檢測多樣本多位點snp的檢測方法
2023-10-04 11:44:24
專利名稱：檢測多樣本多位點snp的檢測方法
技術領域：
本發明屬於基於微陣列晶片的基因多態性(SNP)的多樣本多位點檢測技術，特別 涉及一種高靈敏高通量的多樣本多位點SNP的檢測方法。
背景技術：
SNP檢測方法的研究是研究疾病發生相關SNP的前提和基礎。SNP的檢測方法與 核酸序列測定不同，它需要檢測出基因組DNA中某一特定核苷酸位置上轉換、顛換、插入或 缺失鹼基的變化，對檢測的靈敏度、通量以及準確性等都有極高的要求，檢測方法比DNA測 序更為複雜和煩瑣。截至目前已報導的SNP檢測方法約有70種之多。針對單個或多個目 的基因的分析，較常用的方法有以下幾種。首先是1995年Livak等報導TaqmMan探針SNP 分型法_，該方法將引物設計在具有SNP位點的序列位置，通過檢測PCR過程中產生的熒 光信號來區分等位基因的SNP類型，具有分析簡單的特點，經常被用於樣本的SNP檢測，但 探針較為昂貴。限制性酶切片段長度多態性分析(RFLP)[21]、隨機擴增多態性(RAPD) [22]和 寡核苷酸連接分析(OLA)[23]也是較為常用的三種方法，這幾種方法檢測信息準確，但都較 為煩瑣。以上這些方法一次只能檢測一個基因或一個樣本，無法實現高通量分析，不適合用 於癌痛相關基因的SNP分析和篩選上。為實現SNP的高通量分析，全世界許多實驗室，包括國內多家實驗室做了大量的 研究工作並報導了多種高通量SNP分析方法。在這些報導的方法中，等位特異探針雜交法 是最為成熟與完善的一種方法，該方法先將合成的探針固定到晶片上，然後待測基因經提 取、片段化、擴增、螢光化學標記與純化後，再與晶片進行雜交，即可檢測出樣本信息。該方 法發展至今已實現一次實驗對多個位點的SNP進行規模化篩選，適合用於疾病相關SNP位 點的初篩。該方法雖已實現了商品化，但建立耗費巨大，仍無法實現對多樣 本的平行性檢 測，且約有20% SNP信息得不到證實。SNP分型的等位特異引物延伸法，該晶片由多對延伸 探針構成，與擴增出的靶序列雜交後進行延伸。該方法能夠實現SNP分型的自動化，成本較 低。但是由於不同探針的融鏈溫度相差較大而導致延伸條件難以被優化，進而造成對多位 點SNP檢測的困難。基於多相PCR及化學發光技術以鏈黴親和素修飾的384微孔板為載體， 發展了一種對多樣本多位點SNP的檢測方法，該方法具有檢測特異性高、重複性好的優點， 但微孔板的孔數和大小卻限制了檢測樣本和SNP位點的數量，且因鏈黴親和素修飾基底的 背景高而導致了對微量樣本的檢測困難。以及其它多種方法都或多或少的存在不同的局限 性。
發明內容
基於以上原因，本發明擬提供一種高靈敏度、高特異性、低成本、操作簡便易行、平 行性分析基因的多樣本多位點SNP信息的有效方法。本發明是以如下技術解決方案實現的首先，設計寡核苷酸晶片；在單管中用不 同Padlock探針捕獲同一樣本的不同SNP位點，有對應SNP位點存在的Padlock探針發生環化，否則不環化；然後用特異擴增引物與Padlock探針進行雜交並進行滾環擴增，環化的 Padlock探針可以進行擴增，未環化的則無法擴增；最後將不同樣本的不同SNP擴增產物按 照一定的順序固定在同一晶片上，製備出待測多樣本多位點SNP微陣列；最後用通用螢光 探針進行檢測，根據微陣列點螢光信號的顏色判斷SNP的分型紅或綠代表野生型或突變 型，黃則代表雜合型。所述的寡核苷酸DNA晶片由晶片和被固定到晶片上的的寡核苷酸組成。 