抑制大腦eIF6基因表達的核酸抑制分子、其篩選方法和用途
2023-07-28 13:12:46 4
抑制大腦eIF6基因表達的核酸抑制分子、其篩選方法和用途
【專利摘要】本發明基於eIF6對記憶力的負調控和增強穀氨酸受體表達的作用，提供了一種在體外培養細胞中篩選有效抑制大腦eIF6基因表達的核酸抑制分子的方法，通過該方法篩選的核酸抑制分子，以及所述核酸抑制分子預防和/或治療運動性疲勞和/或記憶力減退及其相關疾病的用途。
【專利說明】抑制大腦elF6基因表達的核酸抑制分子、其篩選方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明提供了一種篩選有效抑制大腦eIF6基因表達的核酸抑制分子的方法，通過該方法篩選的核酸抑制分子，以及所述核酸抑制分子預防和/或治療運動性疲勞和/或記憶力減退及其相關疾病的用途。
【背景技術】
[0002]一、運動性疲勞
[0003]運動性疲勞主要是指由運動引起身體能力下降的現象。1982年第五屆國際運動生化會議將疲勞的定義統一，運動性疲勞是「機體生理過程不能持續其機能在一定水平或和各器官不能維持預定的運動強度」。
[0004]目前，按疲勞發生的部位，習慣上把運動性疲勞分為中樞疲勞和外周疲勞兩部分。其中中樞疲勞產生的機制包括:
[0005]I) 5-羥色胺(5-HT):5-HT是中樞神經系統的一種抑制性遞質，研究也證實，動物進行長時間運動過程中大腦5-HT含量明顯增加[1，2]。
[0006]2)多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE):研究結果顯示，在運動過程中中腦、海馬、紋狀體和下丘腦的DA代謝增強[3]。Bailey等發現大鼠的疲勞與腦幹和中腦中多巴胺的合成和代謝的減少有關，當腦DA合成和代謝得以維持時，疲勞就會延遲。
[0007]3)乙醯膽鹼(Ach) :近年來，有推測認為耐力運動中疲勞可能是由於運動中膽鹼利用的衰竭、排空降低了膽鹼能系統的活動而引發的[4]。實驗發現，運動員馬拉松跑後，血漿膽鹼水平下降約40%，與進食無膽鹼的食物有同樣效果[4]，暗示當中樞Ach濃度下降時，中樞疲勞就會發生。
[0008]4)穀氨酸，r-氨基丁酸(GABA) =GABA是中樞神經系統中主要的抑制性胺基酸，穀氨酸(Glu)是主要的興奮性胺基酸。Coiix)研究發現GABA可抑制腺垂體對運動的反應，減弱機體對運動的應激，降低機體的運動能力[5]。在正常生理情況下，腦內興奮性胺基酸與抑制性胺基酸保持平衡。當腦內穀氨酸含量升高時，表示大腦皮層興奮過程佔優勢；當腦內Y-氨基丁酸含量升高時，表示大腦皮層抑制過程佔優勢，此時易出現疲勞。
[0009]5)氨濃度:運動時，肌肉可產生氨並釋放到血液。氨可通過血腦屏障，具有毒害作用。腦氨增多可引起多種酶活性及ATP再合成速率下降。氨還可改變腦膜對胺基酸的通透性，影響各種神經遞質的代謝，因此氨可能是中樞疲勞的重要原因之一。
[0010]二、學習記憶
[0011]學習記憶是大腦最基本、最重要的高級神經功能之一，是衡量人類智能發育的重要指標。多年來人們對學習與記憶在腦內的定位問題進行了大量的研究，目前認為邊緣系統中的海馬是學習、記憶等高級神經活動的重要部位，海馬與學習記憶有著密切的聯繫[6，7]。
[0012]研究發現給予海馬短暫重複的刺激，會引起突觸傳遞增強，在無損傷的動物體實驗中，增強效應將維持數小時，甚至數周，這種突觸傳遞的增強被稱作突觸傳遞長時程增強(Long-term potentiation, LTP)。海馬內三條主要的興奮性突觸都能產生長時程增強(LTP) ο Richard Morris 於 1986 年首次證明長時程增強(Long-term potentiation, LTP)是體內記憶形成所必需的[8]。Susumu Tonegawa於1996年證明海馬CAl區是活體老鼠空間記憶形成的關鍵[9]，海馬NMDA受體活性的增強能產生增強的LTP和空間學習的整體提高。2001年，Joe Tsien培育了海馬中高表達NR2B亞基而具有NMDA受體功能增強品系的Doogie小鼠[10] ,Doogie小鼠不僅長時程增強(Long-term potentiation,LTP)較強而且在空間學習任務中也表現出色，進一步加強了 LTP對海馬依賴性記憶形成中的重要性。目前認為，LTP產生的分子機制為興奮性神經遞質穀氨酸(Glul)和其受體KA/AMPA結合，激活了 N2甲基2D2天門冬氨酸(NMDA)受體的離子通道進而產生的[11]。
