一種胰蛋白酶及其製備方法與應用與流程

2023-06-11 10:00:06 1

本發明涉及生物
技術領域：
，具體的說是涉及一種胰蛋白酶及其製備方法與應用。
背景技術：
：胰蛋白酶是肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷。它不僅起消化酶的作用，消化溶解變性蛋白質，對未變性的蛋白質無作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。胰蛋白酶是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的胺基酸排列中，它成為不可缺少的工具。胰蛋白酶能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易於引流排除，加速創面淨化，促進肉芽組織新生，此外還有抗炎症作用，作為一種生產生活上重要的工具酶，在醫藥科研領域應用非常廣泛。傳統胰蛋白酶的獲取，在工業上以從胰液中提取為主，工藝複雜，耗費成本，而且不同批次產品間的質量不均一，且殘留致病原的風險較難避免，遇高溫容易變性。因此，工業上急需開發一種高效且質量穩定的胰酶生產方法。此外，在未知蛋白肽段質譜分析中，樣品在胰酶酶切處理前，化學變性劑的解摺疊處理通常導致樣品的後續檢測複雜化，不利於樣品的快速分析。而高溫下進行變性未知蛋白胰酶酶切處理則可避免化學變性劑的使用。通過基因工程表達胰蛋白酶，可以規避質量不均一等問題，但是野生型酶還存在一系列的問題，例如活性不高，穩定性不高，所以還需要進一步解決此類問題。因此有必要針對胰酶熱穩定性進行理性設計探索，以期提高其熱穩定性和活性。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於針對現有技術中存在的問題，提供一種胰蛋白酶及製備方法與應用。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：一種胰蛋白酶，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發明還提供了編碼所述胰蛋白酶的DNA分子。由於密碼子的簡併性，可以存在很多種能夠編碼本發明所述的特定多肽的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發明提供了可以編碼SEQIDNO.1所示胺基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。同時本發明提供了包括所述DNA分子的載體。其中，作為優選，所述載體為pPIC9K質粒。本發明還提供了包括所述載體的宿主菌。作為優選，所述宿主菌為畢赤酵母菌。本發明提供了所述胰蛋白酶的製備方法，包括以下步驟：A)構建胰蛋白酶重組表達載體；B)構建胰蛋白酶工程菌。在一個實施方案中，所述步驟A)具體包括：A1)構建含有野生型Susscrofa豬胰蛋白酶基因的重組載體；A2)利用重疊延伸PCR技術設計引物，以含有野生型Susscrofa豬胰蛋白酶基因的重組載體為模板，進行PCR擴增獲得包括編碼SEQIDNO.1所示胺基酸序列的DNA分子的表達載體。進一步的，A1)構建含有野生型Susscrofa豬胰蛋白酶基因的重組載體具體包括以下步驟：(1)以含有Susscrofa豬胰蛋白酶基因的質粒pPIC9K-rpTry的核苷酸序列，結合質粒pPIC9K的多克隆位點與Susscrofa豬源胰蛋白酶基因的限制性內切酶位點設計引物；(2)以含有Susscrofa豬源胰蛋白酶基因的質粒pPIC9K載體為模板，進行PCR擴增；含有Susscrofa豬源胰蛋白酶基因的PCR擴增產物純化後，用限制性內切酶EcoRI和NotI進行雙酶切，酶切產物與用同樣酶切的載體pPIC9K用T4連接酶進行連接；連接產物轉化進入大腸桿菌TOP10；(3)在固體培養基上隨機挑取幾個單菌落接種至含卡那黴素的LB液體培養基中，37℃震蕩培養12h，提取質粒；利用EcoRI和NotI進行雙酶切驗證；驗證成功的克隆子進行測序驗證。進一步的，作為優選，所述步驟A2)中引物序列如SEQIDNO.3-6所示。本發明所述製備方法中所述步驟A2)擴增產物為胰蛋白酶重組表達載體pPIC9K-rpTry-R1Q，該胰蛋白酶重組表達載體內含有SEQIDNO.2所示DNA分子。進一步的，作為優選，所述的製備方法步驟B)具體包括：B1)胰蛋白酶重組表達載體轉化宿主菌；B2)誘導含胰蛋白酶重組表達載體的宿主菌表達蛋白。作為優選，本發明所述製備方法中所述宿主菌為畢赤酵母菌。在一些實施方案中，本發明將胰蛋白酶重組表達載體pPIC9K-rpTry-R1Q經SalI酶切線性化轉入GS115畢赤酵母，構建高效表達胰蛋白酶的組成型畢赤酵母菌株。