紫海膽殼棘提取物及在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用的製作方法
2023-09-10 11:13:00
紫海膽殼棘提取物及在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種紫海膽殼棘提取物及在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用，提取物依次按照如下步驟提取：以紫海膽動物殼棘為原料，經粉碎烘乾後用乙醇提取，將提取液減壓濃縮後得浸膏；取浸膏溶於水，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，合併水相部分；再用正丁醇萃取，合併正丁醇層；將經減壓濃縮的正丁醇層經正相矽膠柱層析，收集乙酸乙酯∶甲醇梯度為100∶5~100∶6的洗脫液，為一次洗脫液；濃縮所收集的一次洗脫液並再次進行正相矽膠柱層析，收集乙酸乙酯∶甲醇梯度為100∶3~100∶4的洗脫液，為二次洗脫液，合併、濃縮二次洗脫液並重結晶，得到紫海膽殼棘提取物。
【專利說明】紫海膽殼棘提取物及在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種紫海膽殼棘提取物及在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 海膽始載於《本草原始》，別名海膽虎（《動物圖譜.棘皮》)，屬於棘皮動物門 iEchinodermata')、海覽W^iEchinoidea、，繁海覽Anthocidaris crassispina (A. Agassiz) 是其中一種。
[0003] 海膽由殼(骨殼)、棘(棘刺）和內臟組成，是營養豐富的海珍品。儘管現代醫學證 明海膽殼、棘及生殖腺等部位有良好的藥用價值，但所報導的主要功效如下：海膽性"鹹"， "平"（《中藥志》)，"有小毒"（《山東中草藥手冊》)，"主治心疼"（《本草原始》)，有"軟堅化 痰，散結消腫，消瘰癧痰核、制酸止痛，清熱解毒"的功用。迄今為止，未見有關於紫海膽殼棘 提取物有抑制癌細胞生長作用的相關報導，以至於海膽殼棘多被作為廢棄物而丟棄，浪費 了潛在的藥用資源。
【發明內容】
[0004] 本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種紫海膽殼棘提取物 及在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用。
[0005] 本發明的技術解決方案是：一種紫海膽殼棘提取物，其特徵是依次按照如下步驟 提取： a. 以紫海膽動物殼棘為原料，經粉碎烘乾後用乙醇提取， 將提取液減壓濃縮後得浸膏； b. 取浸膏溶於水，用石油醚萃取，合併水相部分；再用乙酸乙酯萃取，合併水相部分； 再用正丁醇萃取，合併正丁醇層，減壓濃縮； c. 將經減壓濃縮的正丁醇層經正相矽膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇進行梯度洗脫，收 集乙酸乙酯：甲醇梯度為100 :5~100 :6的洗脫液，為一次洗脫液；濃縮所收集的一次洗脫 液並再次進行正相矽膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇進行梯度洗脫，收集乙酸乙酯：甲醇梯度 為100 :3~100 :4的洗脫液，為二次洗脫液，合併、濃縮二次洗脫液並重結晶，得到紫海膽殼 棘提取物。
[0006] 所述a步驟是以質量濃度75%的乙醇在23?28°C的溫度條件下提取4小時，料液比 為 1 :20。
[0007] -種上述紫海膽殼棘提取物在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用。
