抗原呈遞細胞及其製備方法與應用的製作方法

2023-10-29 03:01:27 1

專利名稱：：抗原呈遞細胞及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及抗原呈遞細胞及其製備方法與應用。
背景技術：
：CD8陽性細胞毒T細胞在機體抵抗病毒感染、抗腫瘤免疫中發揮極為重要的作用。這種T細胞通過其自身細胞表面表達的受體，識別靶細胞表面表達的已嵌入病毒或腫瘤突變的多肽主要組織相容性複合物，從而殺傷侵入或突變的異己，達到保護機體的目的。鑑於細胞毒T細胞在免疫保護中的重要作用，如何在體內誘導產生高強度的細胞毒T細胞免疫反應成為疫苗研製的關鍵。細胞毒T細胞的刺激產生是通過職業抗原呈遞細胞表面表達主要組織相容複合物分子來實現的。而這種嵌合外來抗原多肽的MHC-I的形成是由稱作抗原加工與呈遞的精確調控的細胞活動來實現的。胞內的蛋白首先由一種叫作蛋白酶體(protesome)的酶複合體降解成小的蛋白碎片，然後這些小蛋白碎片通過抗原加工相關轉運蛋白TAP(TAP由TAPl和TAP2兩個亞基構成)泵入內質網，在內質網中，這些小蛋白碎片通過氨基端酶的進一步加工，形成9-12胺基酸的小肽，然後這些小肽由多種蛋白質組成的多肽裝載複合物嵌合於MHC-I中，通過高爾基體結構將多肽表位提呈至細胞表面，刺激特異T細胞的增殖，建立機體的細胞免疫反應。絕大部分高親和力抗腫瘤特異性細胞在胸腺發育過程中，通過免疫耐受而被清除。體內存在的抗腫瘤T細胞以低親和力為主，誘導這些T細胞反應抗原呈遞細胞，需提供高密度的嵌有特異性多肽的MHC-I。目前常用的方法是使用合成的多肽裝載至抗原呈遞細胞，或使用腫瘤細胞的溶介產物武裝腫瘤刺激誘導特異性T細胞的增殖。使用多肽或腫瘤溶介物武裝抗原呈遞細胞，僅能提供一過性的瞬時高密度多肽複合物難於達到維持刺激T細胞的功效。另外一種刺激低親和力的抗腫瘤T細胞的方法是使用改造的腫瘤多肽抗原表位，增強其與MHC結合的能力，從而提高在抗原呈遞細胞表面的滯留時間，增強刺激T細胞的強度。儘管這些辦法不同程度增強細胞表面裝載有特異性多肽的密度，提高刺激T細胞的效率，但因表達於細胞表面的MHC-I絕大部分已裝載有在抗原加工與提呈過程中形成的來自自身蛋白的抗原，限制更多的腫瘤特異性表位多肽與MHC-I結合。
發明內容本發明的目的是提供一種抗原呈遞細胞及其製備方法與應用。本發明所提供的製備抗原呈遞細胞的方法，是在抗原處理相關性轉運體蛋白表達下調的離體的抗原呈遞細胞中表達抗原決定簇-人源β2微球蛋白融合蛋白，獲得在細胞表面表達抗原決定簇/MHCI複合體的抗原呈遞細胞。其中，所述表達抗原決定簇-人源β2微球蛋白融合蛋白的方法是將編碼抗原決定簇的DNA分子與編碼人源β2微球蛋白的DNA分子連接獲得融合基因，將所述融合基因導入抗原呈遞細胞中表達所述融合蛋白。所述抗原處理相關性轉運體蛋白表達下調的抗原呈遞細胞是將針對抗原處理相關性轉運體蛋白基因的RNA幹擾載體導入抗原呈遞細胞獲得的。所述TAP蛋白表達下調的抗原呈遞細胞可通過現有的多種方法獲得，如通過插入失活滅活TAP蛋白，或者通過基因突變、缺失等現有技術使TAP蛋白表達下調。TAP蛋白是由TAPl和TAP2組成的異二聚體，TAPl和TAP2各跨越內質網6次共形成一個「孔」樣結構，依賴ATP對肽段進行主動轉運。可將TAPl滅活使TAP蛋白喪失活性，或者將TAP2滅活使TAP蛋白喪失活性，也可將兩個組成因子全部失活達到使TAP蛋白喪失活性的目的。如可將針對TAP2基因的RNA幹擾載體導入抗原呈遞細胞獲得的。所述針對抗原處理相關性轉運體蛋白2基因的RNA幹擾載體為慢病毒載體，逆轉錄病毒載體，腺病毒載體，痘苗病毒，質粒載體和小環DNA載體。所述慢病毒載體可通過商業途徑獲得，如Sigma公司出售的LK-siTAP2_88、LK-siTAP2-89、LK-siTAP2-90、LK-siTAP2-91或LK-siTAP2-92。所述TAP2蛋白表達下調的抗原呈遞細胞也可為RMA-S細胞，RMA-S細胞為C57BL/6小鼠來源、Rauscher病毒誘生的T細胞淋巴瘤RBL-5細胞的突變株，抗原處理相關性轉運體基因2(TAP2)突變，細胞表面表達沒結合上抗原決定簇的MHCI類分子(空載MHCI類分子)，這種空載I類分子能直接結合相應的夕卜源抗原決定族。(Ljunggren，H.G.，Karre,K.，1985.HostresistancedirectedselectivelyagainstH-2-deficientlymphomavariants.Analysisofthemechanism.J.Exp.Med.162,1745.)所述的抗原呈遞細胞是指能夠攝取、加工處理抗原，並將處理過的抗原呈遞給T、B淋巴細胞的一類免疫細胞。