胰蛋白酶重組表達載體的畢赤酵母菌株經BMGY誘導表達培養基和BMMY誘導表達培養基進行誘導後表達胰蛋白酶。由上述技術方案可知，本發明提供了一種胰蛋白酶及其製備方法與應用。本發明所述胰蛋白酶其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發明所述胰蛋白酶穩定性、活性高，且耐高溫。本發明所述製備方法工藝簡單，成本降低，獲得胰蛋白酶純度高，顯著提高了豬源胰蛋白酶的應用價值。為進一步利用產蛋白酶的研究、開發、生產工作奠定了基礎。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示重組載體pPIC9K-rpTry構建示意圖；圖2示突變載體測序結果；圖3示酶切特異性初步驗證結果，其中泳道1為:Marker；泳道2為:RNaseA；泳道3為:WT+RNaseA；泳道4為:R1Q+RNaseA；圖4示野生型Susscrofa豬胰蛋白酶及本發明所述胰蛋白酶失活曲線比較；圖5示野生型Susscrofa豬胰蛋白酶及本發明所述胰蛋白酶失活半衰期測定；圖6示本發明所述胰蛋白酶最適反應溫度測定。具體實施方式下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。如無特殊說明，本發明實施例中所涉及的試劑均為市售產品，均可以通過商業渠道購買獲得。如大腸桿菌TOP10購自康為世紀有限公司；卡那黴素(購自鼎國昌盛有限公司)另外各培養基的組成如下：1)、誘導表達培養基BMGY：1L：酵母粉10g，蛋白腖20g，溶於700ml去離子水，121℃溼熱滅菌20min，冷卻後加入100ml1M，pH6.0，磷酸鉀緩衝液，100ml10×YNB，2ml500×B，100ml10×GY，4℃保存，存2個月。2)、誘導表達培養基BMMY：1L：酵母粉10g，蛋白腖20g，溶於700ml去離子水，121℃溼熱滅菌30min，冷卻後加入100ml1MpH3.0，磷酸鉀緩衝液，100ml10×YNB，2ml500×B，100ml10×M，4℃保存，存2個月。3)、種子培養基：YPD完全培養基：100ml體系：酵母粉lg，蛋白腖2g，溶於90ml去離子水，121℃溼熱滅菌20min，冷卻後加入10ml10×D，4℃保存(固體培養基含2.0％瓊脂，一同溼熱滅菌)。4)、選擇培養基MD：100ml體系：向80ml水中加瓊脂糖2g(終濃度20g/L)121℃溼熱滅菌20分鐘，待溫度降至60℃以後在超淨臺上加入10×YNB10ml(終濃度1.34g/L)，500×生物素0.2ml(終濃度4×10-4g/L)，10×D(20％葡萄糖)10ml(終濃度20g/L)，倒至玻璃培養皿，凝固後4℃保存。畢赤酵母轉化常採用的是電轉方法，具體方法如下：1)酵母感受態細胞的製備。接種50μl保存酵母GS115菌液於5mlYPD培養基，30℃，300rpm，搖21h，至OD600至1.0；取100μl活化菌液，分別接種於2瓶盛有100mlYPD液體培養基的500ml三角瓶，30℃，過夜至OD600＝1.0～1.3(16h左右)(測量OD時，需用無菌YPD稀釋菌液值OD值在0.2～0.8之間，再乘相應稀釋倍數，一般按菌液：無菌YPD＝1:5稀釋)；4℃，1500g/5000rpm，離心5min，棄上清；100ml冰預冷無菌水重懸菌體；4℃，1500g/5000rpm，離心5min，棄上清；10ml冰預冷1M山梨醇重懸菌體；4℃，1500g/5000rpm，離心5min，棄上清；50ml冰預冷無菌水重懸菌體；4℃，1500g/5000rpm，離心5min，棄上清；10ml冰預冷1M山梨醇重懸菌體；4℃，1500g/5000rpm，5min，離心，棄上清(用移液槍吸除上清)；200μl冰預冷1M山梨醇重懸菌體，無菌預冷的1.5mlEp管，按每管80μl分裝，以備轉化(加上菌體體積，預計100ml培養液得到400μl感受態，能轉化5杯)。值得注意的是感受態細胞儘量現用現做，儘量不放置於-80℃保存。2)線性化重組載體電轉化酵母GS115感受態實驗前一天，用75％酒精浸泡電轉杯3～4h，超聲震蕩處理3～4min，用去離子水衝洗乾淨，將點轉杯及杯帽放置於超淨臺上，紫外照射過夜。同時提前將MD平板做好，封口膜封板，放於4℃，保存備用，使用時事先將平板取出，放置於超淨臺上，升溫至室溫；將80μl酵母感受態細胞與5～10μg線性化質粒混合，放入冰預冷的0.2cm電轉杯中；將上述電轉杯在冰上孵育15min，迅速進行電轉。