蛋白質原位檢測試劑的製作方法

2023-09-24 01:48:55

專利名稱：蛋白質原位檢測試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及穩定的蛋白質和/或胺基酸檢測組合物，該組合物可用作一種原位檢測試劑，例如，在表面原位檢測。本發明還涉及用於使用上述組合物和包含此組合物的試劑盒來檢測表面上的蛋白質和/或胺基酸的方法。
背景技術：
蛋白質的檢測，比如，對自然完整的蛋白質和/或它們的亞組胺基酸和肽的檢測，尤其是微量檢測，是在實驗室、臨床、和法醫環境中重要的分析和生物技術的標準過程。通常，蛋白質和/或胺基酸的檢測是使用現有試劑、結合已經驗證過的不同技術以及儀器而完成的。現有方法傾向於依賴試劑和肽的自由胺基酸、末端胺基酸殘基反應，或者和溶液中蛋白的末端胺基酸殘基、側鏈官能團反應，通過產生可見的顏色、或者可探測的螢光產物，以定性和定量方式輔助確定分析物的存在。研究表明，在醫院滅菌與消毒裝置(Hospital SteriIisation&DisinfectionUnits)(也稱為Sterile Service Departments (SSD)(消毒服務部門))中，標準滅菌程序在對可回收利用的醫療器械進行淨化時，是沒有效率的(Baxter R.L et al J HospitalInfection.2006, 63，439-44)。這些研究顯示，醫療器械上的殘留蛋白可以通過外科手術、尤其是神經手術過程，直接導致潛在疾病的威脅，包括vCJD (變異型庫賈氏症)的轉移。因此，檢測醫療儀器表面的非常低數量(納克或者皮克)的殘留蛋白很重要，而且亟待解決。茚三酮(2，2_ 二羥基-1，3-茚二酮)是用於檢測一級和二級胺的化合物。茚三酮和胺基酸的alpha氨基殘基反應。在茚三酮和胺反應的時候，在合適的溫度環境下，會產生顏色深的藍/紫色發色團，即羅曼紫(2-[ (3-羥基-1 -氧茚-2-基)亞氨]-1，3-茚二酮)。茚三酮的顯色性質可以視覺檢測和定量分析胺基酸。在生物化學分析上，茚三酮被用於在各種分離技術、如色譜法、高效液相色譜(HPLC)或者固體多肽合成完成時，確定存在的胺基酸的濃度。無菌服務部門(SSD department)使用市場上可以購買到的試劑盒的卻三酮,用於定性檢測可回收使用的外科和/或牙醫設備的淨化和/或滅菌程序的效率。高壓蒸汽處理、加熱和清洗過的儀器的表面，用棉籤擦拭，然後用試劑盒裡面的茚三酮溼潤。一旦在棉籤上有顏色產生(通過和胺的反應)，通過視覺對比標準精氨酸棉籤評估，判斷是否有殘餘蛋白質。茚三酮依賴於自由可得的胺基酸來優選產生有色產物。在自由胺基酸存在的條件下，如胺基酸殘基自由暴露，試劑是最有效的。但是，在儀器被洗滌或者高壓蒸汽處理時，自由胺基酸，或蛋白質降解的胺基酸都被洗去。茚三酮可以檢測精氨酸的閾值大約是5微克/毫升，而牛血清蛋白的檢測閾值是實際很高的檢測閾值，只有500微克/毫升。也因為擦拭技術在將蛋白質從它們結合的位置吸收下來的效率很低，因此造成檢測靈敏度降低。由於對殘留蛋白質不敏感，而且產生假陰性的風險高，因此，茚三酮的靈敏度和特異性都很低。總的來說，作為試劑的茚三酮和茚三酮的試劑盒不能為淨化程序的蛋白質檢測提供足夠的靈敏度。
鄰苯二甲醛(OPA)也是一種在化學和生物研究中用於胺基酸檢測的試劑。因為其高的靈敏度而被用於胺基酸檢測。鄰苯二甲醛/硫醇的溶液，在胺基酸分析中是茚三酮的替代試劑(Stobaugh et al.(1983)分析生物化學135，頁495-504)。鄰苯二甲醛和一級胺在硫醇(如巰基乙醇，乙硫醇，或者(2R)-2-乙醯胺基-3-磺醯基丙酸、即通常所說的乙醯半胱氨酸(NAC))存在下反應,產生具有明亮突光的異Π引哚衍生物(Garcia Alvarez-Coqueet al.(1989)，分析生物化學180，頁172-176)，在Ex/Em=350/450納米下監測該衍生物。