所述的抗原呈遞細胞主要包括單核_吞噬細胞、樹突狀細胞、B細胞以及內皮細胞、腫瘤細胞的病毒感染的靶細胞等，如小鼠胚胎成纖維細胞和小鼠淋巴瘤細胞。上述方法製備的的抗原呈遞細胞也屬於本發明的保護範圍。實驗證明，上述方法製備的抗原呈遞細胞能誘導特異性細胞毒T細胞，可用來製備疫苗。本發明的另一個目的是提供一種疫苗。本發明所提供的疫苗，其活性成分為所述的抗原呈遞細胞。所述的抗原呈遞細胞可直接作為疫苗，也可將所述抗原呈遞細胞與各種佐劑混合製備成疫苗。所述佐劑可為現有的多種佐劑，如氫氧化鋁或MF59等。本發明製備抗原呈遞細胞的方法是利用多肽需轉移至內質網後，才能與MHCI類分子組裝的特點，通過抑制TAP功能達到降低在抗原呈遞細胞表面表達自身多肽/MHCI類分子，將TAP表達下調的細胞與抗原決定簇共孵育或將抗原決定簇連接在內質網內與MHC分子組裝，而不需要TAP的輔助，達到既降低內源性自身多肽MHC/MHCI類分子，又增強抗原決定簇/MHCI類分子在抗原呈遞細胞表面的表達，可誘導高殺傷力的特異性抗腫瘤T細胞產生。本發明的方法能用於製備各種種屬和基因型的細胞，特異性的高水平提呈各種外源性抗原決定簇，特別是製備人源的專職抗原呈遞細胞，如樹突狀細胞，並應用於提呈親合力較低的外源抗原決定簇。本發明的方法製備的抗原呈遞細胞可用來製備疫苗，在細胞疫苗的研製和T細胞過繼治療中有深遠的應用前景。圖1為LK-OVA-hβ2m載體的結構示意圖。圖2為篩選mTAP2下調的細胞系A流式細胞儀檢測各細胞系表面MHCI(H-2Db)表達水平；B流式細胞儀檢測RMA-91表面MHCI(H_2Kb)表達水平；C=Westernblot檢測TAP2蛋白水平。圖3為篩選高表達0VA257_264/MHCI複合體的細胞系A:流式細胞儀檢測K42-OVA-h02m和K42-91-OVA-h02m細胞表面hβ2m的表達；B流式細胞儀檢測K42-91-0VA-hβ2m細胞表面MHCI(H_2Kb)的表達；C=Westernblot檢測K42-0VA-hβ2m和K42-91-0VA_hβ2m胞內hβ2m蛋白表達水平。圖4為特異性細胞毒T細胞體外殺傷實驗和小鼠體內的抑瘤實驗A:RMA-91+0VA257_264和K42_91-0VA_hβ2m誘導的特異性細胞毒T細胞的體外殺傷實驗結果；B:C57BL/6小鼠體內瘤體積測量結果；C:C57BL/6小鼠成活率。具體實施例方式下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑均可從商業途徑獲得。下述實施例通過構建高表達0VA257_264/MHCI複合體的抗原呈遞細胞詳細闡明本發明的製備抗原呈遞細胞的方法。實施例1、高表達0VA257_264/MHCI複合體的抗原呈遞細胞1)構建TAP2蛋白表達量下調的抗原呈遞細胞LK-siTAP2-88、LK_siTAP2_89、LK-siTAP2_90、LK_siTAP2_91和LK_siTAP2_92慢病毒表達載體購自Sigma公司，LK-siTAP2-88、LK-siTAP2-89、LK-siTAP2-90、LK-siTAP2-91和LK-siTAP2-92分別裝載針對小鼠TAP2基因不同位點的小莖環RNA(shRNA)，各靶位點序列見Sigma產品(MISSIONshRNATRCN0000066388,MISSIOMshRNATRCN0000066389,MISSIONshRNATRCN0000066390,MISSI0NshRNATRCN0000066391和MISSIONshRNATRCN0000066392)。LK-siTAP2-88、LK_siTAP2_89、LK_siTAP2_90、LK_siTAP2_91和LK_siTAP2_92慢病毒表達載體與pLPl，pLP2，pLP/VSVG(Invitrogen)包裝成慢病毒顆粒，將包裝好的含有LK-siTAP2-88、LK_siTAP2_89、LK_siTAP2_90、LK_siTAP2_91和LK_siTAP2_92的慢病毒顆粒分別命名為LK-88、LK-89、LK-90、LK-91和LK-92。包裝慢病毒顆粒的方法如下1.轉染前12-16小時，鋪5X106293T細胞(ATCCSD3515)於IOcm細胞培養皿中加入生長培養基即含10%胎牛血清(以下簡稱FBS，Invitrogen，16000-044)的Dulbecco，smodifiedEagle，smedium(以下簡稱DMEM，Invitrogen,12800-017)至10ml。2.