所述的寡核苷酸DNA的晶片是普通玻璃片或是微球；其表面修飾是聚丙烯醯胺修 飾、醛基修飾或鏈黴親和素修飾；而相對應的被固定的寡核苷酸的5』端則是丙烯醯胺修 飾、氨基修飾或生物素修飾。所述的Padlock探針是一段合成的寡核苷酸組成，包括三部分，探針兩端的每 一端鹼基長度為18-25bp，與待檢測序列互補，用於檢測靶序列；中間由一段鹼基長度為 40-60bp序列連接，Padlock探針與待測分子雜交後，中間形成一個缺口，該缺口在連接酶 的作用下可連接成一個單鏈環，以此環為模板常溫滾環擴增。所述的的微陣列信號是通過和環形探針特定片段互補的螢光探針雜交得到；或通 過滾環過程中螢光標記的dNTP參入到延伸核苷酸序列上得到；或者通過滾環擴增後得到 的單鏈DNA延伸成雙鏈DNA後，再同SUBGREEN染料結合後得到。所述的多樣本多位點SNP微陣列是同一個晶片上固定了不同的待測樣本，而同一 樣本有又包含了不同的SNP位點。本發明的有益效果是a.實現不同樣本不同SNP位點的平行性檢測。通過不同 Padlock探針對不同SNP位點信息的準確識別，從而實現對對同一樣本不同SNP位點的檢 測。不同樣本的每一 SNP/Padlock探針雜交後的複合體，在不同單管中完成滾環擴增後，再 固定到同一晶片上，則可實現對不同樣本不同SNP的檢測。b.檢測SNP位點信息的準確性與靈敏度高。由於Padlock探針識別SNP位點的特 異性與準確性，從而保證了 SNP位點識別的準確性；此外，基因的滾環擴增同普通的PCR擴 增相比，具有擴增單分子DNA的能力，同時通過滾環擴增還能實現對檢測信號成千上萬倍 的放大，因而具有靈敏度與特異性極高的特點，這進一步保證了對微量樣本檢測高靈敏度。 c.靶標檢測的高通量。因該晶片同時能檢測不同樣本與同一樣本的不同的SNP位點，因而 可實現對樣本和SNP位點檢測的高通量。d.低成本。對於晶片的檢測來說，螢光探針是成 本高的主要原因。本發明中應用通用螢光檢測探針或直接將螢光標記的dNTP參入擴增產 物，極大降低了試驗成本。e.極好的重複性與均一性。f.該晶片還具有製備簡單、操作方 便的特點。
圖1是檢測不同樣本不同SNP位點的原理示意圖；或稱Padlock探針捕獲SNP示 意圖。其中(a). Padlock探針序列結構示意圖。A 靶標互補序列；B 通用螢光檢測探針 雜交序列；C:通用滾環引物雜交序列；D 連接序列。(b).不同Padlock探針捕獲SNP示意
圖。A1、A2、A3......An為基因組DNA上不同SNP位點；P1、P2、P3......Pn為不同Padlock探針。
圖2是檢測多樣本多位點熱聚凝膠DNA晶片的製備方法示意圖。其中(a).單管中Padlock探針捕獲不同SNP位點；(b).特異擴增引物與環化探
針的雜交；SP1、SP2、SP3......SPn為針對不同SNP位點的特異擴增引物；(c).待測多 樣本
多位點凝膠DNA晶片；橫向為不同雜交子(特異引物-環化Padlock探針)的微陣列，縱向 為不同待測樣本I、II、III......N。圖3是利用該方法同時檢測4個人的5個氨基丁酸受體基因SNP的晶片結果。4 個人 5 個氨基丁酸受體基因 SNP 位點(rs34377097(G/T)、rs28362459(G/T)、 rs61758388(G/T)、rs2228063(A/G)和 rs29001653 (A/G))的晶片結果。紅色代表突變型； 綠色代表野生型；黃色代表雜合型。
