核仁素在製備腸癌診斷試劑和治療藥物中的應用的製作方法

2023-09-20 06:20:25 2

本發明屬於生物技術領域，涉及一種多功能的非核糖體蛋白質核仁素及用途，具體涉及應用核仁素作為人腸癌分子標誌物及其在製備檢測或診斷人腸癌的製劑或試劑盒以及治療藥物中的用途。

背景技術：
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近年來隨著我國人民生活水準的提高和飲食習慣的改變，大腸癌的發病率和死亡率也呈逐年增高的趨勢。研究顯示，大腸癌的預後與疾病的分期密切相關，早期診斷以及早期治療能夠顯著改善預後，延長生存期。目前臨床實踐中，較通行、常規的檢查為血清血液檢查，常用的與腸道相關的血清腫瘤標誌物，如血清癌胚抗原(CEA)、腸癌相關抗原(CCA)、糖抗原19-9(CA19-9)等對大腸癌診斷的特異性和敏感性均較低；同時因大腸癌早期可無明顯的臨床症狀，這些都對大腸癌的早期發現、早期診斷造成了一定的困難；因此，尋找大腸癌的有效標誌物，準確判斷該疾患的的臨床分期和預後成為本領域研究者的關注熱點。

現有技術公開了核仁素是一種多功能的非核糖體蛋白質，其主要分布在細胞核內，有少量分布在核漿、細胞質和細胞膜上；它參與多個方面的DNA代謝，也廣泛地參與RNA的調控過程，如轉錄、核糖體裝配、mRNA的翻譯及其穩定性的保持和microRNA的加工等；研究報導，核仁素通過調控轉錄後靶mRNAs，促進細胞增殖和抗細胞凋亡，從而在細胞層面影響疾病的進展；特別是在腫瘤和病毒感染中，核仁素通過調控RNA的功能，密切地參與疾病的病理進展過程。

有研究報導，在細胞質中，核仁素與Bcl-2 mRNA、AKT1 mRNA、CCNI mRNA結合，增強其穩定性，從而增加Bcl-2、AKT1和cyclin I的表達量，起到抗凋亡和促進腫瘤發生的作用；其可以與TP53mRNA的非編碼區5』端結合，抑制其翻譯，從而減少腫瘤抑制因子P53的表達。

有研究公開了胃泌素，作為一種在胃腸道惡性腫瘤中高表達的蛋白，也受到核仁素的調控，核仁素通過與胃泌素mRNA結合，增強其穩定性，增加胃泌素的 表達量，研究顯示，在大腸癌細胞中，胃泌素能上調COX-2的表達量，增加前列腺素E2的表達量，促進癌細胞的增殖；核仁素還能與MMP9 mRNA非編碼區3』端結合，增強其穩定性，增加其翻譯為基質金屬蛋白酶的功能；基質金屬蛋白酶能夠降解細胞外基質成分，其在傷口的癒合與血管的生存過程中必不可少，在腫瘤的轉移和進展的病理生理過程中起到極為重要的作用；另外，核仁素還能通過調控促腫瘤生成的miRNA起到促腫瘤發生的作用，如miR-15a和miR-16等。

還有研究發現惡性腫瘤組織細胞膜表面存在核仁素的高表達，通過介導鈣調節通路，脂多糖表達，P選擇素誘導通路等調節腫瘤細胞的轉移和進展；細胞膜表面的核仁素可以作為致癌物Tipa的受體，與之結合後將致癌物質轉運至細胞內起到致癌作用。

基於現有技術的研究現狀，本發明的申請人擬通過研究、檢測在大腸癌患者體內核仁素可能存在表達的異常為大腸癌的診斷提供新輔助判斷手段，尤其提供核仁素在製備腸癌診斷試劑及試劑盒和治療藥物中的用途。

技術實現要素：
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本發明的目的在於針對現有技術中缺乏有效的大腸癌診斷血清學指標的現狀，提供核仁素在製備腸癌診斷試劑及試劑盒和治療藥物中的用途。尤其是以核仁素為靶標的腸癌診斷試劑及試劑盒和治療藥物。