[0013] 三、eIF6的基本特徵
[0014]eIF6 基因(SEQ ID NO 2，NCBI genebank 登記號為 NM-002212)在真核生物中高度保守[12，13]，人和小鼠eIF6胺基酸序列有98%序列同源性。在人類基因組中，eIF6定位於20號染色體的長臂20qll.2區，5』端缺少TATA啟動子結合區，CpG島，mRNA全長1108bp，含有7個外顯子和6個內含子，開放讀框含有735個核苷酸，245個胺基酸，分子量大小為27KD[14]。eIF6蛋白分布廣泛，研究證實，在上皮細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、激活的T細胞、活化的肥大細胞及肌肉組織纖維中均有eIF6蛋白的表達，也有研究證實只要表達α6β4整合素的細胞均表達eIF6[15]。細胞水平，eIF6蛋白表達在胞漿(中間絲附近)和胞核(主要位於核仁外周)[16]。
[0015]eIF6的生物學功能包括:
[0016]I)參與調控蛋白合成:在真核生物翻譯起始階段，eIF6促進40s亞基和60s亞基結合形成80s亞基，從而啟動蛋白質的翻譯[17-20]。敲除eIF6基因後核糖體60s亞基丟失，證明其對核糖體60s的形成具有重要的作用[16]。並且對胞外信號的反應中eIF6是作為最早的真核細胞翻譯起始因子參與調節蛋白的翻譯[21]。另一方面，eIF6與RISC (RNA誘導沉默複合體)結合，特異性地促進相應microRNA的作用，從轉錄水平上幹擾mRNA形成，抑制其對應靶蛋白的表達，反之敲除eIF6後則會解除miciORNA對靶蛋白的表達抑制作用而促進革巴蛋白的表達[22,23]。
[0017]2)參與調節細胞黏附及細胞骨架的形成:eIF6為β 4整合素結合蛋白，與中間絲和α6β 4整合素的胞內結構域的功能區結合，介導細胞的黏附功能[24]。此外，eIF6還存在於核基質中，參與細胞骨架的形成。有實驗已證明eIF6在中間絲和核基質上高表達
[15]，並且eIF6還可以調節Wnt信號通路中的β -聯蛋白的表達，從而影響細胞骨架[25]。
[0018]3)與腫瘤發生和轉移的關係:有實驗證實eIF6作為翻譯調節因子參與了細胞的增殖。在對分化誘導前後的肝癌細胞核基質成分進行亞細胞蛋白組學分析發現，eIF6在分化後的細胞中高表達，提示可能參與癌細胞分化[26]。eIF6在正常黏膜細胞可以檢測到，但是在癌細胞中過表達，如在結直腸癌中eIF6的表達上調[27]，並且在淋巴結轉移灶中尤為明顯[28]，故而提示eIF6的高表達可能參與了腫瘤的增殖和轉移。
[0019]從上面可以看出，eIF6在核糖體合成、細胞骨架以及腫瘤的增殖分化和轉移中具有重要的作用，但是目前對於eIF6蛋白的相關文獻較少，尤其是對於其與學習記憶功能的關係和在對抗記憶力減退或記憶障礙方面的作用還未見報導。
【發明內容】
[0020]本發明人通過大量的實驗，出人意料地發現:eIF6敲基因小鼠有較強平衡能力和抗疲勞傾向，同時eIF6對中樞的記憶力具有負調控作用，可以增強大腦皮層及海馬突觸後神經元中穀氨酸受體的表達。基於該發現，本發明的目的提供一種在體外培養細胞中篩選有效抑制大腦eIF6基因表達的核酸抑制分子的方法(在本文中有時簡稱「本發明的方法」)，並且通過該方法篩選出可以有效抑制大腦eIF6基因表達的核酸抑制分子(在本文中有時也稱為「eIF6抑制核酸分子」)，包括長期抑制分子和瞬時抑制分子。
