通過超聲波及溫度控制的標準化組織樣本保護的製作方法

2023-12-06 13:09:01

專利名稱：通過超聲波及溫度控制的標準化組織樣本保護的製作方法
技術領域：
本發明涉及組織樣本領域，更具體地，本發明涉及一種通過超聲波及溫度控制的標準化組織樣本保護。
背景技術：
I.組織保護領域的概況
當從病患身體上取出組織樣本之後，缺血性層疊立即開始。缺血性層疊導致很多易受影響的細胞分子，例如mRNA (信使核糖核酸)降解、組織樣本中蛋白質脫磷酸作用。因此，越久的組織樣本缺血，越多的病患組織樣本分析前的改變將會發生。這種改變常常阻礙正確的判斷和敏感分子的診斷和預測報告[Liotta 2000, Emmert-Buck 2000, Compton 2007,Hewitt 2008, Espina 2008]。通過將組織樣本保存在一個深度冰凍的環境來阻止分子改 變的快速冷凍法，是一個為細胞分析的組織樣本保存的標準方法。然而，除了高額的花費和複雜的設備外，快速冷凍破壞了組織樣本的細胞形態。好的組織形態是診斷組織樣本需求量最重要的關鍵。在現行的外科組織學實踐中，組織樣本總是被一大團或粗魯的放置入固著劑中固定。固定的組織然後通過脫水、清除、注入石蠟、然後牢牢的嵌入到石蠟塊中。福馬林是最常被臨床病理學用來做固定劑的[Hewiit 2008, Fox 1985，1987，Boon 1988]。現代的組織學是以組織形態被福馬林固定和石蠟植入(FFPE)組織展示為基礎的。福馬林固定的組織在大多數臨床病理學實驗室常常被拿到一個恆溫的房間一整夜或更長時間。易受影響的分子可能會比樣本完全浸泡入福馬林前減少。對比甲醛和蛋白質在室溫中快速反應，引起組織外圍的大範圍交聯排列和組織中心的小範圍的交聯排列。長時間的固定時間有時必須防止中心區域趕上邊緣區域在交聯的範圍[Medawar 1941; Boon 1988;Helander 1994, 1999; Ruijter 1997]。福馬林固定組織樣本有以下2個主要問題(I)生物分子被大範圍的交聯嚴重的破壞；(2)由於各種不同的固著時間，交聯水平也呈現出不同的樣本。因此傳統的FFPE樣本通常不是標準的。缺少標準化和分子的大量改變，是FFPE組織樣本被用於數量上的分子分析的主要障礙。—定數量的無交聯固著劑試圖發展成為適應定量分子分析。[Wenk 2006; WesterK 2003; Boon 2008; Espina 2009]。無交聯固著劑提供的組織形態學不同於那些福馬林提供的——一個約束無交聯固著劑在診所病理學群體被廣泛接受的主要因素。解決組織保存問題的一個理想的方法是發展一種方法，可以產生不僅擁有高標準的FFPE形態，而且高質量的分子，類似用一種簡單的和有效的快速冷凍組織方式。2.相關技術的解釋
傳統方法是用在隔離溶解的含10%磷酸(鹽)緩衝液的甲醛來準備固著組織，一系列的漸增的脫水乙醇的濃聚物，和可以導致組織樣本脫水的二甲苯，在石蠟前注入。由於這些進程必須花費這些時間，通常8小時或者更長時間，習慣上完成這些分開的步驟固著，脫水，乾燥，注入，一整夜的在為了完成那些任務所設計的自動機械儀器中，(例如，u. S.Pat. Nos. 3，892，197，4，141，312，and 5，049，510)。一個典型的自動組織樣本處理器(TISSUE-TEK)需要超過8小時，並且程序設定的處理一組組織樣本。在水溶液中，甲醛分子[HC0H]與水結合，形成甲二醇[CH2 (OH)2]，與未水合的甲醛分子相平衡生存，如下
HCOH + H2O <- CH2 (OH) 2
低溫傾斜這些平衡的甲二醇分子將比未水合的甲醛分子更快滲入組織。不管怎樣，是甲醛分子建立了這種交聯的橋梁。福馬林固著劑跟溫度有說不清的關係1)低溫有益於分子作為組織樣本保存，使交聯變緩慢，但福馬林擴散至組織樣本變的更加容易；2)高溫有益於減輕交聯的HCOH形成，但同時，交聯的蛋白質在組織邊緣放緩福馬林滲透入組織中央；3)在低溫下，分子擴散速度一般變低，是由於分子運動的減少，所引起的福馬林穿透速度的明顯減少。 在室溫中，福馬林固著按先後順序有一個慣例的組織樣本(1-4_在最厚的部分)，如下(1)甲二醇迅速擴散到內部大約需要l_4h ;(2)成功步驟(甲二醇脫水和交聯反應)一起大約需要24h ;因此，甲二醇的擴散在這裡不是被稠密的交聯的蛋白質網絡阻礙的。然而，在高溫下，所有的3個步驟都被加速。因為脫水和交聯也在某些甲二醇存在的被加熱組織中首先完成，也就是說，組織大塊的邊緣，進一步的擴散進入中心是被稠密的蛋白質網絡阻礙產生的。為了加速組織進程，美國專利號4，656，047，4，839，194，和5，244，787利用微波能量，美國專利號3，961，097，5，089，288，和6，291，180利用超聲波能量，美國專利號5，023，187利用紅外線能量。能影響組織固著的超聲波的三個因素如下1)微型的氣孔和高效的對流在固著中根據超聲波生產了，而且組織樣本增加了組織對固著劑分子的浸透性；2)超聲波引起了溫度的逐漸增加，導致交聯速度的逐漸增快；3)超聲波可能產生固著劑中的自由基也跟福馬林產生交聯。當針對個人的要正在朦朧地出現，對高質量和高標準的組織樣本有了一個迫切的需求。這種需要，當把它們轉變成FFPE組織樣本準備，需要組織樣本很快地而且平均地被固定，而且處理步驟標準化。因此，建立程序和可能完成所有這些的儀器設備是可取的。缺乏標準化的記錄和缺乏福馬林組織固著的內部控制是FFPE組織樣本的主要缺陷。長時間的陷於固著劑中，尤其那些大的樣本是做及時的診斷的最主要的限制。它也被視為激勵手術室和病理學實驗室中改變前置固定組織操作程序的一個主要的因素。在大多數的醫院中，組織在手術室中被放在福馬林之中；因此，病理學家不能夠控制固定時間。因為福馬林固著的持續時間影響交聯的程度，也就是依次影響分子數量的化驗的有效性，因此，實際上不可能在石蠟切片上做到標準化的數量上的研究報告。除此之外，大於25克的固體樣品並不總是能在24小時的福馬林中被固定完成。將外科手術樣本切成較小的片以促進固定，但是對最終的解剖方向並不受歡迎，而且時常延遲前置固定時間巨大分子結構的改變，尤其參與細胞路徑信號的細胞成份，連同組織自溶，在組織從病患身上移下後立即發生。在被大多數的病理部門用的記錄中，福馬林固著是在室溫或促進福馬林滲透的更高的溫度中完成的。在持續很長時間的滲透階段在周圍的溫度，易受影響分子自溶的下降，例如mRNA，使磷酸化蛋白質和蛋白質抗原可能發生。除了巨大分子變化之外，在周圍溫度引起的福馬林邊緣的遷延照射不斷發生，導致過度固著，同時大的樣本中心固著不完全。這些不規則的固定常常導致免疫組織化學化驗和可能的許多其他分子測試結果不一致。 參考文獻
1.Auer H， Lyianarachchi S， Newsom D， Klisovic MI, Marcucci G， KornackerK. Chipping away at the chip bias: RNA degradation in microarray analysis. NatGenet. 2003. 35(4) :292-293.