具體實施例方式下面結合實施例進一步說明本發明的方法和效果。實施例1實現COMT 基因 10 個多態性位點(rsl5761987，rsl5761985, rsl5761983, rsl5761981,rsl5761980,rsl5761978,rsl5761977,rsl5761976, rsl5761975, rsl5761967)
與術後芬太尼鎮痛劑量的相關性研究。針對上述10個SNP位點，設計對應的Padlock探針(兩端各長18bp 分別與SNP 所在位點兩邊的序列互補，SNP位點與5』端的鹼基對應；中間長50bp(見附表1 (1)) ；5』端 有丙烯醯胺修飾的特異性擴增引物(同Padlock探針5』端18個鹼基序列互補)以及通用 螢光檢測探針(見附表1 (2)用來檢測SNP突變型位點；見附表1 (3)用來檢測SNP野生型 位點)；在同一反應管中用不同Padlock探針捕獲同一樣本的10個SNP位點，並用連接酶 連接Padlock探針，有對應SNP位點存在的Padlock探針發生環化，否則不環化；然後用特 異擴增引物與Padlock探針進行雜交並用高保真的Bst進行恆溫滾環擴增，環化的Padlock 探針可以進行擴增，未環化的則無法擴增；最後將400個人的不同擴增產物按照一定的順 序固定在同一張修飾有丙烯醯胺凝膠晶片上，並用通用螢光探針進行雜件。根據微陣列點 螢光的顏色判斷SNP的分型紅或綠代表野生型或突變型，黃則代表雜合型。最後進行COMT 基因10多態性位點與術後芬太尼鎮痛劑量的相關性分析。實施例2對200 人的染色體6q25. 1 區域4個 SNP位點分型(rs6929137 (G/A)、rsl999805 (T/ C)、rs4870044(G/A)、rsl038304(A/G))的檢測，進而研究基因多態性與絕經後婦女骨密度 和椎體骨折的相關性針對rs6929137 (G/A)、rsl999805 (T/C)、rs4870044 (G/A)、rsl038304 (A/G) 4 個 SNP位點，設計對應的Padlock探針、特異性擴增引物以及通用螢光檢測探針(序列特徵 均同實施例1)；在同一反應管中用不同Padlock探針捕獲同一樣本的四個SNP位點，並用 連接酶連接Padlock探針，有對應SNP位點存在的Padlock探針發生環化，否則不環化；然 後用特異擴增引物與Padlock探針進行雜交並用高保真的Bst進行恆溫滾環擴增，環化的 Padlock探針可以進行擴增，未環化的則無法擴增；最後將200人的800個擴增產物按照一 定的順序固定在同一晶片上，並用通用螢光探針進行雜件。根據微陣列點螢光的顏色判斷 SNP的分型紅或綠代表野生型或突變型，黃則代表雜合型。進而對200個樣本與4個SNP位點的相關性進行研究。實施例3
實現類風溼關節患者的疼痛程度與HLA-II類基因SNP的關聯性進行研究針對HLA-DRBl 基因的 3 個 SNP 位點(rsl059576、rsl059582、rsl059586)、 HLA-N0TCH4 基因 2 個 SNP 位點(rs2071282、rs2071283)以及 HLA-DQB2 基因的 1 個 SNP(rsl049110)位點，設計對應的Padlock探針(兩端各長18bp，中間長50bp)，5，端有生 物素修飾的特異性擴增引物以及通用螢光檢測探針(序列特徵均同實施例1)；在同一反應 管中用不同Padlock探針捕獲同一樣本的6個SNP位點，並用連接酶連接Padlock探針，有 對應SNP位點存在的Padlock探針發生環化，否則不環化；然後用帶有生物素修飾的特異擴 增引物與Padlock探針進的雜交並用高保真的Bst進行恆溫滾環擴增，環化的Padlock探 針可以進行擴增，未環化的則無法擴增；最後將400個人的不同擴增產物按照一定的順序 固定在鏈黴素修飾的玻片上，並用通用螢光探針進行雜件。最後對晶片進行掃描和數據處 理。根據不同微陣列點螢光顏色判斷SNP的分型紅或綠代表野生型或突變型，黃則代表雜 合型。從而實現類風溼關節患者的疼痛程度與HLA-II類基因各SNP位點的關聯性研究。