[0021]在本發明中，eIF6抑制核酸分子是指以eIF6核酸分子，優選地以SEQID NO:2或3為靶序列的有效抑制eIF6基因表達的核酸分子(包括，但不限於，例如，反義核酸分子、小RNA(miRNA)、微小非編碼RNA(tncRNA)、小調節RNA(smRNA)、短幹擾RNA(siRNA)等。通過本發明的方法篩選的核酸抑制分子還可以進一步被包裝成病毒RNA幹擾載體(下文也稱為「eIF6抑制性病毒RNA幹擾載體」)或進一步篩選出有效抑制eIF6基因表達的siRNA分子(下文中有時也稱為「本發明的siRNA分子」)。
[0022]在本發明中，β4整合素結合蛋白eIF6(下面簡稱為「eIF6蛋白」)涵蓋具有SEQID NO:1所示的胺基酸序列、在SEQ ID NO:1的序列的基礎上發生1_3個胺基酸殘基保守置換的同源胺基酸序列或與SEQ ID NO:1的序列具有至少80%以上的同源性且能與β 4整合素，優選α6β 4整合素特異性結合的胺基酸序列的多肽。因此，在本發明中當提及eIF6蛋白時，並不僅僅特指具有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的野生型eIF6蛋白本身，而是涵蓋上述eIF6蛋白的各種衍生物或同源物。「eIF6核酸分子」或「eIF6基因序列」涵蓋SEQID N0:2所示的eIF6基因核酸序列，與SEQ ID NO:2的序列具有至少80%以上同源性的核酸序列的核酸分子，所述eIF6核酸分子在哺乳動物細胞中的表達可產生eIF6基因表達產物。
[0023]在本發明中，當提及`「eIF6基因」時，其不限於鼠eIF6基因，而是泛指各種種屬來源的eIF6基因，因為在進化中，eIF6基因在真核細胞中是非常保守的。另外，在本發明中「eIF6蛋白」、「eIF6核酸分子」或「eIF6抑制核酸分子」的來源不限於鼠，還可以來自哺乳動物，優選人。
[0024]因此，在第一個方面，本發明提供了一種篩選有效抑制大腦中eIF6基因表達的eIF6核酸抑制分子的方法，該方法包括以下步驟:
[0025]I)將以eIF6基因序列(例如，SEQ ID NO:2所示核酸序列)為靶序列的長度為20~40個，優選21~27個核苷酸的候選eIF6核酸抑制分子包裝到帶有報告基因，例如螢光素酶基因、螢光蛋白基因，優選綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白或黃色螢光蛋白基因的病毒表達載體中，形成病毒幹擾載體；
[0026]2)將步驟I)中獲得的病毒幹擾載體與體外培養的成纖維細胞(所述成纖維細胞可以是市售的人皮膚成纖維細胞系，如BJ等等；也可以是取自與eIF6基因相同或不同來源的動物的皮膚製成的原代或傳代培養細胞，如取自人皮膚瘢痕組織並培養的增生性瘢痕成纖維細胞)共孵育使得所述病毒幹擾載體感染成纖維細胞；
[0027]3)觀察被感染的成纖維細胞中的報告基因表達產物(例如，突光)表達，將所述報告基因表達產物(例如，螢光)表達達到80%以上的細胞用於下一步篩選；[0028]4)提取步驟3)中篩選的報告基因表達產物表達(例如，螢光)達到80%以上的成纖維細胞的RNA並反轉錄為cDNA，以SEQ ID NO: 11、12、13、14作為引物以反轉錄的cDNA作為模板，通過實時定量PCR技術(例如，實時螢光定量PCR)檢測eIF6mRNA的表達；
[0029]5)將與陰性對照病毒載體感染的成纖維細胞相比eIF6mRNA表達相比減少50%以上的候選eIF6核酸抑制分子作為初始篩選分子；
[0030]6)將包裝有步驟5)中確定的初始篩選分子的病毒幹擾載體感染小鼠48小時，採用Western Blot檢測小鼠腦中突觸後神經元的穀氨酸受體蛋白NMDAR的表達量，若NMDAR的表達量與野生型小鼠相比升高30%以上，則所述初始篩選分子被確定為有效抑制eIF6基因表達的eIF6核酸抑制分子。
[0031]在本發明中，候選eIF6抑制核酸分子的設計可以採用以下的思路:
