pH5.8，加水定容到1000ml；(3)MS固體培養基4.4g MS粉末，30g蔗糖，pH5.8，加水定容到1000ml；(4)T1培養基MS固體培養基+1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，pH5.6-5.8；(5)T2培養基T1培養基+500mg/L羧苄青黴素；(6)T3培養基T1培養基+100mg/L卡那黴素，500mg/L羧苄青黴素；(7)T4培養基MS固體培養基+100mg/L卡那黴素；
(8)6-BA母液用水定容到1mg/ml；(9)NAA母液用水定容到1mg/ml。
2.本步驟的具體操作為(1)分別PPF1基因按正向和反向模式克隆到植物轉化中間載體pE3上，轉化農桿菌後接種於含抗生素的LB培養液中，28℃振蕩培養24-36小時，取5ml菌液離心(4000g，10分鐘)，用1/2MS培養液洗滌菌體後再離心，將菌體懸浮於20-40ml1/2MS液體中(OD600＝0.5)。取已培養好的無菌菸草小苗的葉片，剪成1cm2左右的小塊，放入前述稀釋後的農桿菌液中，浸泡3-5分鐘。
(2)取出葉塊，用滅菌濾紙吸乾多餘的菌液，放在鋪有一層無菌濾紙的T1培養基上，28℃暗培養48小時。將葉塊轉入T2培養基中，25-28℃光下培養24小時。
(3)將葉塊轉入T3培養基中，25-28℃光下培養，約15天後葉塊切口處有愈傷生成。
(4)28℃繼續培養，每10天左右換一次新鮮培養基，愈傷逐漸分化形成芽點，1-2月後，芽長成2-3cm高的小苗。
(5)切下較大的植株，轉入T4培養基中，10天左右開始生根，待根系發達時，將苗轉入滅菌土中，在高溼度的溫室中培養1周，煉苗後再移至常規溫室中培養。
本步驟的結果是正向表達PPF1基因，能顯著延緩轉基因擬南芥的開花和生長發育進程，推遲其衰老；反向表達PPF1基因，導致擬南芥固有基因失活，則明顯提早轉基因植物的開花期，加速了這些植株的衰老。
將PPF1基因的不同區域分別與綠色螢光蛋白(GFP，Green fluorescenceprotein)報告基因連接後插入植物轉化中間載體pE3中並轉化擬南芥，獲得轉基因植物後在螢光下檢測發現，由於PPF1基因的牽引，GFP所發出的螢光大量集中在葉綠體膜上。膜定位信號位於PPF1基因的5』端上遊區，該基因的3』端下遊區不具備膜定位功能。如果植物轉化載體中只帶有GFP基因，那麼，細胞的各個部分都會由於表達該基因而發出綠色螢光。進一步的研究表明，無論去掉PPF15』端，使基因產物無法定位於葉綠體膜上，還是去掉該基因中央的穿膜區，破壞其可能的離子通道功能，最終都導致PPF1基因功能的徹底消失。與對照組相比，這些轉基因植物的生長發育特性基本沒有變化，證明PPF1基因功能的正常發揮不但需要該蛋白的N-端以保證膜定位，還需要其穿膜區以形成有活性的通道，缺一不可(如圖2所示)。
本發明的有益效果到目前為止，控制植物衰老的技術(其中包括對相關基因的操縱)大部分只能延緩轉基因植物成熟葉片的衰老。導致轉基因個體衰老加速的己糖磷酸化酶基因，也不擁有強化植物個體營養生長的功能，因此在農業生產上沒有明顯的應用前景。而本發明所克隆的PPF1基因，卻具有保證植物個體旺盛營養生長的功能。例如，根據本發明的優選實施方案，帶有正向或反向PPF1基因的擬南芥都表現出十分明顯的生理特徵，從而從根本上改變了植物生長發育的進程。
一般情況下，擬南芥菜長到10-11片葉子時(發芽後30-35天)就開花了，而根據本發明的一個優選實施方案，正向表達PPF1基因的植株到14-15片葉子時(發芽後45天左右)才開花，營養生長十分旺盛所以可用於農業生產以發揮增產作用。根據本發明的一個優選實施方案，用反義RNA技術部分破壞PPF1基因表達，植物的整個生長發育過程明顯加快，長到6-7片葉子(發芽後20-25天)就開花了這個特性可被用於農作物有效生長期較短的地區。
應強調的是，只要把PPF1全長基因或其功能性融合基因(由PPF1基因的5』端膜定位區和位於基因中央的4個較為保守的穿膜區融合而成)按正向模式連接到如35S啟動子那樣能在各種植物組織和器官中高效表達的啟動子的下遊，構建成植物轉化中間載體，然後用農桿菌法、基因槍法或花粉管通道法將該基因導入葉菜類經濟作物基因組中，並篩選在整個生長期高效表達PPF1蛋白的轉基因植株，PPF1基因所介導的持續而旺盛的營養生長將大幅度提高轉基因植物單位面積綠色營養組織的產量，顯著提高葉菜類經濟作物的經濟效益。
農業上應用PPF1基因時，應把PPF1全長基因或其功能性融合基因分別與受不同環境因子或化學藥品誘導表達的啟動子相連接，構建成各種不同的植物轉化中間載體，然後用農桿菌法、基因槍法或花粉管通道法等方法，分別把受不同啟動子控制的PPF1基因導入植物基因組中，篩選得到轉基因植物，不但能通過控制該基因的表達強度來調節植物的營養生長與生殖生長之間的平衡，還能人為調節作物的生長周期，以獲取最大的經濟效益。