2.Bancroft JDj Stevens A， Turner DR. Theory and practice of histologicaltechniques. New York, Churchill Livingstone, 1996. 3.Boon ME, Gerrits PO， Moorlag HE， Nieuwenhuis P， Kok LP. Formaldehydefixation and microwave irradiation. Histochem. J. 1988， 20: 313-322.
4.Boon ME, Kok LP. Theory and practice of combining coagulant fixation andmicrowave histoprocessing. Biotech Histochem. 2008. 83(6):261-77.
5.Chu W, Furusato B，Wong K，Mostofi FKj Zhu Z，Abbondanzo SLj andLiang Q. Wei MQ，Sesterhenn IAj Ultrasound-Accelerated Formalin Fixation ofTissue Improves Morphology, Antigen and mRNA Preservation. Mod. Pathol. 2005，18:850-863.
6.Chu WSj Liang Q，Tang Y，King R，Wong K，Gong M，Wei M，Liu J，Feng SHjLo SC， Andriko JAj Orr M. Ultrasound-accelerated tissue fixation/processingachieves superior morphology and macromolecule integrity with storagestability. J. Histochem. Cytochem. 2006，54:503—513.
7.Chuj WSj Liang Q，Liu J，Wei MQj Winters M，Liotta LA, Sandberg G，Gong M(2005) 「A Nondestructive Molecule Extraction Method Allowing Morphological andMolecular Analyses Using a Single Tissue Section」 Lab. Invest. 85 (11):1416-28.
8.Compton C. Getting to personalized cancer medicine - taking out thegarbage. Cancer. 2007， 110:1641-1643.
9.Cronin M，Sangli C，Liu ML, Pho M，Dutta D，Nguyen A，Jeong J，Wu J，Langone KCj Watson D. 2007. Analytical validation of the Oncotype DX genomicdiagnostic test for recurrence prognosis and therapeutic response predictionin node-negative, estrogen receptor-positive breast cancer. Clin Chem.53:1084-1091.
10.Dapson RW. Fixation for the 1990 ^ s: a review of needs andaccomplishments. Biotech Histochem 1993. 68:75.
11.Drakhli E. I. Methods of using ultrasonics in a quick histologicaltreatment of tissues. Arkh. Patol. 1967，29:81-82.
12.Emmert-Buck MR, Strausberg RLj Krizman DB， et al. Molecular profilingof clinical tissue specimens: feasibility and applications. Am J Pathol. 2000，156:1109-1115.13.Espina V，Edmiston KHj Heiby M，Pierobon M，Sciro M，Merritt B，Banks
S,Deng J，VanMeter AJj Geho DHj Pastore L，Sennesh J，Petricoin EF 3rd，LiottaLA. (2008) A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissueprocurement process. Mol Cell Proteomics. 7(10) :1998-2018.
14.Espina V，Mueller C，Edmiston K，Sciro M，Petricoin EFj Liotta LA.Tissue is alive: New technologies are needed to address the problems ofprotein biomarker pre-analytical variability. Proteomics Clin Appl. 2009.3(8) :874-882.
15.Fox, C. H.，Johnson, F. B.，Whiting, J.，and Roller, P. P. : Formaldehydefixation. J HistocheCytochem 1985， 33:845-853.
16.Fox CHj Beran M: Formaldehyde: The Fixative. The J Histotechnol 1987，10:199-201.
17.Helander KG. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. BiotechHistochem. 1994， 69:177—179.
18.Helander KG. Formaldehyde binding in brain and kidney: a kinetic studyof fixation. The J. of Histotechnology. 1999， 22: 317-318.
19.Hennig J， Nauerth A， Friedburg H. RARE imaging: a fast imaging methodfor clinical MR. Magn Reson Med 1986; 3:823-833.
20.Hewitt SM， Lewis FA, Cao Y， Conrad RCj Cronin M， Danenberg KDj GoralskiTJj Langmore JPj Raja RGj Williams PM， Palma JFj Warrington JA. Tissue handlingand specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recoveryof nucleic acids from formalin-fixed， paraffin-embedded tissue. Arch Pathol LabMed. 2008，132:1929-35.
21.Levene A. On the histological diagnosis and prognosis of malignantmelanoma. J. Clin. Pathol. 1980，33(2): 101-124.
22.Liotta LA, Petricoin E: Molecular profiling of human cancer. NatureReviews Genetics. 2000，1:48-56.
23.Medawar PB. The rate of penetration of fixatives. J Royal Micr Soc.1941，61:46-57.
24.Obertyshev V. G. Ultrasonic express paraffin handling of histologicalspecimens. Sud. Med. Ekspert. 1987，30:56-58.
25.Paik S，Kim CYj Song YKj Kim WS. 2005. Technology insight: Applicationof molecular techniques to formalin-fixed paraffin-embedded tissues from breastcancer. Nat Clin Pract Oncol. 2:246-254.
26.Pusztai L Current status of prognostic profiling in breast cancer.Oncologist. 2008， 13:35060.
27.Rait VKj O』Leary TJj Mason JT. Modeling formalin fixation and antigenretrieval with bovine pancreatic ribonuclease A: I—structural and functionalalterations. Lab Invest. 2004， 84:292-299.28.Rait VKj Xu Lj O』Leary TJj Mason JT. Modeling formalin fixationand antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationshipof cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Lab Invest. 2004，84:300-306.
29.Ruijter ETj Miller GJj Aalders TWj van de Kaa CA， Schalken JAj DebruyneFM， Boon ME. Rapid microwave-stimulated fixation of entire prostatectomyspecimens. Biomed-II MPC Study Group. J Pathol. 1997，183 (3):369-75.
30.Schroeder A， Mueller 0， Stocker S， Salowsky R， Leiber M， Gassmann M，Lightfoot S, MenzelWj Granzow M， Ragg T. The RIN: an RNA integrity number forassigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 2006. 31;7:3. 31.Shmurun RI. Methods for the rapid preparation of paraffin blocks. ArkhPathol. 1992，54: 4647.