轉染(1)混合質粒tableseeoriginaldocumentpage6將以上20ug質粒混合物後用轉染用水(2.5mMHepespH值7.3)稀釋至250ul，加Λ250ul0.5MCaCl2,混勻；(2)將(1)中混合好的質粒緩慢逐滴地加入500μ12XHeBS(0.28ΜNaCl，0.05MHEPES1.5mMNa2HP04pH7.00)，在滴加時以最大速度渦懸；(3)靜止20分鐘；然後吸棄培養基後，再加入不含血清的DMEM5ml；(4)將(3)中得到的混合物緩慢逐地加入293T單層細胞上，溫和地振動培養皿；(5)將(4)中的培養皿放入5%C0237°C細胞培養箱；3.5-4小時後，吸棄上清，力口入8ml含10%FBS的DMEM培養基；3.收毒轉染後36-48小時之間，收集上清病毒液，4°C離心上清液，2500rpm,10分鐘，0.45μm過濾，得到慢病毒顆粒，分裝後-80°c凍存。慢病毒顆粒LK-88、LK-89、LK-90、LK-91和LK-92分別感染K42小鼠胚胎成纖維細胞(Nakamura,K.etal.(2001).Functionalspecializationofcalreticulindomains.J.CellBiol154,961-972)(中國科學院微生物研究所)，具體方法如下感染前12小時用6孔板鋪細胞，每孔分2XIO5個細胞，補加3ml含10%FBS的RPMI1640(Invitrogen,31800-022)培養基；吸棄孔中培養基，每孔分別加入5ml慢病毒顆粒LK-88、LK-89、LK-90、LK-91和LK-92並加入5μ18mg/mlpolybrene(Sigma,H9268)使其終濃度至8μg/μ1;6小時後吸棄慢病毒顆粒，每孔加入3ml含10%FBS的RPMI1640培養基；感染48小時後用6μg/ml嘌呤黴素(Amresco，J593)篩選兩周，耐藥的細胞群經有限稀釋後得到單克隆細胞，將穩定感染LK-siTAP2-88、LK_siTAP2_89、LK-siTAP2_90、LK-siTAP2-91和LK_siTAP2_92的單克隆細胞分別命名為K42-88，K42-89，K42-90，K42-91和K42-92。流式細胞儀檢測各細胞系表面MHCI(H-2Db)表達水平，方法如下收集1XIO5細胞，PBS緩衝液(PH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液，(含1%FBS,0.疊氮鈉的PBS緩衝液)並加入2ug抗小鼠MHCI(H_2Db)複合物的單克隆抗體(santacruz，sc_52541)，於冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(PH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液，並加入5ulFITC標記的山羊抗小鼠IgG(Epigen)避光冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(PH7.4)洗三次後重懸於300ul固定緩衝液(含2%甲醛的PBS緩衝液，PH7.4)上流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測結果如圖2A所示，表明K42-88，K42-89，K42-90，K42-91和K42-92中H-2Db的表達有不同程度的下調，其中K42-91細胞中H_2Db的表達下調最大。慢病毒顆粒LK-91感染小鼠淋巴瘤細胞系RMA(Ljunggren，H.G.，Karre，K.，1985.HostresistancedirectedselectivelyagainstH-2-deficientlymphomavariants.Analysisofthemechanism.J.Exp.Med.162,1745.)(中國科學院微生物研究所)具體方法如下用6孔板鋪細胞，每孔分0.5ml2X105/ml細胞，每孔加入3ml慢病毒顆粒LK-91，同時加入3.5μ18mg/mlpolybrene,於30°C1200rpm離心45分鐘後放至5%C0237°C細胞培養箱。感染6小時後收集各孔內的細胞，分別離心棄上清，將細胞沉澱重懸於含10%FBS的RPMI1640(Invitrogen，31800-022)放回各孔於5%C0237°C細胞培養箱中培養。感染48小時後用6μg/ml嘌呤黴素篩選兩周，耐藥的細胞群經有限稀釋後得到單克隆細胞，命名為RMA-91。流式細胞儀檢測RMA-91表面MHCI(H_2Kb)表達水平，方法如下收集1X105RMA-91,PBS緩衝液(pH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液，(含1%FBS,0.