電轉條件：電壓1.5kV，電阻400Ω，電容25μF，電擊持續5.0msec；迅速加入1ml冰預冷的1M山梨醇溶液，轉移至1.5ml無菌Ep管中，30℃靜置培養1h；取上述轉化液塗MD固體培養基，每板約250μl，30℃避光培養，2～3天可見菌落。實施例1野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶原表達載體的構建所構建野生型重組豬源胰酶原表達載體pPIC9K-rpTry載體由北京金唯智有限公司全基因合成，如圖1所示。其中去除了原基因N端前25個胺基酸酶原激活肽段中的前20個胺基酸，N端激活肽剩餘序列為腸激酶識別位點(DDDDK)。縮短後的Susscrofa豬源胰酶原序列經EcoRI和NotI雙酶切並插入pPIC9K相應的單克隆位點。實施例2重疊延伸PCR技術獲得胰蛋白酶重組表達載體按照重疊延伸PCR原則進行引物設計，詳見表1。PCR反應聚合酶為Thermo公司的PhusionHigh-fidelityDNApolymerase.PCR體系建立如表1。表1刪除突變所用引物表2重疊延伸PCR反應體系5×HFBuffer10μl10mMdNTPs4μl上遊引物(10μM)2.5μl下遊引物(10μM)2.5μl質粒模板1μlddH2O29.5μlPhusionDNA聚合酶0.5μl總計50μl反應程序設定如下：98℃預變性30s，98℃變性15s，退火20s，72℃延伸5min，從變性到延伸共15個循環，循環後再72℃延伸10min，最終4℃保存。其中退火溫度參考引物合成Tm。胰蛋白酶重組表達載體經DMT酶(購自NEB公司)消化，去除非重組pPIC9K-rpTry載體。消化後的載體轉化大腸桿菌TOP10菌株(購自康為世紀(北京)生物科技有限公司)中，塗布於含有50μg/ml卡那黴素的LB固體培養基，37℃過夜培養。挑取LB上的單克隆菌株利用TianGen質粒小提試劑盒(購自天根(北京)生物有限公司)提取胰蛋白酶重組表達載體，並利用通用引物測序，測序結果如圖2所示，表明轉化成功。實施例3含胰蛋白酶重組表達載體的酵母菌株的獲得將上述測序正確載體pPIC9K-rpTry-R1Q經SalI酶線性化，然後轉化入酵母GS115感受態細胞，並塗布於MD固體培養基中，30℃培養2～3天。待菌落長出後，將MD固體培養基上菌株用無菌水收集於無菌EP管中。並塗布於含有1.0mg/mlG418的YPD-G418抗性培養基上，30℃培養3～4天。待菌落長出後，挑取單菌落於5mlYPD種子培養基中，30℃過夜培養至OD600＝1.0，提取酵母菌基因組，進行表型鑑定。實施例4含胰蛋白酶重組表達載體的酵母菌株的表達將上述酵母工程菌接種至250mL三角瓶，裝液量50mL的BMGY培養基，培養溫度為30℃，搖床轉速250r/min，培養至OD600＝2-6(對數生長期，16-18h)；室溫1500-3000g離心5min，收集菌體，用BMMY培養基中培養液重懸菌體，接種至100mlBMMY培養基，OD值為1.0。發酵溫度30℃，搖床轉速250r/min，進行誘導表達，每隔24小時，添加1.0％(v/v)甲醇，發酵時間為72h。實施例5胰蛋白酶的活性檢測胰蛋白酶作為一種蛋白質水解酶，除了能水解鹼性胺基酸和其它胺基酸所形成的肽鍵之外，還能夠水解鹼性胺基酸形成的酯鍵，催化活性具有高度專一性。因此，可以利用人工合成的N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-argineethylester，簡稱BAEE)為底物測定胰酶的活性。N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯(BAEE)能在鹼性條件下，在胰蛋白酶水解作用下，去除一個乙基而生成N-苯甲醯-L-精氨酸(BA)，催化反應，對胰蛋白酶的酶活進行測定。具體方法為：將誘導發酵液，8000rpm、離心10min，將上清保留。利用陰離子交換的方法對上清中目標蛋白進行純化。用平衡緩衝液(20mMTris-HCl，pH3.0)平衡SPSepharoseTMHighperformance柱後，將過夜透析後的培養液上樣，用平衡緩衝液和洗滌緩衝液(20mMTris-HCl，0.5MNaCl，pH3.0)進行梯度洗脫，並收集蛋白峰。將收集後的蛋白液，進行緩衝液(配製BAEE底物溶液所用緩衝液)更換，利用BCA蛋白質濃度測定試劑盒(購自北京鼎國生物技術有限公司)對更換緩衝液後的樣品進行蛋白質濃度測定，以BSA作標準曲線。蛋白質定量後配置50ug/ml蛋白液。根據測定結果，將蛋白質濃度統一至200μg/ml。然後，對胰蛋白酶原利用腸激酶進行激活，激活體系為100μl樣品加2μl腸激酶(腸激酶購自上海生工有限責任公司)，25℃孵育，每10min測定一次樣品活性。