32.Stephanis CGj Hatiris JGj and Mourmouras DE. Acceleration offormaldehyde reactions with proteins due to ultrasound. UltrasonicsSonochemistry. 1998. 5:33-35.
33.Wenk P. Fixatives: coagulant vs non-coagulant or is it additive vsnon-additive Histologic 2006. 39: 36
34.Wester K， Asplund A， Backvall H et al. Zinc-based fixative improvespreservation of genomic DNA and proteins in histoprocessing of human tissues.Lab Invest 2003. 83:889。

發明內容
這個發明是有關那些被用於促進固著和組織樣本進程的利用超聲波和溫度控制來實現標準化的組織樣本保存的方法和裝置。首先，這個發明涉及一種低溫的固著方法，其包括(a)在一冷凍的低溫下將組織樣本浸入到固著劑中；(b)用一重疊的超聲波冷凍系統來照射固著劑中的組織樣本以保持組織樣本和固著劑溫度保持在低點；(C)隨意地，關掉重疊冷卻系統，並提高組織樣本溫度，並繼續單獨超聲波照射固著劑，或與其他加熱方法 結合；(d)隨意地，用化學試劑或冷卻停止(淬熄)交聯反應。這個發明也涉及組織樣本保存方法，其包括(a)固著步驟，其包含i)組織樣本在從病患身上切離之後立即浸泡入固著劑中，並保持低溫直至下一個步驟；ii)組織樣本在寒冷的固著劑中被超聲波照耀，樣本/固著劑的溫度被一個有層次的冷卻系統用超聲波徹底的、均勻的穿透固著劑分子；iii)隨意地，固著劑的溫度然後在冷卻系統被關掉的時候，被其他類型的超聲波、微波爐或能源升起。(b)至少一個脫水步驟，其包含，固著的組織樣本浸泡入一個脫水的環境，然後用超聲波照射固著的組織樣本；(C)至少一個清潔程序，其包含，浸泡這個固著過的、脫水的組織樣本進入一個潔淨的環境，然後用超聲波照射固著過的、脫水的組織樣本；(d) —個浸透步驟，包含浸泡這個固著過的、脫水過的，並且清潔過的組織樣本進溶解的蠟或者石蠟中，然後用超聲波照射固著過的、脫水過的，並且清潔過的組織樣本。本發明也與組織樣本保存裝置相關，其包含至少一個為了陳放組織樣本和保存反應物容器，一用來產生超聲波填滿組織保存反應物超聲波發電系統，和一外加超聲波發電系統來維持一個低的溫度的溫度控制系統。


圖I :用超聲波和溫度控制標準化的預分析組織樣本保存工作流程；
圖2 :不同福馬林濃度的固著劑環境的交聯結果；
圖3 :溶菌酶，BSA，肌紅蛋白，核糖核酸酶A，胰蛋白酶和蛋白，在Ix PBS, pH 7,20 mg/ml.情況下分別溶解；每50ml蛋白質溶液與相同容量的NBF混合，在特定溫度下培養10分鐘。培養後，每培養的6ml混合物由2ml 4倍的SDS裝載緩衝並裝載到一個良好的SDSPAGE，用電泳療法分開，並用考馬斯藍進行染色；
圖4 :一個US變頻器包含在一個可從溶解室(反應室)移動的變頻器外罩內的US反應 室構造；在這個結構中，聲波通過一種方向發出。組織樣本可以使依附在一個可移動外罩上，然後可以與外罩一起從這個反應室移動到另外個反應室；
圖5 :—個US變頻器包含在一個可從溶解室(反應室)移動的變頻器外罩內的US反應室構造。在這個結構中，聲波通過一種方向發出。組織樣本可以使依附在一個可移動外罩上，然後可以與外罩一起從這個反應室移動到另外個反應室；
圖6 :—個加入冷卻/加熱系統的US反應室結構。在這個結構中，固著劑或反應進程溶液在這個冷卻/加熱裝置中冷卻或者加熱，並且在US反應室中循環進出；
圖7:—個在US反應室中用來產生真空和壓力的氣泵/活塞的結構。在這個結構中，US反應室的底部添加一個US變頻器，利用升降來為US反應室產生壓力和真空；
圖8 :一個在US反應室中用來產生真空和壓力的氣泵/活塞的結構。在這個結構中，US反應室的頂部升高或降低來為反應室提供壓力和真空；
圖9 :牛的腎臟(1)，肝臟(2)，胰腺(3)組織樣本H&E固著，在(A)室溫中一整夜和在(B)4攝氏度(上翼片)的對比；和量化的每份原子核數量和原子核大小(下翼片)；
圖10 :肝臟組織樣本中心和邊緣的H&E著色，利用和未利用US放射；
圖11 :在母牛腎組織樣本上的IHC和蛋白質印跡研究，在4攝氏度下用US放射(US-LT-FFPE) 30分鐘和一整夜的在室溫下(FFPE)。IHC化驗為波形蛋白和細胞角蛋白沒有抗原取回做準備。蛋白質印跡化驗是用從相同數量的組織樣本用各自的方法固定的完整的蛋白質抽出的；
圖12 =RNase A在放射性示蹤物下在福馬林和RNA，50%的甲醇，和用PBS在高壓蒸汽滅菌器(120° C)中30分鐘抑制活動的比較；
圖13 =RNaseA在指定數量的NBF在放射性示蹤物下或4° C下5分鐘，然後混合2 y gtRNA培養和在室溫下30分鐘給RNase A反應和用2%的瓊脂糖凝膠分開。tRNA分子長度在50-100核苷之間。圖14 :固定在4度或室溫中性緩衝福馬林溶液中不同時間長度後，T47D細胞裂解液的SDS-PAGE和Western blot的分析。(I):通過考馬斯亮藍染色的SDS PAGE圖片。
(2): HER-2和ER抗體在westernblot膜上的染色。(3):不同固定時間長度和溫度下，HER-2和ER的Western blot信號強度分析。
具體實施例方式現在，幾乎所有臨床的組織樣本都是在室溫的福馬林中被處理。[Hewitt 2008,Boon 2008]。在寒冷的福馬林中處理組織是被深思熟慮過後，並且只偶爾用於研究。妨礙冰凍福馬林固著程序在臨床中被廣泛接受的原因，包括下列各項