[0032]I)從轉錄本(mRNA) (NM_002212.3，eIF6 mRNA剪切本I)的ATG起始密碼開始，尋找第一個「AA」二連序列，並記下其3'端的19個鹼基序列，作為潛在的eIF6抑制核酸分子靶位點。有研究結果顯示GC含量在30% -50%左右的eIF6抑制核酸分子要比那些GC含量偏高的更為有效。在設計eIF6抑制核酸分子時不要針對5'和3'端的非編碼區；
[0033]2)將潛在的序列和相應的基因組資料庫進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列；
[0034]3)選出合適的目標序列進行合成，從而得到候選eIF6抑制核酸分子。
[0035]在第二個方面，本發明進一步提供了一種篩選瞬時抑制大腦eIF6基因表達的siRNA分子的方法，該方法包 括以下步驟:
[0036]I)將上述初始篩選分子通過瞬時轉染的方式轉染體外培養的小鼠海馬神經元細胞，將轉染的海馬神經元細胞繼續培養72小時；
[0037]2)提取步驟I)中被轉染的海馬神經元細胞的蛋白，通過western blot技術檢測eIF6蛋白的表達；
[0038]3)將與陰性對照轉染的海馬神經元細胞中eIF6蛋白表達相比減少30%以上的海馬神經元細胞所對應的候選eIF6核酸抑制分子確定為瞬時抑制eIF6基因表達的siRNA分子。
[0039]在本發明的方法中，病毒表達載體可選自慢病毒載體或腺病毒載體。
[0040]在第三個方面，本發明提供了根據本發明上述方法篩選的eIF6核酸抑制分子，其長度為20~40個，優選21~27個核苷酸。
[0041]在第四個方面，本發明涉及包含eIF6核酸抑制分子的病毒幹擾載體，所述病毒選自腺病毒載體或慢病毒載體。
[0042]在本發明的一個優選實施方案中，上述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子包含SEQID NO:3-8,15-16中任一個所不的序列。
[0043]在第五個方面，本發明涉及本發明的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子在製備用於治療和/或預防運動性疲勞和/或記憶力減退的藥物中的用途。
[0044]在一個優選的實施方案中，運動性疲勞是由突觸後神經元的穀氨酸受體表達增加介導的。在另一個優選的實施方案中，記憶力減退是由於海馬功能受損相關的疾病或功能障礙引起的。
[0045]在本發明中，本發明的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子可以用於預防和/或治療選自下列的因素、疾病、疾病狀態或功能障礙:慢性疲勞症候群、衰老、抑鬱症、腦部腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默病、帕金森病、腦動脈硬化、慢性鼻竇炎、老年痴呆症、匹克氏病(Pick』 sdisease)、亨廷頓病、肝豆狀核變性、精神分裂症或癲癇、神經退行性疾病、睡眠障礙、慢性酒精中毒酒精中毒、甲狀腺功能低下和神經性梅毒。
[0046]本發明的eIF6抑制性病毒RNA幹擾載體或siRNA分子還可以與適宜的一種或多種藥用載體一起製成藥物組合物。
[0047]在第六個方面，本發明還涉及一種藥物組合物，其包含與遞送載體結合的本發明的eIF6核酸抑制分子或病毒幹擾載體,和任選的一種或多種藥用載體,其中所述遞送載體選自膽固醇、納米顆粒、聚乙烯亞胺、魚精蛋白、陽離子多肽、殼聚糖或脂質體。為了增加核酸的使用效果，還可輔以專用的穩定劑和特異性免疫增強劑。
[0048]本領域的技術人員應該 理解，本發明的eIF6抑制性病毒RNA幹擾載體或siRNA分子或包含它們的藥物組合物優選地可以通過局部定向給藥，尤其是腦室內給藥(根據需要還可以海馬局部給藥)，靜脈內注射、輸注，肌內注射，還更優選通過本領域技術人員熟知的靶向遞送方式給藥。
[0049]在本發明中，eIF6抑制性慢病毒RNA幹擾載體可以用於長期敲降eIF6基因，適合長期給藥以治療無法通過臥床休息而緩解的長期嚴重疲勞，如慢性疲勞症候群；以及與記憶力減退或記憶障礙相關的疾病或疾病狀態。