[0008] 所述紫海膽殼棘提取物在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用，是在製備抑制血 癌、乳腺癌或直腸癌細胞生長藥物中的應用。
[0009] 本發明是以來源廣泛、價格低廉的海膽加工廢棄物--海膽殼、棘為原料，利用溶 劑提取法對其進行提取，並經有機溶劑萃取、矽膠柱層析而獲得的提取物。所得到的提取物 經抗腫瘤實驗證明，對人慢性髓性白血病細胞K562、人早幼粒極性白血病細胞HL60、人乳 腺癌細胞SKBR-3、人乳腺癌細胞MCF-7、人結直腸腺癌細胞SW620有顯著的細胞毒性作用， 其IC50值均在30-90 μ g ?πιΓ1之間，並具有劑量依賴性。細胞凋亡實驗表明該提取物有顯 著誘導HL60急髓白血病M3細胞株、SKBR-3人乳腺癌細胞和SW620結腸癌細胞凋亡的作用， 其誘導凋亡作用有劑量依賴性，因此本發明提取物有顯著的細胞毒性和誘導細胞凋亡的作 用。本發明操作簡單，所用溶劑均為普通化學試劑，易重複，適於大規模生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010] 圖1本發明提取物對人慢性髓性白血病細胞Κ562體外實驗抑制率示意圖。
[0011] 圖2本發明提取物對人早幼粒極性白血病細胞HL60體外實驗抑制率示意圖。
[0012] 圖3是本發明提取物對人乳腺癌細胞SKBR-3體外實驗抑制率示意圖。
[0013] 圖4是本發明提取物對人乳腺癌細胞MCF-7體外實驗抑制率示意圖。
[0014] 圖5是本發明取物對人結直腸腺癌細胞SW620體外實驗抑制率示意圖。
[0015] 圖6~圖10本發明提取物對人早幼粒極性白血病細胞HL60的誘導凋亡作用示意 圖。
[0016] 圖11?圖15本發明提取物對人乳腺癌細胞SKBR-3的誘導凋亡作用示意圖。
[0017] 圖16~圖20本發明提取物對人結直腸腺癌細胞SW620的誘導凋亡作用示意圖。
[0018] 圖21本發明提取物對人早幼粒極性白血病細胞HL60的流式細胞術實驗抑制率示 意圖。
[0019] 圖22本發明提取物對人乳腺癌細胞SKBR-3的流式細胞術實驗抑制率示意圖。
[0020] 圖23本發明提取物對人結直腸腺癌細胞SW620的流式細胞術實驗抑制率示意圖。
【具體實施方式】
[0021] 依次按照如下步驟提取： a. 以4公斤紫海膽動物殼棘為原料，經粉碎烘乾後用閃式 提取器以質量濃度75%的乙醇在23~28°C的溫度條件下提取二次，每次4小時，料液比為 1 :20 ;將提取液合併用多級閃蒸器、旋轉蒸發器減壓濃縮後得浸膏73. 6g ;所得浸膏經乙酸 酐-濃硫酸反應呈陽性，表明其中含有留體皂苷類物質； b. 將浸膏均勻分散於0. 5L水中，用1. 5L石油醚分三次萃取，合併水相部分；再用1. 5L 乙酸乙酯分三次萃取，合併水相部分；再用1. 5L正丁醇分三次萃取，合併得到正丁醇層提 取液，減壓濃縮得到15. 39g正丁醇層濃縮液； c. 將所得到的正丁醇層濃縮液經正相矽膠柱層析（300g30(T400目矽膠溼法裝柱，柱 高70cm，柱徑2. 5cm，流速10ml/min)，用乙酸乙酯：甲醇（100 :1?100 :100)的洗脫液進行梯 度洗脫，收集乙酸乙酯：甲醇的梯度為100 :5 ~100 :6的洗脫液，為一次洗脫液，濃縮一次洗 脫液得到1. 32g ;再次進行正相矽膠柱層析（20g 30(Γ400目矽膠溼法裝柱，柱高120cm，柱 徑lcm，流速3ml/min)，乙酸乙酯：甲醇（100: f 100:100)的洗脫液梯度洗脫，收集乙酸乙 酯：甲醇的梯度為100 :3~100 :4的洗脫液，為二次洗脫液，合併、濃縮二次洗脫液並重結晶， 得到白色固體2 lmg，即紫海膽殼棘提取物。
[0022] 實驗： 一.以本發明實施例得到的紫海膽殼棘提取物進行體外抗腫瘤實驗 採用人慢性髓性白血病細胞K562、人早幼粒極性白血病細胞HL60、人乳腺癌細胞 SKBR-3、人乳腺癌細胞MCF-7、人結直腸腺癌細胞SW620五種腫瘤細胞系，進行MTT&SRB實 驗。
