一株高耐受釀酒酵母菌株及其構建方法與流程
2023-10-18 01:58:49
本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一株高耐受釀酒酵母菌株及其構建方法。
背景技術：
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乙醇是重要的化工原料、有機溶劑、消毒劑及飲料酒勾兌的原料。隨著地球上化石能源(石油、煤炭、天燃氣等)的日趨枯竭和全球環境保護意識的不斷加強乙醇將成為未來主要的可再生能源之一。然而，例如高溫、高滲透壓、高乙醇濃度等脅迫條件都會影響酵母細胞的生長，進而影響乙醇的產量。在濃醪發酵過程中，溫度過高就需要用冷水降溫，這也會降低乙醇生產的經濟效益。因此，提高工業生產釀酒酵母的高溫耐受性，可以從節約冷卻水方面提高生物乙醇生產的經濟效益。
對於調節酵母細胞的耐受性，Ras-cAMP信號通路起著關鍵作用，CYR1基因編碼的腺苷酸環化酶是該通路的關鍵酶，催化cAMP的合成。研究發現，cAMP作為釀酒酵母生理活動的第二信使，在調節細胞生長、代謝和壓力抗性方面起著重要的作用。有報導將反轉錄轉座子Ty元件插入到CYR1基因的5』端編碼區或非編碼區可以構建出具有多種壓力抗性的突變菌株，這樣做會導致腺苷酸環化酶活性減弱(約比野生型菌株低三倍)，這些突變株不但對致死熱激具有抗性，而且對其它的壓力條件如紫外照射，高乙醇濃度等也具有抗性。劉瑩等研究發現將酵母細胞的CYR1基因敲除會具有較高的熱抵抗能力。
Ras-cAMP信號通路活性的改變會影響酵母細胞的耐受性。通過對CYR1基因的表達調控，實現酵母細胞對脅迫環境的耐受性的改變。改變啟動子強度是實現基因表達調控的重要途徑。融合PCR可以實現基因片段的無縫拼接，且不受有限的酶切位點選擇的限制，從而避免了傳統的質粒構建過程中重複的酶切和連接操作。利用融合PCR和整合型載體質粒YIplac211介導的兩步整合方法，在不殘留標記基因的前提下，實現對CYR1啟動子3』端序列的不同程度敲除，進而構建帶有CYR1啟動子強度弱化的釀酒酵母菌株。構建的高耐受釀酒酵母菌株可安全用於工業生產，同時融合PCR介導的兩步整合方法可廣泛應用於酵母及其他微生物啟動子調控，促進了基因精確修飾的發展。
技術實現要素：
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本發明解決的技術問題是提供一株高耐受釀酒酵母菌株及其構建方法。
為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案：
本發明提供的高耐受釀酒酵母菌株是對高溫和乙醇具有一定耐受性的酵母菌株。獲得高耐受釀酒酵母菌株的出發酵母菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315，保存於中國工業微生物菌種保藏管理中心，公眾可購買獲得。
所述高耐受釀酒酵母菌株在正常的生長性能不受影響的情況下，對55℃熱擊以及8％(v/v)乙醇都有一定的耐受性，並且在40℃玉米原料高溫濃醪發酵中乙醇產量相對親本菌株提高了14.6％。
所述高耐受釀酒酵母菌株具體可以通過對出發菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315的腺苷酸環化酶編碼基因CYR1啟動子的-150bp至-30bp(ATG＝+1)這一序列無痕敲除來實現。
上述基因無痕敲除可以用以下方法實現。各步驟所涉及具體操作方法參考現有文獻報導，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1995。
用PCR方法獲得突變ura3片段，將其通過醋酸鋰化學轉化法導入到釀酒酵母出發菌株，通過同源重組實現出發菌株的URA3基因突變；用PCR方法分別擴增靶序列上遊和下遊長度約為1.2kb的同源序列片段，然後通過融合PCR，將上、下遊序列融合成無縫片段；將該片段克隆至酵母整合質粒YIplac211上，獲得能夠進行整合敲除的質粒；在整合敲除質粒的上遊同源臂或者下遊同源臂中，選擇合適的單一酶切位點，將質粒酶切線性化；通過醋酸鋰化學轉化法，將線性化的整合敲除質粒導入釀酒酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培養基篩選發生第一步整合重組的酵母突變株；將經過鑑定的發生第一步整合重組的酵母突變株，經含有5-氟乳清酸合成培養基平板反向篩選獲得發生第二步整合重組的酵母突變株；用PCR方法獲得出發菌株正常的URA3基因片段，將其導入到發生了二步整合重組的酵母突變株中，以回復突變的ura3標記基因。