[0050]本發明的siRNA分子可用於短期施用，以暫時緩解、減輕或消除運動性中樞疲勞症狀，諸如軀體性疲勞症狀如肌肉運動能力下降(由於長時間運動訓練導致)，和心理性疲勞症狀如情緒低迷、注意力不集中、失眠、精力不濟等；以及記憶力減退或記憶障礙的症狀。換句話說，本發明的siRNA分子可用於短期對症治療。
[0051]本領域技術人員通過常規試驗能夠分別確定eIF6抑制性病毒RNA幹擾載體或siRNA分子或包含它們的藥物組合物的劑量水平(例如，I μ g~100mg/kg體重)。應該理解，關於任何具體受試者的具體劑量水平依賴於多種因素，包括受試者的年齡、體重、一般健康狀態、性別、飲食、施用時間、施用途徑和排洩率、藥物聯合和疾病的嚴重性等。此外，eIF6抑制性病毒RNA幹擾載體或siRNA分子或包含它們的藥物組合物還可以與其記憶力減退抑制劑或記憶增強劑同時、或間隔一定時間聯合給藥。
[0052]本發明的有益效果:
[0053]1.本發明通過Morris (Morris water maze,MWM)水迷宮系統檢測發現eIF6敲基因小鼠有較強學習和空間定位能力。
[0054]2.通過免疫組織化學方法顯示，eIF6蛋白在大腦皮層、海馬及其周邊組織的神經元和神經節中的過度表達與記憶力下降或記憶障礙有關，而eIF6蛋白的低表達則具有明顯增強學習記憶作用。
[0055]3.通過轉棒式疲勞儀測試，發現eIF6敲基因小鼠有較強平衡能力和抗疲勞傾向，提示敲基因小鼠有較強延緩疲勞出現能力。
[0056]4.基於本發明的發現，本發明人利用海馬神經元細胞通過逆轉錄定量PCR等技術篩選出了特異性抑制eIF6基因表達的病毒RNA幹擾載體和siRNA分子。本發明的病毒RNA幹擾載體和siRNA分子可以用於對抗疲勞和/或記憶力減退的症狀及其相關疾病或功能障礙。[0057]5.eIF6基因在真核細胞中序列高度保守。通過clustalw2序列比對顯示，發現eIF6基因在真核細胞中序列高度保守。人與小鼠eIF6胺基酸序列有98%同源性(見圖
8)，人和小鼠eIF6核苷酸序列高度保守，有91%同源性(見圖9)。因此可以預期，各種真核來源的eIF6蛋白或eIF6核酸分子均可以實現本發明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0058]從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特徵和優點將更明顯，其中:
[0059]圖1.野生型和eIF6敲基因鼠曠場測試。A:小鼠在曠場中央區域停留時間。B:小鼠在曠場中央區域走過路程。C:小鼠在曠場中30分鐘內跳躍次數。D:小鼠在曠場中走過的總路程。10-12周雄性小鼠，實驗動物野生型12隻，敲基因小鼠13隻，*p < 0.05，**p
<0.01。
[0060]圖2.野生型和eIF6敲基因鼠在轉棒式疲勞儀停留時間。A:單只小鼠在疲勞儀停留時間分布。B:野生型和敲基因小鼠在疲勞儀上平均停留時間。8-10周雄性小鼠，實驗動物野生型12隻，敲基因小鼠13隻，*p < 0.05，**p < 0.01。
[0061]圖3.野生型和eIF6敲基因鼠水迷宮測試。A:小鼠水迷宮中潛伏期。B:小鼠在目標象限停留時間百分比。C:小鼠水迷宮中遊泳總路程。D:小鼠水迷宮中平均遊泳速度。10-12周雄性小鼠，實驗動物野生型12隻，敲基因小鼠13隻，*p < 005，**p < 0.01。
[0062]圖4.野生型和eIF6敲基因在水迷宮中空間搜索策略。A:野生型小鼠在水迷宮中的空間搜索策略。B:敲基因小鼠在水迷宮中的空間搜索策略。
[0063]圖5.免疫組織化學檢測eIF6基因在小鼠大腦內表達情況。A:eIF6在小鼠海馬中表達情況。B:eIF6在大腦皮層中表達。C:海馬中eIF6表達放大圖。D:大腦皮層中eIF6表達放大圖。
[0064]圖6.免疫組織化學檢測eIF6基因在海馬表達。A:eIF6在小鼠大腦海馬中表達情況。B:eIF6在CA區中表達。C:eIF6在DG區中表達。D:海馬CA區中eIF6亞細胞定位情況。
