非同位素聚合酶鏈式反應－單鏈構象多態性檢測基因突變的方法
2023-10-10 18:47:04
專利名稱：非同位素聚合酶鏈式反應－單鏈構象多態性檢測基因突變的方法
技術領域：
本發明屬於用於疾病診斷的檢測基因突變的方法。
非同位素聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性檢測基因突變的方法已經廣泛應用。
這些方法包括以下步驟(1)按常規方法提取DNA；(2)PCR擴增待檢DNA；(3)經高溫或加鹼進行變性處理；(4)進行聚丙烯醯胺凝膠電泳；(5)銀染法顯示SSCP分析區帶。這些方法存在一些缺點一部分基因用傳統的高溫變性法或加鹼變性法有效，但有許多基因用這二種方法都無效，導致顯色後出現的區帶紊亂，模糊不清，且重現性差，片段較大時更是如此，因而檢測靈敏度隨著DNA片段的增大而下降很快(對200bp以下的片段可達100％，300bp時已低於85％)，故其應用受到很大限制。一般在檢測前均要進行複雜、費時的條件摸索。
本發明的目的在於提供一種可廣泛應用於各種基因突變的檢測(無論片段大或小)，且區帶更清晰、靈敏度更高、重現性好、簡便、快速的一種非同位素聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性檢測基因突變的方法。
本發明的方法包括以下步驟(1)按常規方法提取DNA；(2)PCR擴增待檢DNA；(3)變性處理；(4)聚丙烯醯胺凝膠電泳；(5)銀染法顯示SSCP分析區帶，其特徵在於採用的變性方法為按PCR產物變性劑(內含0．01～3％SDS、10～50mMEDTA)上樣緩衝液(內含95％甲醯胺、0．1％二甲苯青、0．1％溴酚藍、10mM EDTA)=1∶1∶1(體積比)條件下，在90～100℃進行變性處理3～5分鐘。
所述變性劑中的SDS可以用以下物質中的一種或二種所替代尿素、DMSD(二甲亞碸)、tritonX-100、OP、DTT等。
由於採用了離子鍵極性很強的變性劑，變性時，可通過與單鏈的極性基因發生相互作用而穩定單鏈構象，同時提供較大的空間位阻，使其他分子不易與單鏈相互作用，成為穩定DNA單鏈構象的主要因素，由於這種獨特的穩定作用，可以實現無論片段大或小，均能獲得區帶清晰、靈敏度更高、重現性好的實驗結果，也避免了舊方法複雜費時的條件摸索過程，可以應用於各種基因突變的檢測，方法簡單、快速。
實施例1九例女性性反轉者SOX9基因突變檢測(1)常規法提取DNA；(2)PCR擴增待檢DNA；(3)PCR產物2μl，變性劑2μl(內含0．01％SDS、20mMETDA)上樣緩衝液2μl(95％甲醯胺、0．1％溴酚藍、0．1％二甲苯青及10mMEDTA)放在0．5ml離心管中混勻，沸水浴加熱3～5分鐘後，立即放置冰浴中驟冷3～5分鐘，高速離心5秒、置於冰上；(4)進行聚丙烯醯胺凝膠電泳；(5)銀染法顯示SSCP分析區帶，區帶清晰。
實施例2，八例骨關節病患者軟骨細胞線粒體DNA基因檢測，步驟同實施例1，所用變性劑為0．5％尿素、30mMEDTA，區帶清晰。
實施例3，六例女性性反轉患者SRY基因檢測。步驟同實施例1，所用變性劑為3％OP、50mMEDTA，區帶清晰。
權利要求
1.一種非同位素聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性制檢測基因突變的方法，包括以下步驟(1)按常規方法提取DNA；(2)PCR擴增待檢DNA；(3)變性處理；(4)聚丙烯醯胺凝膠電泳；(5)銀染法顯示SSCP分析區帶；其特徵在於採用的變性方法為按PCR產物變性劑(內含0．01～3％、SDS、10～50mM EDTA)上樣緩衝液(內含95％甲醯胺、0．1％二甲苯青、0．1％溴酚藍、10mM EDTA)=1∶1∶1(體積比)條件下，在90～100℃進行變性處理3～5分鐘。
2.根據權利要求1的所述方法，其特徵在於變性劑中的SDS可以用以下物質中的一種或二種所替代尿素、DMSD(二甲亞碸)、tritonX-100、OP、DTT等。
全文摘要
本發明公開了一種非同位素聚合酶鏈式反應－單鏈構象多態性檢測基因突變的方法,是將傳統方法中採用的經高溫或加鹼進行變性處理改為採用離子鍵極性很強的SDS變性劑與上樣緩衝液在90～100℃進行變性處理3～5分鐘,實現無論片段大或小,均能獲得區帶清晰、靈敏度更高、重現性好的實驗結果。
文檔編號C12Q1/68GK1288958SQ00113518
公開日2001年3月28日 申請日期2000年6月30日 優先權日2000年6月30日
發明者朱敏, 譚文斌, 周鋼, 謝慎思 申請人:湖南醫科大學