本發明所述釀酒酵母菌株可應用於生物燃料乙醇生產中。
有益效果：
1、本發明提供一種高耐受的釀酒酵母菌株，克服了普通釀酒酵母在脅迫條件下生長不好的問題。
2、本發明提供的高耐受的釀酒酵母菌株是在保持優良發酵性能的前提下，腺苷酸環化酶的編碼基因CYR1的表達量有一定程度的降低，進而降低了酵母細胞的Ras-cAMP信號通路的活性，使得酵母細胞的耐受性發生變化，為生物燃料乙醇的生產奠定了理論基礎，而且具有重要的市場價值。
3、本發明所使用的靶序列敲除方法，避免了酵母傳統敲除過程中篩選標記殘留的問題，滿足自克隆的條件，可以安全的用於工業生產。並且本方法在基因精確修飾方面具有廣闊的應用前景。
附圖說明：
圖1為AY15aΔU的表型驗證；
圖2為重組質粒的構建流程示意圖；
圖3為重組質粒的酶切驗證圖：
泳道M為DNA maker；1：SalI和BamHI雙酶切載體質粒YIplac211；2-6：分別是SalI和BamHI雙酶切YIplac211-UD-30、YIplac211-UD-60、YIplac211-UD-90、YIplac211-UD-120、YIplac211-UD-150；
圖4為酵母重組菌株的構建流程示意圖；
圖5為發生第一步整合重組的菌株的電泳驗證圖：
泳道M為DNA maker；1：AY15aΔU為模板；2-6：模板分別為AY15aΔU-U-30、AY15aΔU-U-60、AY15aΔU-U-90、AY15aΔU-U-120、AY15aΔU-U-150，CYR1-U-F和YIp-D-F為驗證引物；7：AY15aΔU為模板；8-13：模板分別為AY15aΔU-U-30、AY15aΔU-U-60、AY15aΔU-U-90、AY15aΔU-U-120、AY15aΔU-U-150，YIp-U-R和CYR1-D-R為驗證引物；
圖6為發生第二步整合重組的菌株的電泳驗證圖：
泳道M為DNA maker；1：AY15aΔU為模板；2-6：模板分別為AY15aΔU-30、AY15aΔU-60、AY15aΔU-90、AY15aΔU-120和AY15aΔU-150，CYR1P-U和CYR1P-D為驗證引物；
圖7為酵母重組菌株的測序驗證；
圖8為親本菌株和酵母重組菌株的生長曲線：
其中，A：培養溫度為30℃，B：培養溫度為40℃；
圖9為親本菌株和酵母重組菌株的耐受性實驗結果圖。
具體實施方式：
下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的範圍，本發明的實質和範圍僅由權利要求書所限定。對於本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和範圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬於本發明的保護範圍。
實施例1：CYR1啟動子部分缺失釀酒酵母菌株的構建
本實例所用的出發菌株CICC32315。所述大腸桿菌DH5a購自Takara公司。所述YPD培養基為通用的完全培養基，固體培養基含2％進口瓊脂粉。
根據Genebank中的酵母基因組數據和整合質粒序列，設計了下述引物。
表1本實施例中所用到的引物
註：小寫字母表不酶切位點，下劃線表不融合PCR所用引物的重疊序列。
(1)帶有缺陷ura3基因的釀酒酵母AY15aΔU的構建
使用Solarbio公司的酵母基因組提取試劑盒，提取實驗室菌株W303-1a的基因組。利用引物對URA3-F和URA3-R，以W303-1a的基因組為模板，PCR擴增菌株W303-1a突變ura3片段。經過試劑盒回收以後，將片段通過醋酸鋰化學轉化法導入到親本菌株CICC32315中，通過突變ura3與正常URA3之間的同源重組，實現標準菌株的URA3基因突變。轉化後的菌懸液，塗布於補加了5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶(uracil)酵母合成培養基(SD)平板上，30℃培養48h，獲得帶有缺陷ura3基因的釀酒酵母AY15aΔU。獲得的突變株經過表型驗證確定正確，如圖1所示AY15aΔU在酵母合成培養基上不長，在YPD平板上生長良好。
(2)整合敲除質粒YIplac211-UD-120的構建