疊氮鈉的PBS緩衝液)並加入2ug抗小鼠MHCI(H_2Kb)複合體的單克隆抗體(Epigen)，於冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(PH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液，並加入5ulFITC標記的山羊抗小鼠IgG(Epigen)避光冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(pH7.4)洗三次後重懸於300ul固定緩衝液(含2%甲醛的PBS緩衝液，pH7.4)上流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測結果如圖2B所示，表明RMA-91細胞中H-Kb的表達下調。Westernblot檢測細胞系K42-91、RMA-91和RMA-S中TAP2蛋白表達水平。RMA-S細胞(Ljunggren，H.G.,Karre,K.,1985.HostresistancedirectedselectivelyagainstH-2~deficientlymphomavariants.Analysisofthemechanism.J.Exp.Med.162,1745.),是天然缺失TAP2的RMA細胞。以Calnexin的表達作為內參。Westernblot所用抗體檢測小鼠TAP2—抗體為兔抗小鼠TAP抗血清(Epigen)；二級抗體為HRP標記的山羊抗兔IgG(SantaCruz,C1207)；檢測Calnexin—級抗體為兔抗人Calnexin抗血清(Epigen)，該抗血清可與小鼠Calnexin交叉反應，二級抗體為HRP標記的山羊抗小鼠IgG(SantaCruz，D1807)。Westernblot檢測結果如圖2C所示，表明TAP2蛋白表達水平在細胞系K42-91和RMA-91中均明顯下調。2)構建高表達0VA257_264/MHCI複合體的抗原呈遞細胞LK-0VA-hβ2m慢病毒表達載體，裝載雞卵清白蛋白(OVA)表位與人源β2微球蛋白(β2microglobulin，β2m)連接的融合表達框，LK-0VA-hβ2m的結構如圖1所示。LK-0VA-hβ2m慢病毒表達載體的構建方法如下用基因合成的方法(Invitrogen公司合成)獲得編碼融合蛋白0VA_hβ2m的DNA片段，該片段具有粘性末段，兩端酶切為點為BamHI和ΚρηΙ，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。編碼融合蛋白0VA-hβ2m的DNA片段插入pLK(Sigma，SHC001)載體的hPGK啟動子後BamHI和KpnI酶切位點之間替換嘌呤黴素抗性基因puroR，命名為LK_0VA_hβ2m慢病毒表達載體。LK-OVA-hβ2m慢病毒表達載體與pLPl，pLP2，pLP/VSVG(Invitrogen)包裝按照1)中所述方法包裝成慢病毒顆粒，命名為LK-OVA-hβ2m。慢病毒顆粒LK-OVA-hβ2m按照1)中的方法感染K42小鼠胚胎成纖維細胞和細胞系K42-91。穩定感染的K42小鼠胚胎成纖維細胞、細胞系K42-91分別命名為K42-0VA-hβ2m禾口K42-91-0VA_hβ2m。流式細胞儀檢測K42-0VA-hβ2m,K42-91-0VA_hβ2m表面hβ2m禾ΠMHCI(H_2Kb)表達水平流式細胞儀檢測K42-0VA-hβ2m,K42_91-0VA_hβ2m表面hβ2m的表達水平的方法如下收集1XIO5細胞，PBS緩衝液(PH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液(含FBS，0.疊氮鈉的PBS緩衝液)，同時加入2ug抗人微球蛋白β2m的單克隆抗體(Epigen)，於冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(PH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液，並加入5ulFITC標記的山羊抗小鼠IgG(Epigen)避光冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(pH7.4)洗三次後重懸於300ul固定緩衝液(含2%甲醛的PBS緩衝液，pH7.4)上流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測細胞系表面MHCI(H-2Kb)的表達水平的具體方法如下收集1XIO5Cells,PBS緩衝液(pH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液(含1%FBS，0.