[0065]圖7.大腦海馬區和非海馬區不同的蛋白表達。Hippo:海馬組織，non-hippo:除海馬的大腦組織，WT:野生型小鼠，ko:敲基因型小鼠。
[0066]圖8.小鼠與人eIF6胺基酸序列同源性比對。黑色表示匹配，灰色表示不匹配。Homo:人類Mus:小鼠。
[0067]圖9.小鼠與人eIF6核苷酸序列同源性比對。黑色表示匹配，灰色表示不匹配。Homo:人類Mus:小鼠。
[0068]圖10.篩選eIF6基因幹擾用的有效慢病毒幹擾載體。1#、2#和3#分別表示慢病毒-FIV-Hl/U6-copGFP-1TGB4BPRNAil#、2#、3#。
[0069]圖11.pFIV-Hl/U6_copGFP 質粒圖譜。
[0070]圖12.A.小鼠eIF6蛋白的胺基酸序列和B.小鼠eIF6基因序列。
【具體實施方式】
[0071]術語定義
[0072]記憶力減退:在本發明中，記憶力減退除與衰老相關的記憶力下降以外，還包括由心理因素和/或軀體器質性病變引起的記憶力下降。與記憶力下降有關的疾病或疾病狀態如神經退行性疾病、睡眠障礙、腦動脈硬化、慢性鼻竇炎、慢性酒精中毒、腦部腫瘤、糖尿病、酒精中毒、甲狀腺功能低下或神經性梅毒等。同時長期處於社會壓力大、抑鬱、自卑、焦慮等心理狀態時也會引起記憶障礙。記憶力下降常常令病人陷入焦慮和緊張狀態，而抑鬱也是造成病人注意力不集中的原因，表現為注意力下降。
[0073]記憶障礙(Impaired Memory):指個體處於一種不能記住或回憶信息或技能的狀態，有可能是由於病理生理性的或情境性的原因引起的永久性或暫時性的記憶障礙。在本發明中，當指個體的記憶力狀態或臨床表現時，記憶力減退和記憶障礙兩個術語可以互換使用。
[0074]疾病狀態:是指具有相關疾病的症狀或功能障礙表現，但可能具有或不具有相關器官器質性病變的狀態。
[0075]與海馬功能受損相關的疾病或功能障礙:原發或繼發引起的海馬神經元器質性病變(例如，死亡)和/或功能紊亂而導致海馬暫時或永久性功能受損的各種病因諸如創傷、器官萎縮、應激或其他有害刺激、中樞神經系統退行性或進行性疾病或症候群(例如，神經退行性疾病如阿爾茲海默病，大腦認知功能進行性退化症候群如老年痴呆症等)、生理性過程(例如，衰老、睡眠障礙等)或其他疾病(例如，糖尿病、抑鬱症等)等。
[0076]負對照:在本發明中，作為負對照的eIF6核酸抑制分子與選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。在具體實驗中將選中的eIF6核酸抑制分子打亂作為負對照，同樣要檢查結果以保證它和其他基因沒有同源性。
[0077]篩選用細胞系:在本發明中為儘可能使實驗結果接近於臨床應用，我們選擇敲降eIF6人源序列。然而人海馬神經元元代分離取材有限制。為了克服這一困難，我們在初步篩選實驗中採用相對較易取材的瘢痕成纖維細胞系(可以採用採集自臨床標本的細胞培養物，也可以採用市售的人或動物成纖維細胞系)作為實驗對象，體外檢測eIF6慢病毒敲降結果。由於eIF6高度保守，在不同組織中廣泛表達，在瘢痕組織成纖維細胞中取得的結果，特別是採用病毒幹擾載體的長期敲降，也完全適用於海馬神經元細胞中。在獲得初步篩選結果後，為保證進一步篩選更有效的瞬時敲降的siRNA分子，則採用從小鼠分離的海馬神經元細胞作為實驗對象。
[0078]以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，並不意欲限制本發明的範圍和精神。
[0079]本發明所用的實驗儀器和材料及其來源如下:
[0080]
【權利要求】
