檢測多種對蝦病原的基因晶片及其檢測方法
2023-09-20 05:55:35 1
專利名稱：檢測多種對蝦病原的基因晶片及其檢測方法
技術領域：
本發明屬於基因晶片的海洋生物的病原檢測技術領域，具體涉及一種檢測多種對 蝦病原的基因晶片及其檢測方法。
背景技術：
近年來，運用核酸技術對海水養殖動物病原微生物進行檢測的方法發展非常迅 速，除了傳統的聚合酶鏈式反應之外，還有聚合酶鏈式反應與分子雜交聯用技術、聚合酶鏈 式反應與免疫學聯用技術、限制性酶切技術及環介導的等溫擴增等方法。但由於養殖動物 種類多、病原種類繁雜，針對單一病原的檢測和診斷不能全面反映病害發生的原因和狀況， 不利於確定有效的防治措施。現有的病原檢測技術局限性大、效率低、系統性差，因此急需 海水養殖動物疾病檢測手段在高通量分析能力上取得突破，打破技術瓶頸。新近發展起來的基因晶片技術為這一需求提供了強有力的技術平臺。這一技術達 到在同一個支持物上對多種病原同時進行檢測和鑑定的目的，不但大大縮短了檢測時間， 而且能夠提高靈敏度和準確率，彌補了其它分子生物學檢測手段的不足。國內在基因晶片 技術應用於水產動物疾病檢測上也進行了嘗試，但目前尚未見應用該技術同時對對蝦病毒 類、真菌類、原生動物類和對蝦立克次氏體等病原進行檢測的相關基因晶片應用的報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測多種對蝦病原的基因晶片及其檢測方法，用於檢測 白斑綜合症病毒、傳染性皮下和造血器官壞死病毒、肝胰腺細小病毒、斑節對蝦杆狀病毒、 桃拉病毒、黃頭病毒、對蝦杆狀病毒、產卵蝦死亡病毒、傳染性肌肉壞死病毒、LSNV、毛利病 毒、對蝦諾達病毒、NHP、鐮刀菌、殺魚絲囊黴菌、變形藻絲囊菌、擬阿腦蟲和對蝦立克次氏體 共18類對蝦病原，以解決現有技術不能高通量檢測，以及靈敏度低和準確率差的問題。本發明的技術方案包括一、基因晶片的構建1、基因晶片上的探針選擇本發明共提供了兩大類探針1、提供了質控體系的探針，包括表面化學質控的探 針、陰性對照質控的探針以及雜交陽性外對照質控和整個流程監控的陽性內對照質控的探 針，同時提供了和各探針對應的正向引物及反向引物引物；2、提供了白斑綜合症病毒、傳染 性皮下和造血器官壞死病毒、肝胰腺細小病毒、斑節對蝦杆狀病毒、桃拉病毒、黃頭病毒、對 蝦杆狀病毒、產卵蝦死亡病毒、傳染性肌肉壞死病毒、LSNV、毛利病毒、對蝦諾達病毒、NHP、 鐮刀菌、殺魚絲囊黴菌、變形藻絲囊菌、擬阿腦蟲和對蝦立克次氏體共18類對蝦病原微生 物特徵基因的探針，同時提供各探針對應的正向引物及反向引物。質控體系包括表面化學質控QC1、雜交陽性外對照質控QC2、整個流程監控的陽性 內對照質控QC3、陰性對照質控QC4和空白對照QC5五部分。質控體系中各個成員的特徵基 因及其序列在表1中的分布如下
整個流程監控的陽性內對照質控QC3特徵基因1探針序列P1、正向引物序列Fl和 反向引物序列Al分別對應於表1中序號1、2和3 ；整個流程監控的陽性內對照質控QC3特 徵基因2探針序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應於表1中序號4、5和 6 ；表面化學質控QCl探針序列P、正向引物序列F和反向引物序列A分別對應於表1中序 號7、8和9 ；陰性對照質控QC4探針序列P對應於表1中序號10 ；雜交陽性外對照質控QC2 探針序列P、正向引物序列F和反向引物序列A對應於表1中序號11、12和13。表1 質控體系的探針及引物序列信息