疊氮鈉的PBS緩衝液)，同時加入2ug抗小鼠MHCI(H_2Kb)複合體的單克隆抗體(Epigen)，於冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(pH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液，並加入5ulFITC標記的山羊抗小鼠IgG(Epigen)避光冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(PH7.4)洗三次後重懸於300ul固定緩衝液(含2%甲醛的PBS緩衝液，pH7.4)上流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測結果如圖3A和B所示，K42-OVA-h02m和K42-91-OVA-h02m表面均有hβ2m表達，並且K42-91-0VA-hβ2m表達較K42_0VA_hβ2m高。K42_91-0VA_hβ2m表面的MHCI(H-Kb)有恢復，說明增加的MHCI主要來自不依賴TAP2的0VA_hβ2m。Westernblot檢測K42_0VA_hβ2m和K42-91-0VA_hβ2m胞內hβ2m蛋白表達水平。以Calnexin的表達作為內參。Westernblot所用抗體檢測hβ2m—級抗體為抗人微球蛋白β2m的單克隆抗體(Epigen)；二級抗體為HRP標記的山羊抗小鼠IgG(SantaCruz,D1807)。檢測Calnexin—級抗體為兔抗人Calnexin抗血清(Epigen)，該抗血清可與小鼠Calnexin交叉反應，二級抗體為HRP標記的山羊抗小鼠IgG(SantaCruz,D1807)。Westernblot檢測結果如圖3C所示，K42_0VA_hβ2m禾口K42-91-0VA_hβ2m胞內有相當水平的hβ2m蛋白表達水平，而在細胞表面K42-0VA-hβ2m比K42-91_0VA_hβ2m的hβ2m蛋白表達水平低，說明在K42-0VA-hβ2m細胞裡，一部分0VA_hβ2m在內質網與TAP轉運的小肽和自身的πιβ2m競爭而被滯留在細胞內部；在K42-91-OVA-hi32m裡，由於TAP功能受到抑制，0VA-hβ2m可以在細胞膜上充分表達。檢測K42-0VA-hβ2m和K42_91-0VA_hβ2m能否被針對OVA表位的T細胞抗原受體識別。具體實驗方法如下K42-0VA-hβ2m,K42-91-0VA_hβ2m,EG7,K42-LK作為靴細胞，B3Z是效應細胞。K42-0VA-hβ2m、K42-91-0VA_hβ2m、EG7細胞(內源性表達OVA雞卵蛋白的EL4細胞)(MooreMW,CarboneFR,BevanMJ.IntroductionofsolubleproteinintotheclassIpathwayofantigenprocessingandpresentation.Cell1988；54777-85.)(Φ|S|f4學院微生物研究所)和K42-LK細胞(K42-LK細胞是經過慢病毒顆粒LK穩定感染篩選出來的單克隆細胞系，慢病毒顆粒LK是LK載體(Sigma，SHCOO1)與pLPl，pLP2和pLP/VSVG包裝成的)分別用含10%FBS的RPMI1640重懸至濃度為1X106/ml，鋪U型孔底的96孔板，取IOOul鋪第1孔，其後每孔倍比稀釋至第6孔，使每孔含細胞懸液均lOOul，細胞數分別為1XIO5,2"1XIO5,2_2XIO5,XIO5,2"4XIO5,2"5XIO50OVA257^264特異性的CD8+T細胞B3Z(KarttunenJ,SandersonS,ShastriN.Detectionofrareantigen-presentingcellsbytheIacZT_cellactivationassaysuggestsanexpressioncloningstrategyforT_cellantigens.ProcNatlAcadSciUSA1992;89:6020-4.)(中國科學院微生物研究所)用含10%85的1^11640重懸至濃度為lX106/ml，向上述每孔中加入lOOul，混勻。然後將96孔板放入5%C0237°C細胞培養箱共孵育12小時，離心收集細胞，棄上清，向細胞中加入100μ1含有底物的裂解液(0.15mM氯苯胺紅-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)(Calbiochem)、0.125%ΝΡ40(EMDSciences,LaJolla,CA)、9mMMgCl2和IOOmM2-巰基乙醇PBS緩衝液)，37°C避光放置4小時，每孔加入50μ1終止反應液(300mM甘氨酸、15mMEDTA)後酶標儀在636nm和595nm分別讀數，0D636作為背景光。