本發明通過檢測在大腸癌患者體內核仁素存在表達的異常，核仁素作為大腸癌診斷的血清學標誌物指標，為大腸癌的診斷提供新的輔助判斷手段。

進一步，提供核仁素在製備腸癌診斷試劑及試劑盒中的用途。

更進一步，提供以核仁素為靶標的治療腸癌的藥物。

為實現上述目的，本發明對腸癌患者及正常對照的血漿樣本進行核仁素的ELISA檢測：其中包括：

1，試劑：ELISA試劑盒購於Uscn Life Science公司；

2，病人及樣本：

1)隨機選取確診為腸癌的患者的術前血標本，以健康體檢患者血作為對照；

2)採用雙抗體ELISA法定量測定人血漿中核仁素含量，根據試劑盒說明書進行相應操作：

3)各標準品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值後作圖(七點圖)，以標準品的濃度為縱坐標(或對數坐標)，O.D.值為橫坐標(或對數坐標)，繪製標準曲線，本發明的實施例中優選按回歸方程計算的R2值，以R2值越趨近於1為佳，根據樣品O.D.值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與O.D.值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，得樣品的實際濃度。

實驗結果顯示：腸癌病人血漿中核仁素水平顯著高於正常對照，P＝0.0005(如圖1所示)；表明所述的核仁素在腸癌中高表達並分泌到血液中，因此，核仁素可作為腸癌診斷的無創標誌物。

本發明通過檢測在大腸癌患者體內核仁素存在表達的異常，表明所述的核仁素可作為大腸癌診斷的血清學標誌物指標，為大腸癌的診斷提供新的輔助判斷手段。

本發明所述的核仁素可用於製備腸癌診斷試劑及試劑盒。

本發明所述的試劑盒中包括針對核仁素蛋白的抗體；所述的檢測試劑盒含有核仁素標準品。

進一步，本發明所述的核仁素還可用於製備治療腸癌的藥物的靶標。

另一方面，本發明還提供了一種人腸癌標誌物核仁素的檢測方法，其包括步驟：

(1)分離提取樣本中的基因組DNA或者蛋白；

和/或

(2)檢測(1)所得的基因組DNA或者蛋白中核仁素的表達水平。

本發明通過檢測在大腸癌患者體內核仁素表達的異常，腸癌病人血漿中核仁素水平顯著高於正常對照，提供了核仁素作為大腸癌診斷的血清學標誌物指標。

說明書附圖

圖1是腸癌病人與正常對照的血漿中核仁素水平表達，其中顯示了腸癌病人血漿中核仁素水平表達顯著高於正常對照。

具體實施方式

實施例1對腸癌患者及正常對照的血漿樣本進行核仁素的ELISA檢測

試劑：ELISA試劑盒購於Uscn Life Science公司。

病人及樣本：

隨機選取2013年1月-2015年2月新確診為腸癌的30例患者的術前血標本，同時選取28例健康體檢患者血作為對照。所有血標本收集方案均經過華山醫院倫理委員會批准。

雙抗體ELISA法定量測定人血漿中核仁素含量：

根據試劑盒說明書進行相應操作；

1，標本採集與保持

將病人血液標本1000×g離心20分鐘，取上清(血漿)置於-20℃或-80℃保存；

2、操作步驟：

1)實驗前標準品、試劑及樣本準備；

2)加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔；設標準孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標準品，空白孔加100μL，餘孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育2小時；

3)棄去液體，甩幹，不洗滌；

4)每孔加檢測溶液A工作液100μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時；

5)棄去孔內液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標板內的液體，鋪墊紙吸或拍動將孔內液體拍幹，重複洗板3次；最後一次，洗滌後，將孔內的洗滌液完全甩幹；

6)每孔加檢測溶液B工作液100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘；

7)棄去孔內液體，甩幹，洗板5次，方法同步驟4；

8)每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色，反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，後3-4孔梯度不明顯時，即可終止；

9)每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色；終止液的加入順序應與底物溶液的加入順序相同，如出現顏色不勻一，晃動酶標板以使溶液混合均勻；

10)酶標板底無水滴及孔內無氣泡後，用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。

3、計算

各標準品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值後作圖(七點圖)，如設置復孔，則應取其平均值計算；以標準品的濃度為縱坐標(或對數坐標)，O.D.值為橫坐標(或對數坐標)，繪製標準曲線，本實施例中，依回歸方程計算的R2值確定，以R2值越趨近於1為佳；使用專業製作曲線軟體(curve expert 1.30)進行分析，根據樣品O.D.值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與O.D.值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

實驗結果顯示：在腸癌病人血漿中核仁素水平顯著高於正常對照，P＝0.0005(如圖1所示)，表明核仁素在腸癌中高表達並分泌到血液中，因此，所述的核仁素可作為腸癌診斷的無創標誌物。