權利要求
一種檢測多樣本多位點SNP的檢測方法，其特徵是設計寡核苷酸DNA晶片；在單管中用不同Padlock探針捕獲同一樣本的不同SNP位點，有對應存在的Padlock探針發生環化，否則不環化；然後用特異擴增引物與進行雜交並進行滾環擴增，環化的Padlock探針進行擴增，未環化的則無法擴增；最後將不同樣本的不同SNP擴增產物按照一定的順序固定在同一晶片上，製備出待測多樣本多位點SNP微陣列；最後用通用螢光探針進行檢測，根據微陣列點螢光的顏色判斷SNP的分型紅或綠代表野生型或突變型，黃代表雜合型。FSA00000318278300011.tif,FSA00000318278300012.tif
2.根據權利要求1所屬的檢測多樣本多位點SNP的檢測方法，其特徵是所述的寡核 苷酸DNA晶片由晶片和被固定到晶片上的的寡核苷酸組成。
3.根據權利要求1或2所屬的檢測多樣本多位點SNP的檢測方法，其特徵是所述的 寡核苷酸DNA的晶片是普通玻璃片或是微球；其表面修飾是聚丙烯醯胺修飾、醛基修飾或 鏈黴親和素修飾；相對應的被固定的寡核苷酸的5』端是丙烯醯胺修飾、氨基修飾或生物素 修飾。
4.根據權利要求1所屬的檢測多樣本多位點SNP的檢測方法，其特徵是所述的 Padlock探針是一段合成的寡核苷酸組成，包括三部分，探針兩端的每一端鹼基長度為 18-25bp，與待檢測序列互補，用於檢測靶序列；中間由一段鹼基長度為40-60bp序列連接， Padlock探針與待測分子雜交後，中間形成一個缺口，該缺口在連接酶的作用下連接成一個 單鏈環，以此環為模板常溫滾環擴增。
5.根據權利要求1所屬的檢測多樣本多位點SNP的檢測方法，其特徵是所述的的微 陣列點螢光信號通過和環形探針特定片段互補的螢光探針雜交得到；或通過滾環過程中熒 光標記的dNTP參入到延伸核苷酸序列上得到；或者通過滾環擴增後得到的單鏈DNA延伸成 雙鏈DNA後，再同SUBGREEN染料結合後得到。
6.根據權利要求1所屬的檢測多樣本多位點SNP的檢測方法，其特徵是所述的多樣 本多位點SNP微陣列是同一個晶片上固定了不同的待測樣本，而同一樣本有又包含了不同 的SNP位點。
全文摘要
本發明公開了一種檢測多樣本多位點SNP的檢測方法，屬於基於微陣列晶片的基因多態性(SNP)的多樣本多位點檢測技術。設計寡核苷酸DNA晶片；在單管中用不同Padlock探針捕獲同一樣本的不同SNP位點，然後用特異擴增引物與Padlock探針進行雜交並進行滾環擴增，最後將不同樣本的不同SNP擴增產物按照一定的順序固定在同一晶片上製備出待測多樣本多位點SNP微陣列；最後用通用螢光探針進行檢測，根據微陣列點螢光的顏色判斷SNP的分型有益效果是實現了不同樣本不同SNP位點的平行性檢測和對同一樣本不同SNP位點的檢測。檢測SNP位點信息的準確性與靈敏度高。由於Padlock探針識別SNP位點的特異性與準確性，從而保證了SNP位點識別的準確性。
文檔編號C12Q1/68GK101985654SQ20101051940
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者張勵才, 張成標, 潘志強, 邵翠傑 申請人:徐州醫學院