結果如圖3D所示，K42-LK細胞不能被0VA257_264特異性的⑶8+T細胞B3Z識別，K42-0VA-hβ2m、K42-91-0VA-hβ2m、EG7細胞能被0VA257_264特異性的CD8+T細胞B3Z識別。OVA257^264多肽分別與RMA-91細胞、RMA-S細胞和RMA細胞共孵育，獲得的細胞分別命名為RMA-91+0VA257_264、RMA-S+OVA257_264和RMA+OVA257_264，方法如下在含10%FBS的RPMI1640培養基中26°C(5%CO2)分別培養RMA，RMA-91及RMA-S24小時，分別取RMA，RMA-91及RMA-S細胞用PBS緩衝液(pH7.4)洗三次，用無血清RPMI1640調整細胞濃度為5X106/ml，鋪24孔板，每孔Iml細胞懸液，同時加入10μ15mg/ml溶於DMSO的0VA257_264多肽(北京塞百勝公司合成，其胺基酸序列為Ser-Ile-Ile-Asn-Phe-Glu-Lys-Leu)，使終濃度為50μg/ml，混勻；26°C放置4小時，再37°C放置4小時；離心，分別獲得RMA-91+0VA257_264、RMA-S+OVA257_264和RMA+0VA257_264細胞。流式細胞儀檢測RMA-91+0VA257_264、RMA+0VA257_264、RMA_S+0VA257_264、K42_0VA_hβ2m和K42-91-0VA-hβ2m、K42小鼠胚胎成纖維細胞、EG7細胞、EL4小鼠淋巴瘤細胞(購自上海坤肯生物化工有限公司QK10063EL4(懸浮)小鼠淋巴瘤細胞)的表面0VA257_264/MHCI表達水平，方法如下離心收集1XIO5細胞，PBS緩衝液(pH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液(含1%FBS,0.1%疊氮鈉的PBS緩衝液)，同時加入2ug抗小鼠Kb-SIINFEKL複合物的單克隆抗體(Epigen)，於冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(pH7.4)洗三次後重懸於200ul流式緩衝液，並加入5ulFITC標記的山羊抗小鼠IgG(Epigen)避光冰上放置30分鐘。PBS緩衝液(pH7.4)洗三次後重懸於300ul固定緩衝液(含2%甲醛的PBS緩衝液，pH7.4)上流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測結果如圖3E和F所示，K42-91-0VA-hβ2m表面0VA257_264/MHCI複合體的表達水平明顯高於K42-0VA-hβ2m或EG7；RMA,RMA-91及RMA-S細胞在相同條件下與多肽0VA257_264共孵育後，TAP2天然缺失的RMA-S細胞以及經小幹擾RNA下調TAP2的RMA-91細胞裝載多肽0VA257_264的能力明顯高於正常細胞RMA。3)高表達0VA257_264/MHCI複合體的抗原呈遞細胞的功能A)針對0VA257_264的特異性細胞毒T細胞的體外殺傷實驗C57BL/6小鼠分為7組，每組3隻，分別免疫RMA+0VA257_264、RMA_91+0VA257_264、RMA-S+0VA257_264、K42-LK、K42_0VA_hβ2m、K42—91_0VA_hβ2m。RMA+0VA257_264、RMA-91+0VA257_264、RMA-S+0VA257_264細胞在免疫前用含10%FBS的RPMI1640調整濃度為5X106/ml，同時加入10μ1lmg/ml用RPMI1640配置的絲裂黴素，使絲裂黴素終濃度為10μg/ml；K42-LK、K42-0VA-hβ2m、K42-91-0VA_hβ2m細胞在免疫前用含10%FBS的RPMI1640調整濃度為5X106/ml，同時加入20μ1lmg/ml用RPMI1640配置的絲裂黴素，使絲裂黴素的終濃度為20ug/ml。絲裂黴素處理一小時後用PBS洗各細胞三次，然後腹腔注射免疫小鼠，每隻小鼠注射5XIO6個細胞/500μ1PBS,每7天免疫一次，共三次；僅注射PBS的小鼠作為沒有免疫的對照組。收集脾細胞。最後一次免疫10天後無菌環境下取各組小鼠的脾臟，放置細胞濾膜上，將脾臟和細胞濾膜放入裝有4mlRPMI1640的6cm細胞培養皿裡，用注射器活篩前端輕輕碾磨脾臟，使脾細胞充分釋放，將脾細胞離心，齊上清，加入IOml血紅細胞裂解液(139.6mmol/LNH4Cl,16.96mmol/LTris，用lmol/LHCl調pH至7.2)，混勻靜止4-5分鐘，待紅細胞完全破碎，1500rpm離心5分鐘，棄上清去除紅細胞，得到白細胞沉澱。