權利要求
1.一種蛋白質和/或胺基酸檢測組合物，該組合物包括: (a)苯二甲醛，(b)C3-C6 硫醇， (c)pH值在約7.5到約10範圍內的緩衝溶液，和 (d)表面活性劑， 其中所述組合物進一步包括: Ce)硫醇還原化合物。
2.根據權利要求1所述的蛋白質和/或胺基酸檢測組合物，其特徵在於，該組合物由下列物質組合製備: Ca)約0.1毫摩爾/升至約10毫摩爾/升的鄰苯二甲醛， (b)約I毫摩爾/升至約20毫摩爾/升的C3-C6硫醇(c)約10毫摩爾/升至約100毫摩爾/升的、pH值在7.5到10之間的緩衝溶液， Cd)約0.01% (v/v,體積比)至約2% (v/v,體積比)的表面活性劑，和 (e)約0.05毫摩爾/升至約5毫摩爾/升硫醇還原化合物。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其特徵在於，所述C3-C6硫醇是乙醯半胱氨酸、2-巰基乙醇或者二硫代蘇糖醇。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述緩衝溶液的pH值在pH9到pH9.5之間。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述表面活性劑是非離子表面活性劑。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述硫醇還原化合物包括有二硫蘇糖醇或者三(2-羧乙基)膦。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物進一步包括螯合劑。
8.根據權利要求7所述的組合物，其特徵在於，所述螯合劑的濃度在約0.05毫摩爾/暈升至約5暈摩爾/暈升之間。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物進一步包括有機溶劑。
10.根據權利要求9所述的組合物，其特徵在於，所述溶劑選自於乙醇、甲醇、丙酮或者乙腈。
11.根據權利要求9或10所述的組合物，其特徵在於，所述溶劑是甲醇。
12.用於製備權利要求1-11所述的組合物的方法，該方法通過將成分(a)、(b)、(d)和Ce)混合到緩衝溶液(c)中而進行。
13.檢測蛋白質和/或胺基酸的方法，包括: a)施用權利要求1-11任一項所述的組合物至表面和/或底物上，和 b)檢測螢光。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於，使用能探測螢光的任何裝置或儀器來檢測螢光。
15.用於檢測蛋白質和/或胺基酸的試劑盒，包括:a)如權利要求1-11任一項所述的組合物,和b)使用說明。
16.用於檢測蛋白質和/或胺基酸的試劑盒，包括:a)如權利要求1-11任一項所述的組合物,和b)用於將所述組合物施用到表面和/或底物上的裝置，和c)使用 說明。
全文摘要
本發明涉及蛋白質和/或胺基酸的穩定的檢測組合物，該組合物可用於作為一種原位檢測試劑，例如，在表面原位檢測。本發明還涉及用於使用上述組合物和包含此組合物的試劑盒來檢測表面上的蛋白質和/或胺基酸的方法。
文檔編號G01N33/50GK103201626SQ201180051047
公開日2013年7月10日 申請日期2011年8月19日 優先權日2010年8月20日
發明者大衛·佩雷特, 索萊達·塞西莉亞·瑞茲·安拓麗, 南達·琪朔·巴布·南羽尼 申請人:倫敦大學瑪麗皇后西域學院