酶活測定方法為：首先，BAEE底物溶液需要在25℃條件下提前水浴處理。3.0mlBAEE底物溶液與100μl1mMHCl水溶液預混於石英比色皿中。將腸激酶處理過的胰蛋白酶溶液加到盛有上述預混液的比色皿(比色皿光程為1cm)，迅速放至紫外分光光度計檢測槽中，開始測定反應液在253nm處的吸光值，計算胰蛋白酶酶活。計算公式如下BAEEunits(U/ml)＝(△OD253/min×df)/(0.001×0.1)其中，df為稀釋因子，本測定體系df為32。實施例6胰蛋白酶的酶切特異性檢測對野生型及本發明所述胰蛋白酶樣品的酶切特異性進行檢測，所用的底物蛋白為RNaseA蛋白(RNaseA購自北京全式金生物技術有限公司)，分子量大小為13.7kDa。酶切反應體系按胰蛋白酶：RNaseA質量比為1:500進行，37℃，反應時間為3h。反應結束後對反應液進行SDS-PAGE分析，結果如圖3所示。其中第2泳道為RNaseA(不添加任何豬源胰蛋白酶)，作為空白對照，第3泳道為RnaseA與野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶作用後的，作為另一組對照。而第4泳道為實驗組，即RNaseA與本發明所述胰蛋白酶作用後的反應物。從圖3可以看出兩種酶都能對RNaseA進行反應，即黑色區域變淡，表明與野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶相比，本發明所述胰蛋白酶的酶切特異性未發生改變。實施例7胰蛋白酶的熱穩定性測定蛋白質熱穩定性與其活性有關，主要指其在經歷不可逆失活之前保持其活性的時間。通過考察野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶及本發明所述胰蛋白酶的失活半衰期t1/2及最適反應溫度Topt，對熱穩定性的檢測。失活半衰期t1/2的測定方法為利用腸激酶激活胰蛋白酶樣品，然後在50℃條件下孵育，按照孵育時間0min、30min、60min、120min、180min的時間點取出一定樣品，冰浴30s，測定一次酶活。以孵育前的酶活為100％，根據實際酶活計算不同孵育時間點酶殘留活性百分比。以酶殘留活性自然對數為縱坐標，孵育時間t為橫坐標，進行線性擬合。其斜率即為失活速率常數kd，利用如下公式計算其半衰期。半衰期計算公式：野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶及本發明所述胰蛋白酶在腸激酶激活後，迅速轉移至50℃條件下孵育，每5min測定樣品的酶活性，得到失活曲線，如圖4所示。從圖4中可以看出野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶失活速度較R1Q失活速度快，50℃放置180min後，野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶保持了42.86％的殘留活性，而本發明所述胰蛋白酶保持了73.08％的殘留活性。利用上述失活曲線測定的活性相對值，以Ln(相對活性)為縱坐標，以時間為橫坐標，利用Origin9.0進行線性擬合，如圖5所示。按照半衰期計算公式計算野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶及本發明所述胰蛋白酶在50℃條件下的半衰期。結果野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶的半衰期t1/2為155.35min，本發明所述胰蛋白酶的半衰期t1/2為368.69min。突變型N84S相比於野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶則提高了213.34min。最適反應溫度的測定方法為將BAEE酶活測定底物溶液分別放置於25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃、75℃、80℃及85℃條件下孵育。胰蛋白酶原樣品按照最佳腸激酶激活時間進行激活，然後分別利用上述預孵育的底物溶液進行酶活測定，酶活性最大的溫度即為最適反應溫度Topt。實驗對野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶及本發明所述胰蛋白酶R1Q最適反應溫度測定，結果如圖6所示，以胰蛋白酶的相對活性為縱坐標，以反應體系溫度為橫坐標，結果顯示，隨著反應溫度的增加，其酶活正相關的增加。當反應體系溫度達到65℃後，野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶及本發明所述胰蛋白酶均存在一定的酶反應活性。