首先，以親本菌株CICC32315的基因組為模板，使用引物pCYR1-U-SalI和rCYR1-U-Δ120通過PCR獲得靶序列pCYR1-120左側1151bp的基因序列，PCR反應條件：95℃5min；94℃40s，53℃1min，72℃80s，30個循環；72℃10min；同時使用引物pCYR1-D-Δ120和rCYR1-D-BamI擴增靶序列右側1201bp的基因序列，PCR反應條件：95℃5min；94℃40s，53℃1min，72℃80s，30個循環，72℃10min，分別命名為U-120和D-120。然後，以U-120和D-120的混合物為模板，加入引物pCYR1-U-SalI和rCYR1-U-Δ120進行融合PCR，獲得無縫融合片段。經過切膠回收(試劑盒)後，分別用SalI和BamHI雙酶切，最後亞克隆到整合質粒YIplac211的相應酶切位點中，整合敲除質粒YIplac211-UD-120構建成功，缺失序列大小為120bp，構建流程如圖2所示。為了確定最優的CYR1啟動子強度，用同樣的質粒構建方法構建了其他四種重組質粒，，分別為YIplac211-UD-30(缺失序列大小為30bp)、YIplac211-UD-60(缺失序列大小為60bp)、YIplac211-UD-90(缺失序列大小為90bp)、YIplac211-UD-150(缺失序列大小為150bp)，將這五種質粒統稱為YIplac211-UD*。圖3為重組質粒YIplac211-UD*的酶切驗證圖。
上述融合PCR法為本領域公知的採用具有互補末端的引物，形成具有重疊序列PCR產物，通過PCR產物重疊序列延伸，從而將任意DNA片段連接起來的方法，此技術不需要內切酶的消化和連接酶的處理，就可實現DNA片段的體外連接，這使得整合質粒經過兩步整合重組後，酵母基因組不會殘留外源酶切位點。
(3)CYR1啟動子部分缺失酵母突變株的構建
BglII酶切重組質粒YIplac211-UD*；用醋酸鋰化學轉化法將線性化的重組質粒YIplac211-UD*導入缺陷型酵母菌株AY15aΔU中，經過兩步整合重組後，得到CYR1基因啟動子3』端部分缺失的釀酒酵母，兩步整合重組過程如圖4。
第一步整合重組的發生，是由於導入的線性化質粒與酵母基因組的同源部分發生整合，從而將整個質粒帶入基因組。轉化後的菌懸液，塗布於不含尿嘧啶的酵母合成培養基平板上，30℃培養48h，獲得發生第一步整合重組的酵母菌株，分別命名為AY15aΔU-U-30、AY15aΔU-U-60、AY15aΔU-U-90、AY15aΔU-U-120和AY15aΔU-U-150，這5株菌統稱為AY15aΔU-U*。採用CYR1-U-F和YIp-D-F，YIp-U-R和CYR1-D-R為驗證引物，進行PCR驗證篩選。當使用引物對CYR1-U-F和YIp-D-F進行PCR驗證時，因為下遊引物YIp-D-F的退火序列在YIplac211載體質粒上，所以酵母菌株AY15aΔU無特異性條帶，而一步整合重組菌株AY15aΔU-U*應有一條大小為1800bp左右的條帶；當使用引物對YIp-U-R和CYR1-D-R進行PCR驗證時，因為上遊引物YIp-U-R的退火序列在YIplac211載體質粒上，所以酵母菌株AY15aΔU無特異性條帶，而一步整合重組菌株AY15aΔU-U*應有一條大小為3000bp左右條帶。PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳結果見圖5。轉化子與對照比較結果顯示，線性化的質粒整合到目的位點。
經過篩選和鑑定的一步整合重組酵母菌株AY15aΔU-U*，取一環接到5ml液體YPD培養基中，30℃下200rpm振蕩12h後，稀釋10倍塗布於含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的酵母合成培養基平板上，30℃培養48h，獲得發生第二步整合重組的酵母菌株，第二步整合重組後，出現兩種結果：一，如果上遊同源序列(U)形成的重複序列之間發生整合，則酵母回復成出發菌株AY15a；二，如果下遊同源序列(D)形成的重複序列之間整合，則中間的所有序列彈出，實現啟動子的精確敲除，同時靶位置上不引入任何外源基因。挑選所得到的單菌落，採用引物對CYR1P-U和CYR1P-D，進行PCR驗證，PCR產物條帶大小應該分別為366bp、336bp、306bp、276bp、246bp和216bp。篩選出啟動子靶序列部分得到精確敲除的轉化子，分別命名為AY15aΔU-30、AY15aΔU-60、AY15aΔU-90、AY15aΔU-120和AY15aΔU-150。PCR產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳結果見圖6。轉化子與對照比較結果顯示，CYR1的啟動子部分得到不同程度的敲除。
