蘄蛇酶注射液及其製備工藝的製作方法
2023-09-24 12:51:45
專利名稱:蘄蛇酶注射液及其製備工藝的製作方法
技術領域:
本發明涉及一種醫療藥品及其製備工藝,特別適用於血栓患者的治療。
蘄蛇酶系福建醫學院蛇毒研究室自蘄蛇毒中分離而得的一種具有抗血栓作用的酶類,由於其抗凝血性質類似凝血酶,故通稱為凝血酶樣酶。目前在該領域,國外主要產品有Arain(ancrocl)(紅口蝮蛇毒抗栓酶)和Batronolin(Difibrase)(茅頭蝮蛇毒抗栓酶),作用和用途基本上和蘄蛇酶類似,但蛇毒資源有限,藥品價格較貴,專利文獻CN1063041A中公開了「一種蛇毒溶栓素的配方和製備工藝」,該蛇毒溶栓素是由纖溶組分,舒緩組分,抑聚組分,類凝血酶組分組成,該製備工藝是分別將兩種蛇毒的有效組分,經分離、純化、再配方製得,由於該配方中含有纖溶組分,混有出血毒或神經毒素等,毒性較大,易造成治療性出血或神經毒徵狀,另外該製備工藝需用兩種蛇毒溶液分別進行分離純化,工藝較為複雜。
本發明的目的在於提供一種純度高、組分清楚、藥源廣、能克服治療性出血和再血栓等副作用的蘄蛇酶注射液及其製備工藝。
本發明提出的蘄蛇酶注射液是由三種分子量分別為14、31及66KD的同功酶溶液用0.9%的Nacl稀釋組成,其中三種同功酶含量比例為4∶5∶1,等電點(PI)在4.0-5.0,本發明蘄蛇酶注射液在體內作用機理為
蘄蛇酶屬凝血酶樣酶(Thrombin-likeenzgmes,TLES),作用於人體的Aα鍵的16精-17甘鍵,並裂解出A肽,形成(Aα、Bβ、γ)n型纖維蛋白,此種纖維蛋白易受纖溶酶(Plasmin)作用,迅速分解,產生纖維蛋白肽,由腎臟清除出體外,導致血漿纖維蛋白原含量明顯降低,血漿凝血酶作用時間延長,纖維蛋白降解產物增多,凝血酶樣酶還能阻止凝血酶誘導血小板聚集,對ADP-Na,膠元及腎上腺素等血小板誘導劑亦同樣有抑制效應。本發明製備工藝如下步驟(a)、將蛇毒溶液低溫離心去沉渣後上柱;
(b)、用葡聚糖凝膠G-75(sephadexG-75),0.01mol/LTris-Hcl緩衝液(PH8.6)洗脫出A、B、C三個蛋白峰、棄去無活性的C峰及沉澱部分,得A、B峰,再上DEAE-scphadexA-50層柱分離,0.01mol/lTris-Hcl為洗脫液,加0.0~0.3mol/LNacl直線梯度洗脫;
(c)、分別收集層柱第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ層;
(d)、將上述三種蛋白峰分別用sephadexG-75純化,並用0.01mol/LTris-HCL緩衝液洗脫兩次,棄去無活性的峰,得到三種同功酶溶液;
(e)、將三種同功酶溶液按比例混合即得到蘄蛇酶溶液;
(f)、用0.9%Nacl稀釋,濾過除菌,待無菌無熱源後罐封安瓶。
本發明製備的蘄蛇酶注射液,按衛生部規定的方法測定,8分鐘內不出現纖維蛋白凝塊,注射液中精氨酸酯酶活力達1000μmolTAME/mg·min以上,含蘄蛇酶蛋白質為標示量的100±15%,在藥理方面,本發明所製備注射液具有抗凝、降低血漿纖維蛋白原含量,並經對抗血小板聚時,對抗動、靜脈血栓形成毒理學方面進行急性毒性及長期毒性和特殊毒性測定,均符合新藥審批的各項要求,本發明提出製備工藝,步驟明確,順序穩定,所用緩衝液恆定,且其離子強度及PH均恆定,使得分離產物恆定提取物品質純,適用於大規模生產。
附