I.普遍相信，一個充分的交聯水平必須持續到組織樣品被顯微鏡觀察前被確保恰當的保存。2.組織樣本達到一個期望的交聯水平，在寒冷的環境中比在室溫中需要更多時間。3.處理組織在室溫中更為方便。我們已經展示，組織樣本在4攝氏度中用福馬林固著一整夜產生極好的FFPE形態，雖然組織樣本仍然看起來新鮮，但仍然要指出的是，微量的交聯已經足夠提供優質的福 爾馬林形態。在寒冷的福馬林固著組織中的完整有效的生物標記，比那些在傳統室溫方法處理免疫組織化學(IHC)和蛋白質印跡分析要更好。我們進一步示範，超聲波(US)照射可以顯著減少在組織樣本在寒冷福馬林中固定的時間。一個好組織樣本保存策略應該顯示出立即禁止自我分解的能力(也就是，內生毀滅性的酵素的失活)，減少分子改變的能力，產生維護組織樣本最佳細胞和亞細胞形態的能力,和儘可能多的高分子從組織樣本中恢復的能力。中立的緩衝的福馬林(NBF)，常常當作10%NBF提及，是在磷酸鹽緩衝鹽水中10倍稀釋的福馬林溶液，其中甲醛含量大約為3. 7-4%。NBF在常規組織保存中是常用的交聯固著劑。低於4%含量的福馬林溶液，例如，2%、1%甚至更低，被用來測試蛋白質交聯效果。更低的福馬林含量，產生更低的固著劑交聯或改變呈像，因此，交聯或分子修改水平是非常低的。在這裡發表的是一種在組織固著中通過減少固著劑濃度來控制和使交聯/修改水平標準化的一種方法。與NBF (例如，3. 7%-4%甲醛)相比，福馬林溶液在進入較低濃度的組織樣本的穿透能力更慢。不管怎樣，通過超聲波和/或其他方法減輕增加組織樣本可滲透性的困難，低甲醛濃度的固著溶液可以被使用，同時，更少有毒的甲醛廢料將被生產。由於更少的交聯和其他生物分子修改被形成，低甲醛濃度的溶液可以更大程度上的使生物分子從固著的組織樣本中恢復更便利，同時，在組織樣本中通過產生一個規則的交聯/修改水平的組織固著也更標準化。同時發表的是一種控制交聯/修改水平的方法，也可以說是，減緩組織自動降解，通過低溫在組織固著時間中。在低溫下，通過甲醛的生物分子交聯/修改變得緩慢，所以，一個統一的、適度的交聯/修改水平可以在組織樣本中很容易的被實現。由於酶活性在低溫中被大大的減少，缺血性的串聯和組織降解將會大大的減少。低溫(例如，0-25攝氏度，2-20攝氏度更好，最好是4-18攝氏度)可以被應用與整個固著步驟。它也可以應用於最先的滲透階段，即被接受加熱交聯階段。它甚至可以被應用於一連串的冷凍階段-加熱階段-冷凍階段，那裡第二冷的階段被用來停止或減緩在加熱階段的交聯速度。其他控制和使交聯/修改水平標準化的方法，是通過向固著溶液中添加猝熄(停止)試劑。
此外發表的是一個通過無論是交聯還是未交聯固著劑的固著程序都可以使兩階段程序便利。作為交聯固著劑，例如甲醛，這個發明關係到在低溫下的滲透過程，
可選擇性的接受被一個交聯階段在熱的或外界環境溫度在一個低溫，在缺血性串聯中大多數的酶的活性被抑制；在低溫下，交聯反映被抑制，甚至甲醛分子穿透整個組織樣本的滲透；在高溫下，交聯反應是快速的，反應時間可以在短時間被限制以促進交聯水平的標準化。交聯溫度和時間可以被調整來生產更好的交聯/修改水平。例如，組織樣本可以被NBF在4-10攝氏度下一整夜，通過或不通過超聲波照射固著，緊接著通過例行的脫水、清潔和石蠟注入，在一個組織自動處理機。在例行程序的室溫下固著組織樣本的組織樣本結果的細胞的和亞細胞的形態學沒有區別。然而，由於低水平的生物分子交聯和修改，生物分子取出和檢驗的有效性，同生物分子的質量和完整度，都顯著的改善。對於沒有交聯的固著，也被稱為凝結劑固著，例如醇類、酮、和其他以醇類和酮為基礎的固著劑，連同以鋅為基礎的固著劑，在低溫下，在缺血性串聯中大多數酶類的活性是被抑制的，因此，自溶在固著劑滲透進入組織中的過程中是被抑制的。 外部的力量，例如超聲波，被應用於克服，在低溫下，固著劑分子缺乏滲透進組織樣本的高效滲透能力，即在0-25攝氏度的範圍內，更好的在4-18攝氏度，為了縮短固著時間。由於超聲波在溶液和在溶液中的組織樣本中照射而產生的適度發熱，一個冷卻系統被需要來保持這個低溫。越強烈的超聲波照射，需要越強力的冷卻系統。超聲波照射可以在相對較低強度的冷卻系統下持續使用，或在相對較強的冷卻系統下脈衝使用。當固著劑分子在超聲波照射下進入組織樣本，冷卻系統可以關閉，然後，溶液和組織溫度被超聲波單獨或與其他加熱裝置結合提高(例如，微波加熱、紅外線加熱、電阻加熱和電子加熱)。超聲波使固著劑在低溫下滲透進組織樣本變的容易，同時，超聲波可以提升溫度為後面的交聯或組織樣本的分子凝結創造便利。在福馬林固著的例子中，建立一個低溫的滲透規程可以顯著減緩分子的改變，如同在滲透階段的交聯形成物一樣。一旦甲二醇分子均勻的滲透浸入組織樣本，它將有可能通過一套標準的時間和溫度使接下來的不同類型和尺寸的組織樣本的交聯反映更好的被控制。超聲波便利化的組織固著的新程序也許可以如下1)從病患身上移除後立即將組織樣本放入冷的固著劑中(或者非強制性的，放入一個特殊的US可穿透的容器，然後轉移至IJ) 一個有冷卻系統的超聲波裝置。這個組織樣本經過超聲波照射來提高當冷卻系統被打開來維持低溫時福馬林的滲透速度。2)從組織樣本中經過的聲音信號被收集和分析來監視滲透程度(非強制的)。3)當滲透完成，冷卻系統停止運作，超聲波繼續照射，或與其他加熱系統一起，使組織樣本的溫度提高到交聯溫度；4)從組織樣本中經過的聲音信號被收集和分析來監視交聯程度(非強制的)；5)當交聯完成，固定的組織樣本可以直接受超聲波便利化的接下來的程序(逐項工作流程)或降低溫度至4攝氏度來停止交聯程序，然後等待成批處理(常規工作程序)。在福馬林固著的例子中，滲透時間取決於組織厚度。當組織厚度薄於4mm時，低溫滲透時間應該在被超聲波照射的情況下被控制在60分鐘以內。為了保持低水平的交聯，固著程序應該被在(有或者沒有超聲波照射的)一個低溫的環境中實施。一個冷卻系統被用來疊加超聲波照射，當低溫和超聲波都被需要的時候。