例如，根據本發明的優選實施方案，把PPF1全長基因或其功能性融合基因分別按正向或反向模式與溫度特異性表達的啟動子相連，保證在適宜於植物生長的溫度範圍內，轉基因植物中只表達PPF1基因的正向模式，支持宿主植物旺盛的營養生長，以獲得遲熟、高產的農作物新品種；而在低於最適生長溫度時，只有PPF1基因的反向模式得到表達，迅速中止宿主植物的營養生長狀態，進入生殖生長階段，繁殖種子並準備在溫度進一步降低時衰老死亡。採用這一類具有可調節生長周期的農作物新品種，既可最大限度地提高農作物產量，又可有效防止大規模減產或絕收。
依據同樣的原理，把PPF1基因按反向模式連接到受某些特殊化學物質誘導表達的啟動子之後，一旦預報植物生長後期將遇到低溫侵襲時，就可適量噴施該化學藥品，誘導PPF1基因按反向模式表達，促使宿主植物儘快中止營養生長階段，進入生殖生長階段，防止秋季早霜導致農作物大面積減產。
此外，把PPF1基因按正向或反向模式連接到受光周期誘導表達的啟動子之後，保證在光周期長於某個臨界日照長度時，PPF1基因的正向模式得到表達，支持宿主植物的營養生長。當光周期短於該臨界日照長度時，PPF1基因的反向模式得到表達，促使植物迅速進入生殖生長階段，在冬季嚴寒來臨之前最大限度地保留作物種子產量。
依據同樣的原理，把PPF1全長基因或其功能性融合基因按正向模式連接到受種子發育調控特異性表達的啟動子下遊，構建植物轉化中間載體並轉化受體植物，能在水稻、玉米、大麥、小麥、大豆、花生、香蕉、蘋果等種子或果實中過量表達並積累PPF1蛋白，以開發新型抗衰老保健食品。
或者，把PPF1全長基因或其功能性融合基因按正向模式連接到受生殖發育調控啟動子的下遊，構建植物轉化中間載體並轉化各種花卉植物，就可能顯著推遲花卉的凋謝時間，延長花卉開放周期。
或者，把PPF1全長基因或其功能性融合基因按正向模式連接到能在各種植物組織和器官中高效表達的啟動子(如35S啟動子)下遊，構建成植物轉化中間載體後轉化麻類、木本或竹科植物，能夠顯著促進這些轉基因植物的營養生長，推遲、抑制甚至關閉其生殖生長，增加植物的高度，改善品質，提高經濟效益。
根據動、植物在基因水平上存在較高同源性的原理，可知動植物基因在功能上有相當大的互補性，通過構建表達PPF1基因(包括PPF1全長基因或其功能性融合基因)的原核(大腸桿菌)或真核(酵母)的載體，發酵並純化PPF1蛋白，就可製成化妝品並直接用於人皮膚保養和護理，延緩人體表皮細胞的衰老，具有植物性來源即「綠色產品」的特徵。
進一步地，直接克隆PPF1基因在動物細胞中的同源序列，用該全長基因或其功能性融合基因轉化模式動物胚胎幹細胞後在轉基因動物中研究其生理功能，就可獲得PPF1在動物細胞中的同源基因或類似基因在延緩動物細胞衰老方面的作用。
圖1.植物轉化中間載體的構建。用Cla I酶切pE3載體，補平後再用KpnI切開，用EcoRI酶切克隆載體PBSPPF-1，補平後在用KpnI切開，將全長PPF1基因按正方向連接到載體上(A)；用KpnI和EcoRI酶切pE3載體，用KpnI和EcoRI酶切克隆載體PBSPPF-1，將全長PPF1基因按反方向連接到載體上(B)。
圖2.PPF1基因主要功能區DNA序列。A，PPF-1基因結構示意圖。B，SSP，分泌信號肽序列；C，跨膜區S1序列；D，跨膜區S2序列；E，跨膜區S3序列，F，跨膜區S4序列。
以下敘述本發明的實施例。應特別說明的是，本發明所提供的實施例只具有說明作用，而不構成對本發明的任何限制。
本發明實施例如下1.PPF1基因正向模式在菸草中的表達將PPF1基因按正向模式克隆到連接有35S啟動子的植物轉化中間載體pE3上，轉化農桿菌後接種於含抗生素的LB培養液中，28℃振蕩培養24-36小時，取5ml菌液離心(4000g，10分鐘)，用1/2MS培養液洗滌菌體後再離心，將菌體懸浮於20-40ml 1/2MS液體中(OD600＝0.5)。
取已培養好的無菌擬南芥小苗的葉片，剪成1cm2左右的小塊，放入前述稀釋後的農桿菌液中，浸泡3-5分鐘。取出葉塊，用滅菌濾紙吸乾多餘的菌液，放在鋪有一層無菌濾紙的T1培養基上，28℃暗培養48小時。將葉塊轉入T2培養基中，25-28℃光下培養24小時。將葉塊轉入T3培養基中，25-28℃光下培養，約15天後葉塊切口處有愈傷生成。28℃繼續培養，每10天左右換一次新鮮培養基，愈傷逐漸分化形成芽點，1-2月後，芽長成2-3cm高的小苗。切下較大的植株，轉入T4培養基中，10天左右開始生根，待根系發達時，將苗轉入滅菌土中，在高溼度的溫室中培養1周，煉苗後再移至常規溫室中培養。
篩選25個獨立轉化體的後代發現，其中19個株系有PPF1基因的穩定表達，基本符合單基因插入後3∶1分離規律。對照組擬南芥一般在發芽後30-35天開花，而轉基因植物基本在發芽後48-52天開花，生命周期明顯延長。因此可以得出，正向表達PPF1基因，能顯著延緩轉基因擬南芥的開花和生長發育進程，推遲衰老。
2.PPF1基因反向模式在擬南芥中的表達將PPF1基因按反向模式克隆到植物轉化中間載體pE3上，轉化農桿菌後接種於含抗生素的LB培養液中，28℃振蕩培養24-36小時，取5ml菌液離心(4000g，10分鐘)，用1/2MS培養液洗滌菌體後再離心，將菌體懸浮於20-40ml 1/2MS液體中(OD600＝0.5)。