將細胞沉澱用含10%FBSRPMI1640洗三次後，調整細胞濃度為3XlO6Ail，鋪24孔細胞培養板，每孑LIml細胞懸液，同時力口入20uIL-2(ChironB.V.，Amsterdam,theNetherlands)及10μ15mg/ml溶於DMSO的0VA257_264多肽(北京塞百勝公司合成)，使終濃度為50μg/ml。放置5%C02，37°C細胞培養箱。脾細胞在體外用0VA257_264#肽刺激5天後，取脾細胞，用含10%FBSRPMI1640洗二次後，離心收集脾細胞，用含10%FBSRPMI1640重懸，調整細胞濃度為8XlO6Ail，鋪U型孔底的96孔板，取IOOul鋪第1孔，其後每孔倍比稀釋至第4孔，使每孔含細胞懸液均lOOul，細胞數分別為8X105，4X105，2X105，1X105。脾細胞作為效應細胞，EG7和EL4分別作為靶細胞。分別取106-107EG7和EL4用PBS洗三次後，重懸於200ulHank平衡鹽溶液(HBSS)(8g/LNaCl、0.4g/LKC1、lg/L葡萄糖、60mg/LKH2PO4,47.5mg/LNa2HPO4,pH至7·2)，加入CFSE(Wako，341-07401)螢光染料，CFSE終濃度為2uM，37°C避光水浴10分鐘。用FBS血清中和後用含10%FBSRPMI1640洗三次並重懸，調整細胞濃度為105/ml，按照每孔加入IOOul分別加入到上述鋪有脾細胞的96孔板中，混勻，另鋪一孔只含有CFSE染色的靶細胞作對照組。37°C(5%CO2)培養6小時後吸取各孔中的混合細胞，用10μg/mlpropidiumiodide(PI)(Sigma-Aldrich,Poole,England,P4170)螢光染料室溫染色3分鐘，上流式細胞儀檢測，計算殺傷率，公式如下%特異性死亡全部CFSE+PI+(死亡)細胞自發性CFSE+PI+(死亡)細胞/(100%自發性CFSE+PI+(死亡)細胞)X100%；公式中全部CFSE+PI+(死亡)細胞為CFSE和PI染色均呈陽性的細胞；自發性CFSE+PI+(死亡)細胞為在相同條件下，在只有靶細胞的對照組中CFSE和PI染色均呈陽性的細胞。殺傷率的結果如圖4A和B所示，高表達0VA257_264/MHCI複合體的細胞系RMA-91+0VA257_264、RMA-S+0VA257_264、K42-91-0VA-hβ2m誘導的細胞毒T細胞對EG7有特異性殺傷，而對EL4沒有殺傷作用。RMA+0VA257_264和K42-0VA-hβ2m對EG7有較低的殺傷，對EL4沒有殺傷作用。B)小鼠體內的抑瘤實驗C57BL/6小鼠分為6組，每組10隻，分別免疫RMA+0VA257_264、RMA-91+0VA257_264、RMA-S+0VA257_264、K42-0VA-hβ2m和K42_91-0VA_hβ2m，腹腔注射免疫小鼠，每隻小鼠注射5XIO6細胞/500μ1PBS，每7天免疫一次，共三次，僅注射PBS的小鼠作為沒有免疫的對照組。最後一次免疫的12天後，在小鼠右腋皮下注射3XIO6個EG7細胞/200μ1PBSj^察小鼠瘤的生長情況。待實體瘤生長後，隔日測量瘤體積(V=Jiab72，a為長徑，b為垂直短徑)並記錄各組小鼠成活率。瘤體積測量結果如圖4C所示，免疫RMA-91+0VA257_264的C57BL/6小鼠、免疫RMA-S+0VA257_264的C57BL/6小鼠、免疫K42_91-0VA_hβ2m的C57BL/6小鼠較之免疫RMA+0VA257_264的C57BL/6小鼠或免疫K42_0VA_hβ2m的C57BL/6小鼠長瘤延遲，發展慢，實體瘤體積小。K42-91-0VA-hβ2m效果最好。當實體瘤體積超過25000mm3時，小鼠奄奄一息，此時對小鼠實施處死，處死當天記為存活天數。小鼠成活率結果如圖4D所示，免疫RMA-91+0VA257_264的C57BL/6小鼠、免疫RMA-S+0VA257_264的C57BL/6小鼠、免疫K42-91_0VA_hβ2m的C57BL/6小鼠存活天數明顯比免疫RMA+0VA257_264的C57BL/6小鼠或免疫K42_0VA_hβ2m的C57BL/6小鼠的天數長。在觀察的50天內，其中免疫RMA-91+0VA257_264的C57BL/6小鼠、免疫RMA_S+0VA257_264的C57BL/6小鼠中各有1隻小鼠未長瘤；免疫K42-OVA-h02m的C57BL/6小鼠中有2隻未長瘤。K42-91-0VA-hβ2m效果最好。綜上所述，高表達0VA257_264/MHCI複合體的細胞系RMA-91+0VA257_264、RMA-S+0VA257_264、K42-91-0VA-hβ2m能誘導特異的細胞毒T細胞，可以作為疫苗。