當組織樣本厚於5mm時，在低溫下(比如4_15攝氏度)的固著滲透在超聲波照射下可能需要更長時間(超過2小時)，需要一個時間坡度來貫穿從滲透的低溫到交聯溫度(25-70攝氏度)。超過5_厚度的組織樣本所需要的時間坡度被設定在10分值至6小時以內。超聲波能力可以改變來調整溶液與組織樣本的熱傳遞。交聯溫度被設定在25-70攝氏度直接，40-60攝氏度之間更好，最好是在45-55攝氏度之間。交聯時間被設定在2_60分鐘，5-15分鐘更好。為了控制交聯/分子修改水平，化學試劑或一個額外的冷卻程序被用來阻止長時間的嘗嘗導致過交聯的交聯反應。因為由於不同的結構和內容所導致的不同組織類型性質的極大的反差，完成固著和處理程序的時間也各不相同。固著和處理時間也與處理組織樣本的厚度有緊密的聯繫，同試劑保存時間一樣。一個設定的時間意味著，固著或處理程序的持續時間是固定的，每一個特定的組織類型、厚度、保存試劑的溫度，和超聲波參數。根據我們的試驗，薄於3mm厚的組織樣本在4-15攝氏度在超聲波照射下的福馬林固著時間在10-20分鐘之間。脂肪樣本，例如體脂肪和乳腺，需要更長的固著時間。超聲波和溫度控制也可以被用於組織樣本保存的處理程序。由超聲波照射引起的 微型空洞導致立即的高壓和低壓在組織樣本中的折中。這個結果導致組織的乳化作用和排氣。超聲波也在照射下在溶液中產生強的對流，引起充分的溶液循環。當超聲波被應用時，沒有攪拌是被需要的。超聲波同時傳遞熱進入培養溶液，因而充當一個熱能資源。低壓和隨意的二選一的低或者高壓應用於固著劑和其他組織保存試劑，在提高組織固著和處理程序中有幫助。組織保存試劑包括固著試劑(固著劑)，脫水試劑(酒精，酮，等)，清潔試劑(二甲苯，二甲苯替代物)，和石蠟。代表性的，組織樣本固著在交聯固著劑中必須承受在酒精中脫水。這個發現表明，用超聲波來推動脫水程序。溫度在脫水程序中是一個重要因素。在脫水程序中溫度越高，所需時間越短，反之亦然。根據我們的試驗，當合適的溫度到達時，在脫水程序中的超聲波照射結果是最大限度利用的。為了脫水程序的快速實現，脫水溶液保存在低於脫水溶液的沸點0-25攝氏度，更好的是低於沸點5-10攝氏度。例如，當100%的乙醇(在標準大氣壓下的沸點是78. 4攝氏度)被用做脫水溶液，適宜的溫度是50-78攝氏度。一個在脫水程序中的超聲波照射的其他功能是保持溶液溫度，單獨的或與其他加熱裝置一起。不過，由於產生最佳形態的結果的中等溫度被需要，儘管處理時間可能延長。中等溫度指在4-50攝氏度的範圍內。超聲波照射可以在中等溫度下顯著縮短脫水程序。清潔是在酒精被清潔溶液(例如二甲苯或二甲苯替代物)代替情況下的組織處理中的一個程序。二甲苯和二甲苯替代物是蠟和石蠟的混合物。所以，清潔程序是為了下一個蠟滲透程序便利的步驟。清潔試劑也有移除組織脂肪部分的功能。這個發現表明使用結合溫度控制系統的超聲波可以提升清潔步驟的效率。超聲波在40-80攝氏度的範圍內被應用於清潔程序，0-15攝氏度更好，更好的是0-5攝氏度高於用作下一個滲透程序中的蠟熔點。有些研究者用二丙酮作為清潔溶劑。由於二丙酮在與蠟的混合中的缺乏性，它必須通過加熱或真空從蠟中濃縮。在這個發現中，我們揭露出超聲波被應用於使蠟中的二丙酮蒸發掉，通過它的排氣和加熱功能。首選的使二丙酮蒸發的超聲波照射的溫度範圍在低於它沸點(即在標準大氣壓下82. 3攝氏度)0-15攝氏度。在用凝結固著劑準備組織樣本的例子中，例如酒精，酮，含酒精或含酮為基礎的固著劑和其他非交聯固著劑，初始低溫是固著的首選。組織樣本被立即放在冷凍的固著劑中並保存在低溫下，直到超聲波照射開始是促進生物分子保存的首選。當非交聯固著劑被應用，由蛋白質交聯引起的組織外圍的非堅硬的外層將會形成。在低溫下的固著劑滲透將會使缺血性的串聯或組織樣本中的自動降解減慢。超聲波將會在冷卻系統關閉後被應用於提高和保持溶液溫度，單獨或與其他加熱裝置一起。根據我們的研究，無論有或者沒有應用超聲波，凝結固著劑在它們沸點以下0-20攝氏度工作最有效率。一個溫度坡度是需要的。自從在一個冷凍的溫度下，固著溶液最初滲透浸入組織樣本，在一個較少的液體狀況中組織結構的組織結構，可以引起強烈氣穴現象的低頻率的超聲波可以被使用。一旦組織樣本被固著完成，它們變得更加穩定，因此可以持續保持更強壯的氣穴現象。在這個發布的發明中，超聲波的頻率範圍是100 KHz至5 MHz, 200 KHz至2 MHz更好0. 4 MHz至1.5 MHz0超聲波動力的總功率範圍是0. I至100瓦，5至60瓦更好，最好的是在10至30瓦。這個發明也發布了一個組織樣本準備裝置，它包含了至少一個超聲波容器，至少一個超聲波產生和發出裝置，一系列組織固著和處理溶液，至少一個連接超聲波容器的冷 卻裝置。可選擇的組成部分包括，但不局限於，以下幾項乘裝冷固著劑的樣本器皿，一個充滿冷固著劑的乘裝樣本器皿的冷凍櫃，至少一個連結超聲波容器的加熱系統，至少一個聲音信號收集器，至少一個聲音信號分析儀，和一個中央處理器(CPU)。這個超聲波反應室是關鍵部件。除了乘裝溶液和樣本，他們也對向容器中的溶液和組織樣本傳遞的適當的超聲波能量的總額負責。我們的研究表明，超聲波在容器的溶液中的均勻分布對組織固著和處理的一致性很重要。從變頻器至容器中的溶液的能量傳遞的效率，機器效率和可靠性的一個重要因素，是視耦合效率而定的。我們首選的超聲波反映室將會由不鏽鋼或其他作為一整片的金屬合金製成，同時，變頻器依附在裝置外表面的底部。其他超聲波反應室的構造，包含一個金屬、塑料、玻璃或瓷製的用來乘裝固著劑或處理溶液的容器，和一個可以在有溶液的容器中可移動的變頻器外殼，這個變頻器外殼可以設定從一邊或從兩邊發出超聲波。這個變頻器外殼的功能是用來密封壓電式換能器，以防止保存反應物浸入到變頻器中。