取已培養好的無菌擬南芥小苗的葉片，剪成1cm2左右的小塊，放入前述稀釋後的農桿菌液中，浸泡3-5分鐘。取出葉塊，用滅菌濾紙吸乾多餘的菌液，放在鋪有一層無菌濾紙的T1培養基上，28℃暗培養48小時。將葉塊轉入T2培養基中，25-28℃光下培養24小時。將葉塊轉入T3培養基中，25-28℃光下培養，約15天後葉塊切口處有愈傷生成。28℃繼續培養，每10天左右換一次新鮮培養基，愈傷逐漸分化形成芽點，1-2月後，芽長成2-3cm高的小苗。切下較大的植株，轉入T4培養基中，10天左右開始生根，待根系發達時，將苗轉入滅菌土中，在高溼度的溫室中培養1周，煉苗後再移至常規溫室中培養。
篩選並純化轉基因植株後發現，反向表達PPF1基因，導致擬南芥固有基因失活，能明顯提早轉基因植物的開花期，加速這些植株的衰老。對照組擬南芥一般在發芽後30-35天開花，繼續生長1個月左右完全衰老死亡，而轉化反義PPF1基因植株發芽後20-25天開花，繼續生長15-20天後完全衰老死亡，整個生命周期幾乎縮短了二分之一。
3.PPF1基因或其功能性融合基因與溫度特異性表達啟動子相連的表達參照上述操作步驟，將PPF1全長基因或功能性融合基因分別按正向或反向模式與溫度特異性表達的啟動子相連，構建成植物轉化中間載體後用各種方法轉化受體植物並進行功能性篩選，保證在適宜於植物生長的溫度範圍內，轉基因植物中只表達PPF1基因的正向模式，支持宿主植物旺盛的營養生長，以獲得特別遲熟、特別高產的農作物新品種。
在低於最適生長溫度時，只有PPF1基因的反向模式得到表達，能迅速中止宿主植物的營養生長狀態，促進轉基因植物迅速由營養生長狀態進入生殖生長階段，繁殖種子並準備在溫度進一步降低時衰老死亡。這類具有可調節生長周期的農作物新品種，既可最大限度地提高農作物產量，又可有效地防止農作物大規模減產或絕收。
4.PPF1基因或其功能性融合基因與受光周期誘導表達的啟動子相連的表達參照上述操作步驟，將PPF1全長基因或功能性融合基因分別按正向或反向模式連接到受光周期誘導表達的啟動子之後，保證在光周期長於某個臨界日照長度時，只有PPF1基因的正向模式得到表達，支持宿主植物的營養生長。當光周期短於該臨界日照長度時，PPF1基因的反向模式得到表達，促使植物迅速進入生殖生長階段，保證在冬季嚴寒來臨之前最大限度地保留作物種子產量。
附本發明所涉及的DNA序列和蛋白質序列SEQ NO 1(PPF1基因的DNA全序列，總長度為1523bp，其中編碼區為第48bp至1376bp)ctcaagccttcaagcctgaagcgtctcgtacacaaaccttctcatccatggcgaagacactgatttcttctccatcattcctcggtactccacttccttcacttcaccgtactttctcccctaatcgcaccaggcttttcaccaaagttcaattcagtttccaccaacttcctccgattcaatccgtaagtcattctgttgacttatccggaatcttcgctagagccgaaggtttactttacacgctcgccgatgctactgttgcggcggatgcggctgcttccactgatgttgctgcgcagaagaacggaggttggttcggttttatttctgatggaatggagtttgttctcaaggtgttaaaggatggtttgtcttccgtgcacgtgccttactcatatggatttgctatcatattactaactgttattgttaaggctgctacacttcccttgacaaagcaacaggttgaatcaacactagctatgcaaaaccttcaacctaaaattaaggccattcaagaaagatatgctggcaatcaggaaagaatacaacttgagacctcaaggctttatactcaggctggggttaacccgttggcaggttgtttaccaactttggctactattccagtctggattggtctataccaagctttatctaatgtggcaaatgagggactgttaacagaaggtttcttatggatcccttctctgggtggtcccactagcattgctgctagacaaagcggatccggaatttcttggctttttccgtttgtggatggccatccacttttgggttggtatgacactgcagcatatcttgttttacctgttcttcttattgtttctcaatatgtttcaatggaaatcatgaaaccccctcagacaaatgatcctaatcaaaagaatacacttcttattttcaagtttctcccactcatgatcggctacttctcattatctgtcccatcaggactaacaatttactggtttacaaataatgtccttagcacagctcaacaagtatggttgcgcaaactaggaggtgcaaagcccgctgttaatgaaaatgctggcggaattataactgcaggacaagctaagagatcagcttctaagccagaaaagggtggtgaaaggtttaggcagttaaaagaagaggaaaagaagaaaaagctaatcaaggcactcccagtggaggaagttcagcctttggcttctgcttctgcgtccaatgatggctcagatgtagaaaacaacaaggaacaagaagttacagaagaatcgaacacttctaaagttagccaagaggttcaaagtttttctagggaaagaagaagtaagcgttcaaagcggaagcctgttgcatgatagtggaccacatacatttgtttgtagtttatagtaagttttgtatatgtcaaacagtttgtatcatttttgggttgacaattttattgaacatgttatttaatcatgcaaaatatcttttgtttcatttaagttccacatgttagcSEQ NO 2(PPF1蛋白的胺基酸全序列)MAKTLISSPSFLGTPLPSLHRTFSPNRTRLFTKVQFSFHQLPPIQSVSHSVDLSGIFARAEGLLYTLADATVAADAAASTDVAAQKNGGWFGFISDGMEFVLKVLKDGLSSVHVPYSYGFAIILLTVIVKAATLPLTKQQVESTLAMQNLQPKIKAIQERYAGNQERIQLETSRLYTQAGVNPLAGCLPTLATIPVWIGLYQALSNVANEGLLTEGFLWIPSLGGPTSIAARQSGSGISWLFPFVDGHPLLGWYDTAAYLVLPVLLIVSQYVSMEIMKPPQTNDPNQKNTLLIFKFLPLMIGYFSLSVPSGLTIYWFTNNVLSTAQQVWLRKLGGAKPAVNENAGGIITAGQAKRSASKPEKGGERFRQLKEEEKKKKLIKALPVEEVQPLASASASNDGSDVENNKEQEVTEESNTSKVSQEVQSFSRERRSKRSKRKPVA
權利要求
1.一種連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其特徵在於該方法把PPF1基因序列和啟動子按本領域所熟知的技術相連接；
2.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的PPF1基因序列是如SEQ NO 1所示的該基因序列的全長序列；
3.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的PPF1基因序列是該基因序列的部分序列；
4.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的PPF1基因序列是該基因序列的功能性融合基因序列；
5.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的PPF1基因序列是該基因序列的5』端上遊膜定位區和基因中央的4個較為保守的穿膜區組成的融合基因序列；
6.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的PPF1基因序列是該基因序列的同源序列；
7.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的啟動子是普遍性表達的啟動子；
8.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的啟動子是35S啟動子；
9.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的啟動子是特異性表達的啟動子；
10.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的啟動子是受光周期調控的啟動子；
11.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的啟動子是受種子發育調控的啟動子；
12.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的連接是把PPF1基因序列連接在啟動子的下遊；
13.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的連接是正向連接；
14.權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法，其中所說的連接是反向連接；
15.一種植物轉化中間載體，其特徵是該中間載體是通過把由權利要求1的連接PPF1基因序列和啟動子的方法得到的連接體進行克隆而得到；
16.一種轉化植物，其特徵是該轉化植物是通過權利要求15的植物轉化中間載體轉化而得到；
17.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物包括糧食和油料作物；