當溫度提升到75℃後野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶表現出一定的抗熱能力，且活性達到最高，而本發明所述胰蛋白酶R1Q活性則在85℃時活性達到最高。在兩者達到最高活性時，本發明所述胰蛋白酶R1Q的活性較野生型Susscrofa豬源胰蛋白酶提高了1.42倍。SEQUENCELISTING天津大學一種胰蛋白酶及其製備方法與應用MP16185216PatentInversion3.31227PRT人工序列1AspAspAspAspLysIleValGlyGlyTyrThrCysAlaAlaAsnSer151015IleProTyrGlnValSerLeuAsnSerGlySerHisPheCysGlyGly202530SerLeuIleAsnSerGlnTrpValValSerAlaAlaHisCysTyrLys354045SerArgGlnValArgLeuGlyGluHisAsnIleAspValLeuGluGly505560AsnGluGlnPheIleAsnAlaAlaLysIleIleThrHisProAsnPhe65707580AsnGlyAsnThrLeuAspAsnAspIleMetLeuIleLysLeuSerSer859095ProAlaThrLeuAsnSerArgValAlaThrValSerLeuProArgSer100105110CysAlaAlaAlaGlyThrGluCysLeuIleSerGlyTrpGlyAsnThr115120125LysSerSerGlySerSerTyrProSerLeuLeuGlnCysLeuLysAla130135140ProValLeuSerAspSerSerCysLysSerSerTyrProGlyGlnIle145150155160ThrGlyAsnMetIleCysValGlyPheLeuGluGlyGlyLysAspSer165170175CysGlnGlyAspSerGlyGlyProValValCysAsnGlyGlnLeuGln180185190GlyIleValSerTrpGlyTyrGlyCysAlaGlnLysAsnLysProGly195200205ValTyrThrLysValCysAsnTyrValAsnTrpIleGlnGlnThrIle210215220AlaAlaAsn2252684DNA人工序列2gatgatgatgataaaattgttggtggttatacttgtgctgctaattctattccatatcaa60gtttctttaaattctggttctcatttttgtggtggttctttgattaattctcaatgggtt120gtttctgctgctcattgttacaaatcaagacaagttagattgggtgaacataatattgat180gttttggaaggtaatgaacaatttattaatgctgctaaaattattactcatccaaatttt240aatggtaatactttggataatgatattatgttgattaaattgtcttctccagctacttta300aattcaagagttgctactgtttctttgccaagatcttgtgctgctgctggtactgaatgt360ttgatttctggttggggtaatactaaatcttctggttcttcttatccatctttgttgcaa420tgtttgaaagctccagttttgtctgattcttcttgtaaatcttcttacccaggtcaaatt480actggtaatatgatttgtgttggttttttggaaggtggtaaagattcttgtcaaggtgat540tctggtggtccagttgtttgtaatggtcaattgcaaggtattgtttcttggggttatggt600tgtgctcaaaaaaataaaccaggtgtttacactaaagtttgtaattatgttaattggatt660caacaaactattgctgctaattag684318DNA人工序列3tggttccaattgacaagc18443DNA人工序列4aatttaatcaacataatatcagtattaccattaaaatttggat43525DNA人工序列5gatattatgttgattaaattgtctt25621DNA人工序列6cattctgacatcctcttgatt21當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp