一種預防和治療神經系統疾病的豬腦多肽及其製備方法

2023-11-06 10:05:02 1

一種預防和治療神經系統疾病的豬腦多肽及其製備方法
【專利摘要】一種豬腦多肽，該多肽的分子量在1000～4000道爾頓，多肽中含亮氨酸19％～21％、賴氨酸16％～18％、穀氨酸16％～18％，丙氨酸11％～13％、精氨酸9％～11％，天冬氨酸7％～9％，纈氨酸6％～8％、異亮氨酸6％～8％。本發明的多肽具有良好的自由基清除能力。
【專利說明】一種預防和治療神經系統疾病的豬腦多肽及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及蛋白質多肽領域，具體涉及一種從豬腦中提取的多肽及其製備方法。

【背景技術】
[0002] 隨著世界人口老齡化，神經細胞毒性損傷導致的疾病也越來越多。特別是像阿爾 茲海默病（即老年性痴呆）、帕金森病（PD)等類型的疾病，目前尚沒有其病理特徵治療的藥 物和方法。對於老年痴呆，雖然有些安神、醒腦、鎮靜的藥物具有一定的緩解病症的作用，但 療效並不顯著，美國FDA通過治療老年性痴呆的藥物主要有乙醯膽鹼酯酶抑制劑和NMDA受 體拮抗劑兩類，這兩類藥物僅對中晚期老年性痴呆患者的痴呆症狀有所輕度改善和延緩痴 呆進展，並無法治癒。大量研宄資料表明，肽類可增加記憶能力，具有神經保護作用，通過動 物實驗證實，在治療神經損傷方面有良好效果。在神經退行性病變的組織培養中表現出顯 著地神經保護作用。
[0003] 神經系統疾病是一個長期慢性疾病，發病過程中特徵不明顯，常常被忽略導致神 經細胞不可逆的損傷，以至於危及生命。因此研發一種天然健康，具有預防神經系統損傷的 多肽粉就非常有實用意義。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種豬腦多肽，該多肽的分子量在1000?4000道爾頓，多肽 中含亮氨酸19%?21%、賴氨酸16%?18%、穀氨酸16%?18%，丙氨酸11 %?13%、精 氨酸9%?11%，天冬氨酸7%?9%，纈氨酸6%?8%、異亮氨酸6%?8%。
[0005] 本發明的多肽，是通過以下的方法製備的：
[0006] (1)分離提取：取豬腦，加入5%的乙醇水溶液，5%乙酸調pH值至3?5,搗碎，過 濾，重複上述操作一次，取濾渣，得膠狀物；
[0007] (2)水解：取步驟⑴膠狀物，控制pH值在7. 0?10. 0,加入胰蛋白酶，37°C保溫 5?7小時，90°C加熱滅活酶，控制pH值在6. 5?7. 5、溫度在50?60°C，加入木瓜蛋白酶， 以速度100?300r/min攪拌0. 5?1. 5小時，進行反應，保溫5?10小時，煮沸5?60min， 滅活酶，結束反應，過濾，5000?10000r/min離心，收集上清液，過濾，減壓乾燥得乾粉；。
[0008] (3)純化：取乾粉，置於陰離子交換柱，以不同濃度氯化鈉溶液梯度洗脫，在波長 238nm處測定吸光度，以吸收峰來收集洗脫液，濃縮，乾燥，得豬腦多肽。
[0009] 根據本發明的多肽，所述豬腦為新鮮或冷凍豬腦。
[0010] 根據本發明的多肽，所述步驟（2)中控制溶液pH值具體實施為：0. 1?2. Omol/L 氫氧化鈉溶液調pH值至7. 0?10. 0 ;0. 1?2. 0mol/L鹽酸溶液調pH值至6. 5?7. 5。 [0011] 根據本發明的多肽，所述步驟（2)中胰蛋白酶佔步驟（1)膠狀物重量比為0. 3%? 0. 7%，優選0. 5%，木瓜蛋白酶用量為膠狀物重量的0. 1 %?0. 5%，優選0. 3%。
[0012] 根據本發明的多肽，所訴步驟（3)中陰離子交換柱填料為DEAE sepharose FF，所 洗脫下來的多肽組分為陰離子交換柱中的第2、3、4吸收峰的洗脫組分。
[0013] 根據本發明的多肽，所訴步驟（3)中氯化鈉的濃度為0. 1?I. Omol/L。
[0014] 根據本發明的多肽，所訴步驟（3)中乾燥的溫度為50°C?55°C。
[0015] 本發明的多肽對神經細胞培養液中NO及NOS的影響試驗表明能夠明顯降低細胞 NO含量及抑制NOS活性。清除自由基試驗表明所述多肽有良好的自由基清除能力。

【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述。
[0017] 實施例1
[0018] 取豬腦，加入5 %的乙醇水溶液，5 %的乙酸水溶液調pH值為4、搗碎，過濾，重複一 次，取濾渣，得膠狀固形物。取膠狀固形物lkg，控制ph值在8. 2,加入5g胰蛋白酶，37°C 保溫6小時，90°C加熱滅活蛋白酶，控制pH值在7. 1，溫度在55°C，加入5g木瓜蛋白酶，以 速度300r/min攪拌1. 5小時，進行反應，保溫6小時；煮沸30min，滅活酶，結束反應，過濾。 8000r/min離心，收集上清液。取離心液，微孔濾膜過濾，減壓乾燥，得乾粉，置於陰離子交換 柱（DEAE s印harose FF)，以不同濃度氯化鈉溶液梯度洗脫。在波長238nm處測定吸光度， 收集第2、3、4個吸收峰的洗脫液，濃縮，乾燥，得多肽。
[0019] 實施例2
[0020] 取豬腦，加入5 %的乙醇水溶液，5 %的乙酸水溶液調pH值為4、搗碎，過濾，重複一 次，取濾渣，得膠狀固形物。取膠狀固形物lkg，控制ph值在8. 2,加入7g胰蛋白酶，37°C 保溫5小時，90°C加熱滅活蛋白酶，控制pH值在7. 1，溫度在55°C，加入3g木瓜蛋白酶，以 速度300r/min攪拌1小時，進行反應，保溫5小時；煮沸30min，滅活酶，結束反應，過濾。 8000r/min離心，收集上清液。取離心液，微孔濾膜過濾，減壓乾燥，得乾粉，置於陰離子交換 柱（DEAE s印harose FF)，以不同濃度氯化鈉溶液梯度洗脫。在波長238nm處測定吸光度， 收集第2、3、4個吸收峰的洗脫液，濃縮，乾燥，得多肽。
[0021] 實施例3
[0022] 取豬腦，加入5 %的乙醇水溶液，5 %的乙酸水溶液調pH值為4、搗碎，過濾，重複一 次，取濾渣，得膠狀固形物。取膠狀固形物lkg，控制ph值在8. 9,加入3g胰蛋白酶，37°C 保溫7小時，90°C加熱滅活蛋白酶，控制pH值在7. 1，溫度在55°C，加入Ig木瓜蛋白酶，以 速度300r/min攪拌1. 5小時，進行反應，保溫9小時；煮沸30min，滅活酶，結束反應，過濾。 8000r/min離心，收集上清液。取離心液，微孔濾膜過濾，減壓乾燥，得乾粉，置於陰離子交換 柱（DEAE s印harose FF)，以不同濃度氯化鈉溶液梯度洗脫。在波長238nm處測定吸光度， 收集第2、3、4個吸收峰的洗脫液，濃縮，乾燥，得多肽。
[0023] 測試實施例I :N0含量及NOS活性檢測
[0024] 採用多肽對神經細胞培養進行幹預，對培養液中NO含量及NOS活性進行檢測，與 正常對照組和模型組進行對比，
[0025] 實驗方法：
[0026] (1)細胞培養
[0027] 取人神經母細胞用0. 25 %的胰蛋白酶2-3ml，置於37 °C恆溫水浴箱中振蕩消化 10min，加入含有10%胎牛血清的DMEM終止消化，反覆吹打未消化的組織塊，調整細胞密度 約為lX10 5/ml，吸出細胞懸液放入培養瓶中，置於37°C，5%二氧化碳培養箱中培養。傳代 後的細胞接種子96孔培養板中，每孔200 μ 1，待細胞重新長滿匯合後，用於以下實驗。
[0028] (2) A β 25-35 蛋白前處理
[0029] 將Αβ 25-35蛋白用超純水配製成濃度為500 ymol/L的溶液，在37°C培養箱中放 置7天，分裝至EP管中，-20°C保存備用。
[0030] (3)樣品製備
[0031] 將接種於96孔培養板中處於對數生長期的細胞，隨機分為3組，設對照組，模型 組，多肽組，對照組添加20 μ 1培養基，模型組加10 μ 1濃度為500 μ mol/L的A β 25-35蛋 白溶液及10 μ 1培養基，多肽組加10 μ 1濃度為500 μ mol/L的A β 25-35蛋白溶液及10 μ 1 培養基配製的多肽溶液。置於培養箱中，收集48小時、72小時兩個時間點的細胞培養液， lOOOr/min離心lOmin，取上清液分別用NO試劑盒、NOS試劑盒進行NO、NOS的檢測。
[0032] 實驗結果：
[0033] 經過多肽幹預後，多肽組NO含量及NOS活力與同時間點模型組相比明顯降低。特 別是72小時時多肽組NO含量及NOS活力較同時間點模型組明顯降低。
[0034] 表1多肽對神經細胞培養液中NO的影響（μ mol/L，η = 3, _x±s )

【權利要求】
1. 一種豬腦多肽，其特徵在於，該多肽的分子量在1000?4000道爾頓，多肽中含亮氨 酸19%?21%、賴氨酸16%?18%、穀氨酸16%?18%，丙氨酸11 %?13%、精氨酸9%? 11%，天冬氨酸7%?9%，纈氨酸6%?8%、異亮氨酸6%?8%。
2. 權利要求1所述的豬腦多肽的製備方法，包括以下步驟： (1) 分離提取：取豬腦，加入5%的乙醇水溶液，5%乙酸調pH值至3?5,搗碎，過濾， 重複上述操作一次，取濾渣，得膠狀物； (2) 水解：取步驟（1)膠狀物，調節pH值在7. 0?10. 0,加入胰蛋白酶，37°C保溫5? 7小時，90°C加熱滅活酶，控制pH值在6. 5?7. 5、溫度在50?60°C，加入木瓜蛋白酶，以速 度100?300r/min攪拌0. 5?1. 5小時，進行反應，保溫5?10小時，煮沸5?60min，滅 活酶，結束反應，過濾，5000?10000r/min離心，收集上清液，過濾，減壓乾燥得乾粉； (3) 純化：取步驟（2)乾粉，置於陰離子交換柱，以不同濃度氯化鈉溶液梯度洗脫。在 波長238nm處測定吸光度，以吸收峰來收集洗脫液，濃縮，乾燥，得豬腦多肽。
3. 根據權利要求2所述豬腦多肽的製備方法，步驟（2)中所述的胰蛋白酶用量為步驟 (1)膠狀物重量的0.3%?0.7%。
4. 根據權利要求3所述豬腦多肽的製備方法，步驟（2)所述的胰蛋白酶用量為步驟 (1)膠狀物重量的〇? 5%。
5. 根據權利要求2所述豬腦多肽的製備方法，步驟（2)所述的木瓜蛋白酶用量為步驟 (1)膠狀物重量的〇? 1 %?0.5%。
6. 根據權利要求5所述豬腦多肽的製備方法，步驟（2)所述的木瓜蛋白酶用量為步驟 (1)膠狀物重量的0.3%。
【文檔編號】C07K1/18GK104497102SQ201410775835
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】林波, 王欣, 宮曉輝, 於秀玲, 孔新穎, 韓風雨 申請人:內蒙古天奇生物科技有限公司, 內蒙古天奇中蒙製藥股份有限公司, 內蒙古天奇藥業投資（集團）有限公司