為了使超聲波從變頻器外殼的一邊發出，這個變頻器通過膠水粘合在外殼平坦的一面，同時這個變頻器的另一面是不受控制的。為了使超聲波可以從變頻器外殼的兩邊發出，這個變頻器可以通過澆水粘合在外殼平坦的雙邊，或自由的淹沒在外殼的惰性液體中。在這種情況下，超聲波是通過惰性液體和外殼平坦的雙邊傳遞，來保存組織反應試劑。如果超聲波從外殼的雙邊發出，組織樣本可以放置在變頻器外殼雙邊的任一邊上，雙倍數量的組織樣本可以被保存。在福馬林固著程序的一個具體體現中，低溫階段(0-15攝氏度)和高溫階段(35-75攝氏度)可以在相關首選溫度下的乘裝著固著劑的同一個超聲波反應器或兩個不同的超聲波反應器中工作。在一個體現中，真空可以應用在超聲波反應器的溶液和組織樣本中。真空可以由一個單獨的真空泵產生。一個適度的真空也可以由一個建在超聲波反應室中的活塞管結構產生。常規的實驗室冷卻系統包括冰箱、冷藏室或甚至冰和乾冰。我們用4攝氏度的冰箱、一個冰水池和一個-20攝氏度冷藏室來降低在超聲波反應室用穩定的50瓦電力輸出的超聲波照射的冷卻效果。溫度最終可以到達一個穩定的水平，但不可以由操作員控制。我們發布了一個溫度可調節的冷卻/加熱系統，並可以直接連接在超聲波反應室上。它將包含一個冷卻循環室(可調節溫度在-20至60攝氏度)和一個循環溫度連接裝置，例如一個銅管，用橡皮管或一個冷卻套管連接冷卻循環室。循環的液體可以是水、乙醇、氟利昂。加熱裝置也可以由一個圍繞在超聲波反應室周圍的加熱墊實現。確保固著和處理程序充分進行是非常重要的，尤其在快速程序中。因此，一個質量控制系統是被需要的。當超聲波應用於使固著和處理便利，從組織樣本固著和處理中反射和(或)傳導超聲波信號，可以提供信息來指示每一步驟的進展。一個適度複雜的聲音監控系統可以被建立。實例 實例I 我們在不同溫度下用NBF處理溶菌酶和BSA60分鐘，然後立即將交聯產物放到SDS凝膠劑上以備分離。對於溶菌酶和BSA的交聯水平在0-40攝氏度之間逐漸增加。SDS電泳顯示，低聚物(溶菌酶)或在膠化的流動性(BSA)的大小在50攝氏度有一個顯著的增長，在60攝氏度左右達到最大值。這個發現預示著在溫度高於60攝氏度下，用NBF處理溶菌酶時，很大數量的聚集開始形成。這個聚集是在高度存在於分子間的交聯溶菌酶分子中，並且可能不會被SDS電泳分離。沒有聚集的在高溫下在NBF被BSA觀察，或許正是由於在BSA中的交聯總是作用於分子內。至於溶菌酶，在溫度從0-20攝氏度提高到20-40攝氏度時交聯的速度逐步增快，然後接著被提高到50攝氏度甚至更高時突然加快速度。至於BSA，溫度從0-30攝氏度，交聯緩慢加速，然後在溫度到40攝氏度時突然加快速度。用這兩種典型的蛋白質做的試驗表明，福馬林固著的交聯形成率的加速與溫度的增加有關，而且速度的加速幅度可能可以根據培養溫度分成兩種模式1)在0攝氏度至40攝氏度時減緩加速幅度，和2)在40-100攝氏度時加快加速幅度。通過這兩種蛋白質，我們推測，在50-60攝氏度之間是交聯發生迅速，但可被控制的一個重要的溫度範圍。當溫度高於60攝氏度，通過溶菌酶的試驗表明，不溶的聚集體引起的分子間交聯開始大批量的形成。實例2
重要的交聯發生在在50攝氏度中培養10分鐘之後。在其他實驗中，我們為各種不同的蛋白質測試交聯形成物，在4攝氏度的福馬林、室溫，和在50攝氏度中培養10分鐘，與在室溫的福馬林中培養一整夜相比較。如圖表5所示，在4攝氏度下的交聯速度是所有蛋白質測試中最緩慢的。然後，在50攝氏度中培養10分鐘後的交聯水平有了一個較大的增長，幾乎可以與在室溫中培養一整夜的交聯水平相比較。對所有除了 BSA的蛋白質，蛋白質沉澱在50攝氏度中培養10分鐘後和在室溫中一整夜後形成。這個實驗表明，對於大多數蛋白質，在50攝氏度的福馬林中培養10分鐘就可以形成顯著的交聯形態。類似的結果也在5分鐘培養後獲得(材料沒有顯示出)。實例3
I-4mm厚的組織樣本被放置在組織存放盒中，然後被淹沒在交聯固著劑中(例如，福馬林，4攝氏度)直至超聲波照射。超聲波被應用於為固著劑的溫度單獨或與其他加熱裝置結合，提高溫度至50-80攝氏度。這個溫度需要維持5-20分鐘。這個組織樣本接著被放置在一個脫水劑中，例如，100%的乙醇。脫水劑的溫度需要被超聲波單獨或與其他加熱裝置結合來提高到50-75攝氏度。這個溫度需要通過超聲波單獨或與其他加熱裝置結合來維持5-30分鐘。這個步驟至少反覆進行I次。這個組織樣本接著被放置在一個清潔劑中，例如，二甲苯或二甲苯的替代物。清潔劑的溫度需要被超聲波單獨或與其他加熱裝置結合來提高到50-75攝氏度這個溫度需要通過超聲波單獨或與其他加熱裝置結合來維持5-30分鐘。這個步驟至少反覆進行I次。這個組織樣本然後被浸泡在溫度在55攝氏度至70攝氏度的融化的蠟或石蠟中。然後用超聲波對融化的蠟或石蠟照射5-30分鐘。融化的蠟或石蠟的溫度需要通過超聲波單獨或與其他加熱裝置結合來維持60-75攝氏度。實例4 1-4_厚的組織樣本，被保存在組織盒中，並在4-25攝氏度下，浸沒未交聯固著劑(例如，100%乙醇，丙酮，或者40%異丙酮、40%丙酮、20%聚乙二醇(平均分子量為300)和1% 二甲基硫氧化物(DMSO)的混合試劑)中。超聲波單獨或與其他加熱裝置結合用來使溫度達到50-70攝氏度。這個溫度需要維持5-20分鐘。脫水，清潔，蠟滲透步驟按照實例6中描述的執行。實例5
3mm或更薄的組織樣本，被保存在組織盒中，並在50-70攝氏度下浸沒在NBF中。超聲波單獨照射或與其他加熱裝置結合用來維持NBF的溫度5-15分鐘。脫水，清潔，蠟滲透步驟按照實例6中描述的執行。實例6
5mm或更厚的新鮮的組織樣本被浸沒在4-10攝氏度範圍的NBF中。超聲波作用於NBF。一個冷卻系統被用來冷卻NBF以維持4-10攝氏度的溫度。超聲波照射需要持續至少30分鐘。當冷卻系統完成。NBF的溫度將被持續的超聲波照射升高，直至55-80攝氏度。溫度將單獨被超聲波照射或與其他加熱設備結合維持10-30分鐘。實例I
我們在4攝氏度或室溫下，將新鮮的牛腎、肝、和胰組織(3mm*5mm*5mm)固定在福馬林中一整夜，然後將組織固定在自動組織處理器上。組織在4攝氏度下固著一整夜仍然保持新鮮，同時，組織在室溫下固著一整夜就變得色彩不純。FFPE石蠟塊上3微米的零件，被H&E玷汙，在顯微鏡下觀察。固著在4攝氏度下的組織樣本的細胞形態同更好的亞細胞資料一樣，通常會有明顯的、清晰的邊緣。低溫固著極大的降低了傳統的存在於組織例行的固著程序的空泡形成。紅血球的細胞溶解在低溫的組織固著中也有減少。這兩種固著方法中最突出的區別在胰樣本中得到論證。胰樣本在室溫的福馬林中固著一整夜，在細胞群中的蜂窩結構中顯示出公開的毀滅。不管這兒是否有由於低溫而產生的蜂窩狀的或細胞內縮水，單位數量的大量的原子核和原子核大小都將準備被分析。數量上計算的結果顯示沒有由於低溫而造成的可發覺的改變，相反的，較早前的一個肝組織在4攝氏度的福馬林中固著一整夜的研究產生了組織縮水[Fox 1987]。人類卵巢癌的組織樣本試驗，也表現出在4攝氏度的福馬林中固著比那些傳統的室溫的方式能產生更好的形態學結構。
實例8
我們用人體卵巢和肝臟組織研究US在一個冷凍的溫度下提升福馬林分子在組織樣本中擴散的效果。固著在4攝氏度下18個小時比在US下固著在8攝氏度下5分鐘，產生更好的形態容貌，比在室溫下固著18個小時更好。人體肝臟樣本(3mm厚)被在US照射下固著在4攝氏度的福馬林中30分鐘。作為控制，同樣大小的肝臟樣本被固定在4攝氏度的福馬林中30分鐘 ，但沒有US照射。有US照射的肝臟樣本顯示出更好的組織形態，同時沒有US照射的肝臟樣本顯示出嚴重的完整紅血球細胞和詳細亞細胞結構的缺失。隨後通過正常的酒精脫水，二甲苯清潔和石蠟填充的處理，沒有US照射的組織固著在4攝氏度的福馬林中30分鐘，產生酒精固著形態，同時用US照射組織固著在4攝氏度的福馬林中30分鐘產生極佳的福馬林固著形態。實例9
母牛腎臟組織(3mm厚)用US(US-LT-FFPE)照射或在室溫中一整夜(FFPE)，用4攝氏度的福馬林固著30分鐘，然後將組織放在自動組織處理器上處理。在沒有抗原檢索(AR)程序下，波形蛋白和細胞角蛋白的IHC被取出。在IHC分析和用超聲波照射固著的樣本都比常規的FFPE樣本產生更好的結果。IHC在US-LT-FFPE下的正染色區域的百分率指出，與傳統FFPE方法相比，更多抗原決定基(抗原決定簇)被保護。從組織樣本萃取的蛋白質也表現出US使固著在4攝氏度下的波形蛋白和細胞角蛋白的結果比傳統的FFPE蛋白質印跡顯示出更強的信號。這個材料指出，在US-LT-FFPE組織樣本中的抗原，比由於減少的交聯水平的傳統方法相當，被改進成一個較小程度、更多可用性的IHC檢測和提取。實例10
為了研究US是否可以減輕福馬林固著大型組織的困難，我們將一個人體解剖下的整個前列腺樣本保存在福馬林中，並用US在10攝氏度下照射16小時和在25攝氏度下照射2小時。作為對比，一個外科手術移除的病患的整個前列腺樣本被在室溫的福馬林中保存。在18小時的保存後，通過US方式固著的前列腺組織樣本依然看起來很新鮮，血、脂肪和被膜組織都維持他們原本的外貌。通過傳統方法固著一整夜的前列腺樣本看起來變的很暗淡。我們用自己的手指觸碰來大致判斷這兩個前列腺組織的硬度。用US方式保存的前列腺組織比用傳統方式保存的更結實。經過一整夜的保存後，這兩個前列腺樣本都經過MRI檢測。通過US方式保存的前列腺樣本在每個標準選擇的邊緣和中心區域都產生更深的、更均勻的圖像，同時傳統方式保存的前列腺產生在中心區域的分散亮點的不規則的圖像。MRI成像中的深色區域意味著組織樣本的稠密區域[Hennig 1986]。由福馬林引起的交聯在組織樣本中產生一個密集的變化，可以由MRI現實出來。實例11
我們已經設計了一系列的直接的生物化學試驗方法來比較不同化學試劑，例如福馬林，RNA Later,甲醇/酒精，例如用於抑制核糖核酸酶生物活性的加熱設備(沸騰的或高壓蒸汽的)。這個研究直接反映出福馬林是最好的核糖核酸酶抑制者。我們也對比了福馬林在室溫和4攝氏度下的抑制能力。在這個對比實驗中，我們沒有找到任何區別。這個試驗結果說明，福馬林對在4攝氏度下的核糖核酸酶活性的立即抑制力不是取決於緩慢的交聯作用。這是在無拘束溶液反應下的原始資料，然而，RNA的冷福馬林的組織水平保存應該被更深入的研究。根據細胞蛋白質和核糖核酸酶的實驗結果，我們建議，低溫的福馬林固著可以實現相似的酶抑制作用能力，它可以維持生物分子在一個低變化的水平(低水平的交聯)。實例12
為了做一個粗略的在4攝氏度和室溫下樣品固著的蛋白質取出的對比試驗，我們用培養的細胞做了個用蛋白質印跡法測量2種特定的蛋白質的時間過程的研究。福馬林分子進入培養細胞的擴散時間是可以被忽視的，既然這樣，溫育時間可以更好的代表交聯時間。部分新鮮的成熟的乳癌T47D細胞，在4攝氏度或室溫下，用不同的持續時間，用中性的緩衝福馬林(NBF)保存。在細胞溶解產物中的蛋白質被SDS PAGE隔斷，然後轉移到硝酸纖維薄膜，用合併的單克隆抗體類探測，依照HER-2和ER，一個膜蛋白質和一個核內蛋白，分別地。考馬斯藍染色的SDS凝膠表現出，細胞在4攝氏度下固著比 在室溫下產生更多蛋白質溶解物，(在O. 5-18小時中始終都是)。蛋白質印跡表現出，HER-2和ER蛋白質在4攝氏度的固著條件下，相似的信號強度需要O. 5-4小時的固著時間才能被製造出來，與此同時，在室溫下，只要O. 5小時的固著時間，就能產生這兩種蛋白質的清晰的信號。顯著的，我們發現，就蛋白質提取物而言，室溫下固著O. 5個小時大致上等同於在4攝氏度下固著18個小時。
權利要求
1.一種保存組織樣本的方法，其特徵在於，其包括如下步驟 a)將組織樣本浸入0-25攝氏度的固著劑中； b)將所述組織樣本和固著劑放入一個冷卻機器中； c)將所述組織樣本和固著劑放入一個傳送機器中。