(4)二步重組釀酒酵母菌株突變ura3基因的回覆
同本實例中(1)所述的方法，利用引物對URA3-F和URA3-R，擴增AY15a正常URA3基因片段，通過醋酸鋰化學轉化，以回復二步重組酵母菌株突變的ura3基因，最終構建出不殘留任何外源基因序列的無痕敲除菌株，分別命名為AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120、AY15a-150。
分別提取二步整合重組酵母菌株的基因組，使用引物對CYR1P-F和CYR1P-R進行PCR反應。PCR反應產物經華大基因公司測序，測序結果與NCBI公布序列比對，驗證結果如圖7。從圖7可以看出了AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120、AY15a-150的CYR1的啟動子缺失情況分別為30bp、60bp、90bp、120bp、150bp。
實施例2：CYR1啟動子部分缺失釀酒酵母菌株生長性能測定及耐受性實驗
(1)CYR1啟動子部分缺失釀酒酵母菌株的生長性能測定
測定親本菌株CICC32315及其轉化子AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120、AY15a-150在30℃和40℃條件下的生長性能，結果如圖8。結果顯示，對CYR1啟動子的部分敲除在沒有明顯影響酵母在30℃的生長性能的前提下，40℃下的酵母細胞的生長性能都得到了一定程度的提高。
(2)CYR1啟動子部分缺失釀酒酵母菌株的耐受性實驗
利用稀釋點板實驗測定親本菌株CICC32315及其轉化子AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120、AY15a-150的耐受性變化。
培養條件：
一級：取一環菌泥接於5mLYPD液體中，30℃，180rpm，培養12h。
二級：取200μL一級菌液接於5mLYPD液體中，30℃，180rpm，培養6-8h至酵母細胞的對數期。
調節對數期的酵母細胞的OD600＝1.2，用於做耐受性實驗。對單倍體親本及其轉化子各取200μL用於熱擊實驗，55℃熱擊3min，並且稀釋至10-4，然後從不同稀釋度各取3μL未做熱擊實驗的菌液和做熱擊實驗菌液分別點接於YPD平板上；再從不同稀釋度各取3μL未做熱擊實驗的菌液分別點接於含有260g/L葡萄糖或者8％(v/v)乙醇的YPD平板上，30℃培養3天，拍照。結果如圖9。結果顯示AY15a-90和AY15a-120不但表現出很好的耐熱性能，而且對8％(v/v)乙醇的耐受性也有一定程度的提高。
實施案例3：菌株AY15a-90和AY15a-120玉米原料濃醪發酵實驗
(1)AY15a-90和AY15a-120與親本菌株的玉米原料濃醪發酵實驗
將親本菌株CICC32315及轉化子AY15a-90和AY15a-120分別同時進行玉米濃醪發酵實驗，發酵工藝路線圖：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷卻→接菌→發酵→蒸酒→測定指標；
工藝條件：
浸泡條件：60～70℃，浸漬20min；液化條件：85～90℃，加入耐高溫α-澱粉酶，液化90min；糖化條件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20min；
配料：玉米粉60g，水180mL，耐高溫α-澱粉酶2×105U/mL，30μL，糖化酶200U/mL，90μL，2.5×103U/mL酸性蛋白酶1.2mL；營養鹽1mL(MgSO4 150g/L、KH2PO4 75g/L、尿素81g/L，過濾，4℃保存)；接種量：7.5％，30℃放置12h，再放入40℃，發酵3天，發酵結束後測定各菌株的發酵性能(CO2失重、乙醇產量、殘糖)；結果見表2。
表2菌株發酵結果比較
註：所示數據為三個平行試驗的結果。
表2顯示，在40℃下的高溫濃醪發酵條件下，轉化子AY15a-90和AY15a-120的CO2失重和乙醇產量都較親本菌株有所提高，AY15a-90和AY15a-120的乙醇產量相對親本菌株分別提高了14.0％和14.6％，說明AY15a-120是優於AY15a-90的高耐受釀酒酵母菌株。