[0023] 1. K562和HL60細胞種板：收集細胞，並在1000轉/分的條件下離心，用PBS緩 衝液將細胞清洗一次，再離心，用新鮮培養基重懸後，按照8000 cell/well，180ul種板後加 藥； 2. SKBR-3、MCF-7和SW620細胞種板：提前一天處理細胞，將細胞消化離心後，重懸，按 照 8000 cells/well，180 μ 1 種板，次日加藥； 3. 加藥：將本發明所得紫海膽殼棘提取物按照100、50、25、12. 5、6. 25、3. 2 μ g/ml濃 度梯度加入上述細胞中，並在37°C恆溫箱培育48 h。
[0024] 4. K562和HL60的IC5Q測定：48 h後每孔加入20 μ 1 MTT，37°C恆溫孵育4 h後， 離心，去除上清液，加入150 μ 1 DMS0/孔，用酶標儀測定0D 57_值。
[0025] 5. SKBR-3、MCF-7 和 SW620 的 IC5Q 測定：48 h 後，加入預冷的 10% TCA 溶液 100 μ l/well，4°C冰箱固定1 h，之後用H20洗滌4次，室溫下晾乾；加入0.4% SRB染色液100 μ 1/well，30 min後，用1%乙酸洗漆4次，室溫下瞭幹；最後，加入Tris-base鹼液（10mM， pH=10. 5) 150 μ 1/well，混勻後，用酶標儀測定 0D51Qnm。
[0026] 作用48小時後，不同濃度的本發明實施例提取物對人慢性髓性白血病細胞K562、 人早幼粒極性白血病細胞HL60、人乳腺癌細胞SKBR-3、人乳腺癌細胞MCF-7、人結直腸腺癌 細胞SW620的抑制率示意圖分別如圖1、圖2、圖3、圖4、圖5所示。
[0027] 體外實驗表明，本發明實施例提取物對5株癌細胞（K562、HL60、SKBR-3、MCF-7 和SW620)的抑制作用均隨著樣品濃度的升高而升高，有細胞毒性作用，並且具有劑量依賴 性。其中濃度lOOug^mr 1作用的人結直腸腺癌細胞SW620的細胞活性最低，說明濃度 100 μ g · mr1的提取物對SW620的抑制作用最顯著。
[0028] 表1本發明實施例提取物對五株癌細胞的IC5Q值
【權利要求】
1. 一種紫海膽殼棘提取物，其特徵是依次按照如下步驟提取： a. 以紫海膽動物殼棘為原料，經粉碎烘乾後用乙醇提取， 將提取液減壓濃縮後得浸膏； b. 取浸膏溶於水，用石油醚萃取，合併水相部分；再用乙酸乙酯萃取，合併水相部分； 再用正丁醇萃取，合併正丁醇層，減壓濃縮； c. 將經減壓濃縮的正丁醇層經正相矽膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇進行梯度洗脫，收 集乙酸乙酯：甲醇梯度為100 :5~100 :6的洗脫液，為一次洗脫液；濃縮所收集的一次洗脫 液並再次進行正相矽膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇進行梯度洗脫，收集乙酸乙酯：甲醇梯度 為100 :3~100 :4的洗脫液，為二次洗脫液，合併、濃縮二次洗脫液並重結晶，得到紫海膽殼 棘提取物。
2. 根據權利要求1所述紫海膽殼棘提取物，其特徵在於所述a步驟是以質量濃度75% 的乙醇在23~28°C的溫度條件下提取4小時，料液比為1 :20。
3. -種如權利要求1或2所述紫海膽殼棘提取物在製備抑制癌細胞生長藥物中的應 用。
4. 一種如權利要求3所述紫海膽殼棘提取物在製備抑制癌細胞生長藥物中的應用，其 特徵在於在製備抑制血癌、乳腺癌或直腸癌細胞生長藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK104055796SQ201410193518
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月9日 優先權日:2014年5月9日
【發明者】金橋, 李偉, 佟長青, 曲敏, 朱春芃 申請人:大連海洋大學, 金橋