18.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物是水稻；
19.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物是玉米；
20.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物是大麥；
21.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物是小麥；
22.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物是大豆；
23.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物是花生；
24.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物包括水果植物；
25.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物是香蕉；
26.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物是蘋果；
27.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物的種子或果實中含有過量表達並積累的PPF1蛋白；
28. 權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物可直接生產新型抗衰老保健食品；
29.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物包括花卉植物；
30. 權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物可顯著推遲花卉凋謝時間並延長花卉開放周期；
31.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物包括麻類植物；
32.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物包括木本植物；
33.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物包括竹科植物；
34.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物可延長其營養生長周期，推遲、抑制甚至關閉其生殖生長，從而增加該轉化植物的高度並改善品質；
35.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物可根據農業生產需要，經選育具有特別遲熟的特性，以大面積提高產量；
36.權利要求16的轉化植物，其中所說的轉化植物可根據農業生產需要，經選育具有生長期特別短的特性，以在生長周期短的地區應用；
37.一種體外表達PPF1基因的原核細胞或真核細胞載體，其特徵是該載體是通過連接PPF1全長基因序列或其功能性融合基因序列和本領域所熟知的原核細胞或真核細胞啟動子而構建；
38.權利要求37的體外表達PPF1基因的原核細胞或真核細胞載體，其中所說的原核細胞載體是大腸桿菌細胞載體；
39.權利要求37的體外表達PPF1基因的原核細胞或真核細胞載體，其中所說的真核細胞載體是酵母細胞載體；
40.一種體外發酵生產PPF1蛋白的方法，其特徵是該方法應用權利要求37的體外表達PPF1基因的原核細胞或真核細胞載體；
41.權利要求40的體外發酵生產PPF1蛋白的方法，其中所說的PPF1蛋白可用於製成化妝品或口服液，用於人體皮膚保養和護理，延緩人體表皮細胞或整個機體的衰老；
42.一種轉化動物細胞的方法，其特徵是該方法包括克隆PPF1基因在動物中的同源序列並用該全長基因的序列或其功能性融合基因的序列實現轉化；
43.權利要求42的轉化動物細胞的方法，其中所說的動物細胞是動物胚胎幹細胞；
44.一種轉化動物，其特徵是該轉化動物是通過權利要求42的轉化動物細胞的方法而獲得，並具有延緩衰老的特性。
全文摘要
本發明提供一種編碼控制植物生長發育的膜蛋白的基因的應用方法,並由此提供一條能夠人為控制細胞衰老特性的易於操作的途徑。通過把PPF1基因序列按正方向和反方向克隆到植物轉化中間載體上,轉化不同受體植物,篩選得到保留原來農藝性狀、但發育進程顯著改變的轉基因植物,以獲得可在生產上應用的新品種或新種質;通過構建體外表達PPF1基因序列的原核細胞或真核細胞載體,發酵並純化PPF1蛋白,用於延緩人體表皮細胞或整個機體的衰老。
文檔編號C12N15/63GK1348004SQ01102128
公開日2002年5月8日 申請日期2001年1月22日 優先權日2001年1月22日
發明者朱玉賢, 方宣鈞 申請人:海南科豐轉基因生物研究中心