圖1為本發明製備工藝流程圖現結合實例對本發明作進一步地說明取尖吻蝮蛇毒10.0g,用0.01mol/LTris-Hcl緩衝液(PH8.6)50ml溶解,5000轉/分低溫離心15分鐘,去沉澱上清液留待上柱;分離載體為DEAE-Sephadex-50)經鹼-酸-鹼處理後,裝柱(5×100cm),用0.01mol/LTris-Hcl緩衝液(PH8.6)平衡24小時後,取上述蛇毒溶液上柱,並用同一緩衝液洗脫,用自動部分收集器收集洗脫液,洗脫液用紫外分光光度計,檢測吸收度;待洗脫出A、B、C三個蛋白峰,棄去無活性的C峰及沉澱,得A、B峰,再上(DEAE-Sephadex-50)層柱分離,0.01mol/LTris-Hcl緩衝液(PH8.6)為洗脫液,加0.3mol/LNacl直線梯度洗脫,分別收集層柱第Ⅴ、第Ⅵ、第Ⅵ蛋白峰,低溫濃縮,分別用sephadexG-75純化,並用0.01mol/LTris-HCL緩衝液洗脫兩次,棄去無活性的峰,得到三種分子量為14、31及66KD同功酶的純溶液,取三種同功酶含量比4∶5∶1或4∶2∶2、3∶5∶2,等電點(PI)在4.0-5.0,混合各組分,得到蘄蛇酶母液,將蘄蛇酶母液經6號垂熔漏鬥過濾後,作蛋白質含量測定(用藥典規定Lowry氏法),再作凝血酶活力及精氨酸酯酶活力測定,熱原及過敏反應試驗,全部合格後,用無菌、無熱源的0.9%Nacl稀釋成150ug/ml溶液,再經6號垂熔漏鬥過濾後,灌封安瓶,每支1ml∶1u(150ug)即得。用上述工藝製備的蘄蛇酶母液,也可用無菌、無熱原的0.9%Nacl稀釋成75ug/ml溶液。該注射液使用方法為每日一支,用0.9生理鹽水稀釋成100ml,靜脈滴注,5-7天為一療程,重症者一療程後,停藥5天,再用第2療程。注意事項用藥前須做過敏試驗,用藥期間如發生過敏,可與蘄蛇酶注射液同時靜脈內注入地塞米松。該注射液生產及貯藏溫度在4-15℃。
權利要求
1.一種蘄蛇酶注射液,其特徵是它由三種分子量分別為14、31及66KD的同功酶組成,蘄蛇酶射液,其含量比例為4∶5∶1,等電點在4.0-5.0,並由0.9%Nacl稀釋成不同規格的注射液。
2.一種蘄蛇酶注射液製備工藝,其特徵是按下述步驟實現的(a)、將蛇毒溶液低溫離心去沉渣後上柱;(b)、用葡聚糖凝膠G-75(sephadexG-75),0.01mol/LTris-Hcl緩衝液(PH8.6)洗脫出A、B、C三個蛋白峰、棄去無活性的C峰及沉澱部分,得A、B峰,再上DEAE-scphadexA-50層柱分離,0.01mol/lTris-Hcl為洗脫液,加0.3mol/LNacl直線梯度洗脫;(c)、分別收集層柱第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ層;(d)、將上述三種蛋白峰分別用sephadexG-75純化,並用0.01mol/LTris-HCL緩衝液洗脫兩次,棄去無活性的峰,得到三種同功酶溶液;(e)、將三種同功酶溶液按比例混合即得到蘄蛇酶溶液;(f)、用0.9%Nacl稀釋,濾過除菌,待無菌無熱源後罐封安瓶。
3.根據權利要求1所述的蘄蛇酶注射液,其特徵是將蘄蛇酶溶液用0.9%Nacl稀釋成150ug/ml。
4.根據權利要求1所述蘄蛇酶注射液,其特徵是將蘄蛇酶溶液用0.9%Nacl稀釋成75ug/ml注射液。
全文摘要
本發明涉及一種蘄蛇酶注射液及其製備工藝,該注射液是由分子量分別為14、31、66KD,等電點在4.0—5.0的三種的三種同功酶,用0.9%NaCl溶液稀釋而成;其製備工藝主要步驟是對蛇毒溶液進行層柱分離,分離出A、B、C蛋白峰後,棄去無活性部分,繼續純化分離,取其層柱第V、VI、VII層蛋白峰,製得蘄蛇酶溶液,最後用0.9%NaCl稀釋成不同規格的注射液,本發明製備的蘄蛇酶注射液純度高,組分清楚。
文檔編號A61K38/46GK1106699SQ9410100
公開日1995年8月16日 申請日期1994年2月8日 優先權日1994年2月8日
發明者王晴川, 劉廣芬 申請人:福建省三明製藥廠, 福建醫學院