2.根據權利要求I中的方法，其特徵在於，所述固著劑包括1%_10%重量的福馬林水溶液，所述溫度是在4-20攝氏度，較佳地是在4-18攝氏度。
3.根據權利要求I中的方法，其特徵在於，所述固著劑包括至少50%容量的至少含以下化學藥品中的一種化學物質的溶液乙醇、甲醇、PEG、丙酮；所述溫度是在4-25攝氏度，較佳地是在4-18攝氏度。
4.根據權利要求I中的方法，其特徵在於，所述傳送機器是指超聲波放射。
5.根據權利要求4中的方法，其特徵在於，所述超聲波是O.I MHz到5 MHz頻率，較佳地在O. 2 MHz至2 MHz，更佳地在O. 4 MHz至I. 5 MHz之間。
6.根據權利要求5中的方法，其特徵在於，所述超聲波的電力是在I到100瓦之間的，較佳地在5-50瓦，更佳地在10-30瓦。
7.根據權利要求6中的方法，其特徵在於，所述方法進一步的包括至少一個將固著的組織樣本浸入一個溫度在0-25攝氏度的脫水溶劑中的脫水程序。
8.根據權利要求6中的方法，其特徵在於，所述方法進一步的包括如下步驟 a)關掉之前所說的冷卻裝置一個預先設定的時間；b)持續超聲波照射以增加之前提到的組織樣本到一個預先設定的溫度；c)轉換超聲波照射開關來維持預先設定的溫度數值並保持預先設定的時間。
9.根據權利要求6中的方法，其特徵在於，所述方法進一步的包括至少一個乾燥步驟，其包括i)將固著的組織樣本浸入一個溫度在0-40攝氏度的脫水溶液中，ii)單獨用超聲波放射或與其他加熱設備結合，來提高脫水溶液的溫度至一個預先設定的值，然後iii)保持這個溫度一定預先設定的時間； 至少一個清潔步驟，其包括i)將脫水的組織樣本浸入一個清潔溶液，ii)單獨用超聲波放射或與其他加熱設備結合，來提高清潔溶液的溫度至一個預先設定的值，然後iii)保持這個溫度一定預先設定的時間； 以及一個浸透步驟，其包括i)將脫水的、清潔的組織樣本浸入融化的石蠟中；ii)用超聲波照射上述在融化的石蠟中的已脫水的、已乾燥的組織樣本一定預設的時間，然後，iii)將上述在融化的石蠟中的已脫水的、已乾燥的組織樣本進行真空。
10.根據權利要求I中的方法，其特徵在於，其中所述傳送機器是通過攪拌、震動或抽吸和抽空進行的。
11.根據權利要求I中的方法，其特徵在於，所述方法進一步包括使所述組織樣本和固著劑減壓，所述低壓指在10-20英寸貢的範圍內。
12.根據權利要求I中的方法，其特徵在於，所述方法進一步包括使所述組織樣本和固著劑增壓，所述高壓是指超過標準大氣壓。
13.根據權利要求I中的方法，其特徵在於，所述方法進一步包括所述組織樣本和固著劑在高壓和低壓中不停交替。
14.一種在超聲波領域保存組織樣本的裝置，其特徵在於，其包括1)至少一陳放組織樣本和保存反應試劑的容器； 2)一在反應實際中產生超聲波的超聲波發電系統； 3)—在上述容器中維持特定溫度的溫度控制系統。
15.根據權利要求14中的裝置，其特徵在於，所述超聲波發電系統所提供的超聲波信號包括1)頻率在O. I MHz - 5 MHz，較佳地在O. 2 MHz - 2 MHz以內，更佳地在O. 4 MHz-I. 5 MHz ；2)電力在O. I至100瓦，較佳地在5_50瓦，更佳地在10-30瓦。
16.根據權利要求15中的裝置，其特徵在於，所述超聲波發電系統包含至少一個壓電式換能器，所述壓電式換能器以圓盤、矩形、圓柱體或一群多種多樣的變頻器的形式存在。
17.根據權利要求16中的裝置，其特徵在於，所述壓電式換能器是用膠水粘合附著於容器表面或者底部的。
18.根據權利要求16中的裝置，其特徵在於，所述壓電式換能器是被變頻器外殼封住的。
19.根據權利要求18中的裝置，其特徵在於，所述變頻器外殼是淹沒在所說的組織保存反應物中的。
20.根據權利要求18中的裝置，其特徵在於，所述超聲波是由從所述變頻器外殼至被放置在所述變頻器外殼同一邊的組織樣本產生超聲波並發射的。
21.根據權利要求18中的裝置，其特徵在於，所述超聲波是從所述變頻器外殼兩邊至被放置在變頻器外殼兩邊的組織樣本產生超聲波並發射的。
22.根據權利要求15中的裝置，其特徵在於，所述超聲波發電系統可以利用穩定的或掃描頻率產生持續的或脈衝超聲波。
23.根據權利要求14中的裝置，其特徵在於，所述容器包含一個邊牆，一個可拆分的蓋子，一個可配合水密度在邊牆上移動的底座；所述可移動的底座是跟一個輪轉引擎相連的；所述輪轉引擎可以迫使可移動的底座來回的移動。
24.根據權利要求14中的裝置，其特徵在於，所述容器包含一個邊牆，一個底座，和一個可移動的蓋子；所述可移動的蓋子可配合水密度在邊牆上，並且與一個輪轉引擎相連；所述輪轉引擎可以迫使可移動的蓋子來回的移動。
25.根據權利要求14中的裝置，其特徵在於，所述溫度控制系統可以包含一個冷卻裝置和一個加熱裝置。
26.根據權利要求24中的裝置，其特徵在於，所述冷卻裝置是通過冷卻液循環所說的容器空間；所述空間是在容器的外部表面和容器外殼表面直接的空間；所述冷卻液的溫度在-20攝氏度至25攝氏度。
27.根據權利要求24中的裝置，其特徵在於，所述冷卻裝置通過一個管道循環冷卻液經過所說的組織反應試劑。
28.根據權利要求24中的裝置，其特徵在於，所述冷卻裝置是一個半導體裝置。
29.根據權利要求24中的裝置，其特徵在於，所述加熱裝置是單獨由超聲波照射或由電阻加熱或微波加熱相結。
全文摘要
本發明公開了通過超聲波及溫度控制的標準化組織樣本方法及其裝置，其包括在冰冷固著劑中存放組織樣本，在冷凍的溫度下讓固著劑穿透，和利用超聲波加速固著劑穿透。同時說明了超聲波的用途和在脫水、清潔和注入步驟中溫度控制的用途。
文檔編號C12M1/42GK102781226SQ201080055103
公開日2012年11月14日 申請日期2010年12月1日 優先權日2009年12月7日
發明者朱偉星 申請人:朱偉星