1.一種篩選有效抑制大腦eIF6基因表達的eIF6核酸抑制分子的方法，該方法包括以下步驟: 1)將以eIF6基因序列為靶序列的長度為20~40個，優選21~27個核苷酸的候選eIF6核酸抑制分子包裝到帶有報告基因的病毒表達載體中，形成病毒幹擾載體； 2)將步驟I)中獲得的病毒幹擾載體與體外培養的成纖維細胞共孵育使得所述病毒幹擾載體感染成纖維細胞； 3)觀察被感染的成纖維細胞中的報告基因表達產物表達，將所述報告基因表達產物表達達到80%以上的細胞用於下一步篩選； 4)提取步驟3)中篩選的報告基因表達產物表達達到80%以上的成纖維細胞的RNA並反轉錄為cDNA，以SEQ ID NO:11、12、13、14作為引物以反轉錄的cDNA作為模板進行實時定量PCR檢測eIF6mRNA的表達； 5)將與陰性對照病毒載體感染的成纖維細胞相比eIF6mRNA表達相比減少50%以上的候選eIF6核酸抑制分子作為初始篩選分子； 6)將包裝有步驟5)中確定的初始篩選分子的病毒幹擾載體感染小鼠48小時，採用Western Blot檢測小鼠大腦中突觸後神經元的穀氨酸受體蛋白NMDAR的表達量，若NMDAR的表達量與野生型小鼠相比升高30 %以上，則所述初始篩選分子被確定為有效抑制eIF6基因表達的eIF6核酸抑制分子。
2.一種篩選瞬時抑制大腦eIF6基因表達的SiRNA分子的方法，該方法包括以下步驟: 1)將權利要求1中篩選的初 始篩選分子通過瞬時轉染的方式轉染體外培養的小鼠海馬神經元細胞，將轉染的海馬神經元細胞繼續培養72小時； 2)提取步驟I)中被轉染的海馬神經元細胞的蛋白，通過westernblot技術檢測eIF6蛋白的表達； 3)將與陰性對照轉染的海馬神經元細胞中eIF6蛋白表達相比減少30%以上的海馬神經元細胞所對應的候選eIF6核酸抑制分子確定為瞬時抑制eIF6基因表達的siRNA分子。
3.權利要求1所述的方法，其特徵在於所述病毒表達載體為慢病毒載體或腺病毒載體。
4.一種有效抑制大腦eIF6基因表達的eIF6核酸抑制分子，其是根據權利要求1_3中任一項所述的方法篩選的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子，所述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子的長度為20~40個，優選21~28個核苷酸。
5.包含權利要求4所述的eIF6核酸抑制分子的病毒幹擾載體，所述病毒選自腺病毒載體或慢病毒載體。
6.根據權利要求4或5所述的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子，其特徵在於所述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子包含SEQ ID NO:3_8，15-16中任一個所示的序列。
7.一種藥物組合物，其包含與遞送載體結合的權利要求4-6中任一項所述的eIF6核酸抑制分子或病毒幹擾載體，和任選的一種或多種藥用載體，其中所述遞送載體選自膽固醇、納米顆粒、聚乙烯亞胺、魚精蛋白、陽離子多肽、殼聚糖或脂質體。
8.根據權利要求4-7中任一項所述的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子或藥物組合物在製備用於治療和/或預防運動性疲勞和/或記憶力減退的藥物中的用途。
9.根據權利要求8所述的用途，其特徵所述藥物用於預防和/或治療選自下列的疾病或功能障礙:慢性疲勞症候群、衰老、抑鬱症、腦部腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默病、帕金森病、腦動脈硬化、慢性鼻竇炎、老年痴呆症、匹克氏病(Pick’s disease)、亨廷頓病、肝豆狀核變性、精神分裂症或癲癇、神經退行性疾病、睡眠障礙、慢性酒精中毒酒精中毒、甲狀腺功能低下和神經性梅毒。`
【文檔編號】A61P35/00GK103525900SQ201210234087
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月6日 優先權日:2012年7月6日
【發明者】崔豔豔, 吳軍, 羅高興, 桂莉, 譚江琳, 賀偉峰 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院