序列表中國科學院微生物研究所抗原呈遞細胞及其製備方法與應用CGGNARW9212521435DNA人工序列1atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctcgagggc60agtataatcaactttgaaaaactgggtggcggatcgggcggaggcggatcaggaggctca120ggtgggtcaggaggcatccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagca180gagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacatt240gaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtct300ttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaa360gatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtgg420gatcgagacatgtaa4352119PRT人工序列2MetSerArgSerValAlaLeuAlaValLeuAlaLeuLeuSerLeuSer151015GlyLeuGluGlylieGlnArgThrProLyslieGlnValTyrSerArg202530HisProAlaGluAsnGlyLysSerAsnPheLeuAsnCysTyrValSer354045GlyPheHisProSerAsplieGluValAspLeuLeuLysAsnGlyGlu505560ArglieGluLysValGluHisSerAspLeuSerPheSerLysAspTrp65707580SerPheTyrLeuLeuTyrTyrThrGluPheThrProThrGluLysAsp859095GluTyrAlaCysArgValAsnHisValThrLeuSerGlnProLyslie100105110ValLysTrpAspArgAspMet11權利要求製備抗原呈遞細胞的方法，是在抗原處理相關性轉運體蛋白表達下調的離體的抗原呈遞細胞中表達抗原決定簇-人源β2微球蛋白融合蛋白，獲得在細胞表面表達抗原決定簇/MHCI複合體的抗原呈遞細胞。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述表達抗原決定簇-人源β2微球蛋白融合蛋白的方法是將編碼抗原決定簇的DNA分子與編碼人源β2微球蛋白的DNA分子連接獲得融合基因，將所述融合基因導入抗原呈遞細胞中表達所述融合蛋白。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述抗原處理相關性轉運體蛋白表達下調的抗原呈遞細胞是將針對抗原處理相關性轉運體蛋白基因的RNA幹擾載體導入抗原呈遞細胞獲得的。4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述針對抗原處理相關性轉運體蛋白基因的RNA幹擾載體為慢病毒載體，逆轉錄病毒載體，腺病毒載體，痘苗病毒，質粒載體或小環DNA載體。5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述慢病毒載體為LK-siTAP2-88、LK-siTAP2-89、LK_siTAP2_90、LK_siTAP2_91或LK_siTAP2_92。6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述人源β2微球蛋白的胺基酸序列如序列表中的序列2所示。7.權利要求1至6中任一所述方法製備的抗原呈遞細胞。8.權利要求1至6中任一所述方法或權利要求7所述抗原呈遞細胞在製備疫苗中的應用。9.一種疫苗，其活性成分為權利要求1至6中任一所述的抗原呈遞細胞。全文摘要本發明公開了一種抗原呈遞細胞及其製備方法與應用。本發明的製備抗原呈遞細胞的方法，是在抗原處理相關性轉運體蛋白表達下調的離體的抗原呈遞細胞中表達抗原決定簇-人源β2微球蛋白融合蛋白，獲得在細胞表面表達抗原決定簇/MHCI複合體的抗原呈遞細胞。本發明的方法能用於製備各種種屬和基因型的細胞，特異性的高水平提呈各種外源性抗原決定簇，特別是製備人源的專職抗原呈遞細胞，並應用於提呈親合力較低的外源抗原決定簇。本發明的方法製備的抗原細胞呈遞可用來製備疫苗，在細胞疫苗的研製和T細胞過繼治療中有深遠的應用前景。文檔編號C12N5/10GK101824434SQ20091007885公開日2010年9月8日申請日期2009年3月4日優先權日2009年3月4日發明者劉長振,吳瑩,高斌申請人:中國科學院微生物研究所