權利要求
一種檢測多種對蝦病原的基因晶片，其特徵在於將用於檢測白斑綜合症病毒、傳染性皮下和造血器官壞死病毒、肝胰腺細小病毒、斑節對蝦杆狀病毒、桃拉病毒、黃頭病毒、對蝦杆狀病毒、產卵死亡病毒、傳染性肌肉壞死病毒、LSNV、毛利病毒、對蝦諾達病毒和NHP病毒的探針；用於檢測鐮刀菌、殺魚絲囊黴菌和變形藻絲囊菌的探針；用於檢測擬阿腦蟲和對蝦立克次氏體的探針點制在基因晶片載體上，探針的序列信息如下
2.如權利要求1所述的一種檢測多種對蝦病原的基因晶片，其特徵在於上述的基因芯 片載體上還點制有整個流程監控的陽性內對照質控QC3的探針；探針的序列信息如下
3.如權利要求2所述的一種檢測多種對蝦病原的基因晶片，其特徵在於上述的整個流 程監控的陽性內對照質控QC3的探針有替補探針，替補探針序列信息如下
4.如權利要求1或2所述的一種檢測多種魚類病原的基因晶片，其特徵在於上述的基 因晶片載體為固相載體尼龍膜。
5.權利要求書1或2所述一種檢測多種對蝦病原的基因晶片及其檢測方法，包括以下 步驟(1)待檢樣品準備、⑵地高辛標記的PCR擴增、(3)預雜交和雜交、⑷加入鹼性磷 酸酶標記的地高辛抗體、(5)顯色、(6)結果判讀步驟，其特徵在於步驟(2)中的地高辛標記 的 PCR 擴增體系是無菌去離子水 17. 25 μ L, IOXreaction buffer 2. 5μ L,20mM 的 MgCl2·1.5yL, PCR地高辛標記混合物0.5 μ L，10 μ M的正向引物和10 μ M的反向引物各1 μ L， 5unit/ μ L的rTaq DNA聚合酶0. 25 μ L，待檢樣品DNA 1 μ L，該反應體系總體積25 μ L。PCR 擴增程序94°C 4min ；94°C 30s, 55. 5°C 30s, 72°C 40s，35 個循環；72°C延伸 lOmin，4°C保 溫，其中各正向引物和反向引物的序列信息如下
6.如權利要求5所述的一種檢測多種對蝦病原的基因晶片及其檢測方法，其特徵在於 上述鐮刀菌的探針對應的引物存在替補引物，替補引物的序列信息如下
全文摘要
本發明涉及一種檢測多種對蝦病原的基因晶片及其檢測方法。基因晶片的構建是將質控系統的探針和18種對蝦病原的探針點在同一固相載體尼龍膜上製成。18種對蝦病原的探針包括用於檢測15種病毒的探針，用於檢測鐮刀菌、殺魚絲囊黴菌、變形藻絲囊菌的探針以及檢測擬阿腦蟲和對蝦立克次氏體的探針。本發明的基因晶片的檢測是應用地高辛雜交顯色方法，根據雜交點是否出現藍色或藍紫色來進行信號判斷。本發明基因晶片上質控體系的構建保證了檢測的特異性和靈敏性，並且可在同一尼龍膜上對多種對蝦病原微生物進行同時檢測，具有高通量的特點，可以替代之前的對蝦病原微生物相關檢測方法，是現有對蝦病原微生物鑑定技術的突破。
文檔編號C12Q1/70GK101942527SQ201010243399
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者劉莉, 史成銀, 宋曉玲, 張寶存, 張慶利, 楊冰, 王秀華, 荊曉豔, 閆麗, 黃倢 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所