自體胸水上清培養til細胞的方法
2023-10-06 08:19:44 1
專利名稱：自體胸水上清培養til細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種TIL細胞的培養方法，特別涉及一種利用自體胸水上清培養TIL細胞的方法。
背景技術：
腫瘤浸潤的淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，簡稱TIL)是繼LAK細胞之後第二代抗腫瘤效應細胞，能夠特異性殺傷腫瘤細胞，抗腫瘤活性較LAK細胞強50～100倍，成為臨床上主要應用抗腫瘤細胞免疫治療的手段選擇之一。
在本發明作出之前，製備TIL的方法主要是經非連續密度梯度離心法分離獲得TIL，然後在體外用人工合成的培養基，通常是含有10％人AB型血清的RPMI1640培養基培養2周左右時間，再回輸病人胸腔，殺傷病人體內的腫瘤細胞。這種TIL培養方法存在著諸多缺陷。一是體外培養時間過長，增加了汙染機率，導致不能回輸；二是有血清培養基應用人AB型血清，具有潛在的導致B肝、愛滋病等傳染病的可能；三是培養時間長、使用人AB型血清導致成本增加，增加了病人的財務負擔，也延長了病人的治療時間。
發明內容
本發明的目的就在於克服上述缺陷，研究、開發了一種利用病人自己胸水上清培養TIL細胞的方法。
本發明的技術方案自體胸水上清培養TIL細胞的方法，無菌收集癌性胸水，離心後保存上清，用淋巴細胞分離液分離下層細胞，去除下層細胞中的紅細胞、壞死組織碎片，其主要技術特徵在於(1)將上清留作培養基；(2)取下層細胞中的白膜層細胞至上清培養基培養；(3)12～24小時後，腫瘤細胞全部貼壁，懸浮的是TIL細胞；(4)將濃度在5×105/ml～1×106/ml的TIL細胞置於飽和溼度、5％二氧化碳孵箱內培養，溫度控制在37℃內；(5)1天後，加入終濃度50～100ng/ml的OKT3、800～6000U/ml的IL-2、50～100ug/ml的PHA；(6)隔1～2天，加入含800～6000U/ml的IL-2的完全培養基進行培養。
本發明的優點和效果在於體外培養時間約在2～3天內完成，大大節約了時間，減輕病人的痛苦，降低病人的經濟負擔；當其活化後即可回輸體內進一步培養，避免了自身資源的浪費，減少了體外培養時汙染的機率，也避免了有血清培養基所可能導致的各種傳染病的傳染發生；其方法本身過程簡單、易於操作，花費少，效果好。
具體實施例方式
無菌收集患者的癌性胸水各約1000ml，立即在百級實驗室進行TIL與腫瘤細胞的分離，胸水離心後，保存上清留作培養基；下層細胞應用淋巴細胞分離液進行分離，取白膜層細胞用留作培養基的自體上清培養，12～24小時，一般取16小時，可見腫瘤細胞全部貼壁，懸浮細胞幾乎都是TIL；將得到的TIL按1×106/ml的濃度懸於自體上清中，置於37℃、5％CO2孵箱內；在24小時內，即一天後加入終濃度為100ng/ml的OKT3、6000U/ml的IL-2、100ug/ml的PHA；隔1～2天，加入含6000U/ml的IL-2的完全培養基進行培養。然後，將培養所獲得的TIL在3天即回輸患者胸腔，治療惡性胸水。
將TIL應用自體胸水上清培養與TIL用含10％人AB型血清的RPMI 1640培養進行對比。
在培養的第3、7、14、21天，經t檢驗比較對TIL擴增速率的影響發現，二者間無統計意義上的差別，P＞0.05；自體上清培養的TIL各亞型與用含10％人AB型血清的RPMI 1640培養的TIL各亞型所佔比例間無統計意義上的差別，P＞0.05；培養一周後，用MTT法檢測發現兩種培養液培養的TIL對自體腫瘤細胞的殺傷活性與培養前及培養第3天的殺傷活性比較，差異顯著，自體上清組尤為顯著；培養一周後，其殺瘤活性明顯提高，P＜0.05，以自體上清組最為明顯；兩種培養方法培養的TIL在第3天及第7天的殺瘤活性比較無統計學差異，P＞0.05。
應用自體上清作為培養基培養TIL，結果證明，對TIL的生長速度、免疫表型變化及對自體腫瘤細胞的殺傷活性與含有10％人AB型血清的RPMI 1640培養基間無差異，因此自體上清作為培養基培養TIL是可行的；TIL分離後，短期培養3天，當其開始出現增殖、抑制狀態可能剛被解除時回輸體內，繼續依賴自體胸水存活並進一步擴增，發揮殺瘤效應。
權利要求
1.自體胸水上清培養TIL細胞的方法，無菌收集癌性胸水，離心後保存上清，用淋巴細胞分離液分離下層細胞，去除下層細胞中的紅細胞、壞死組織碎片，其特徵在於(1)將上清留作培養基；(2)取下層細胞中的白膜層細胞至上清培養基培養；(3)12～24小時後，腫瘤細胞全部貼壁，懸浮的是TIL細胞；(4)將濃度在5×105/ml～1×106/ml的TIL細胞置於飽和溼度、5％二氧化碳孵箱內培養，溫度控制在37℃內；(5)1天後，加入終濃度50～100ng/ml的OKT3、800～6000U/ml的IL-2、50～100ug/ml的PHA；(6)隔1～2天，加入含800～6000U/ml的IL-2的完全培養基進行培養。
全文摘要
本發明涉及一種利用自體胸水上清進行TIL細胞的培養方法。本發明採用將收集的癌性胸水離心後保存上清，用作培養基，將下層細胞中的白膜層細胞至該上清培養基中培養，得懸浮的TIL細胞，再至孵箱內培養，1天後加入OKT3、IL－2、PHA等，1、2天再加入IL－2進行培養。本發明的實驗數據表明該方法是可行的，與現有方法相比，某些方面相同，某些方面更優。而本發明卻避免了現有方法使用人AB血清可能導致的B肝、愛滋病等傳染，體外培養時間過長所增加的汙染機率，以及培養時間過長增加病人負擔，延長治療時間和成本增加等缺陷。
文檔編號C12N5/08GK1560234SQ20041001409
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月18日 優先權日2004年2月18日
發明者劉寶瑞, 鄒徵雲 申請人:南京大學醫學院附屬鼓樓醫院