一種蟾毒配基提取物及其製備方法與應用的製作方法
2023-11-11 04:26:27
專利名稱：一種蟾毒配基提取物及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從蟾皮或蟾酥中提取得到的蟾毒配基提取物及其製備方法與應用。
背景技術：
蟾蜍屬動物有250多種，分布於世界各地。我國有近10種，主要分布的3種分別是大 蟾蜍華西亞種(5<o Zw/o am/mw/ Schmidt)、大蟾蜍中華亞種(5w/o 6w/o gwga^/z"ra' Cantor) 以及黑眶蟾蜍(5^/0 we/a朋幼'to Schneider)。蟾蜍之名首載於《名醫別錄》，早在《神農本草經》
就載有"蝦蟆"的性味與主治。《本草蒙筌》"味辛、氣涼、微毒"，《本草再新》入心、肝、
脾、肺四經。古今驗方廣泛應用蟾蜍拔毒消腫、定痛殺蟲、強心利尿。
以蟾蜍為基原的常用中藥材有蟾酥、蟾皮、幹蟾，其化學成分相當複雜，按溶解性可分
為脂溶性甾族類(蟾毒配基類、蟾蜍毒素類)、水溶性吲哚生物鹼類(如5-羥色胺，蟾蜍色胺、
蟾蜍噻療等)。
蟾毒配基屬乙型強心甾族類化合物，在Cn上接有一個A-吡喃酮基，又名蟾蜍二烯類酯 (Bufodienolide),主要存在於蟾蜍耳後腺及皮膚腺的分泌物中，現已知有20餘種，例如蟾毒 靈(bufalin)、日蟾毒它靈(gamabufotalin)、蟾毒它靈(bufotalin)、華蟾毒精(cinobufagin)、脂蟾 毒配基(resibufogenin)等江成亮、竺葉青，蟾蜍抗腫瘤作用研究進展，天然產物研究與開發， 2000.12 (1)， 67 72。
已經有大量文獻報導華蟾毒精、蟾毒靈、脂蟾毒配基等具有強心、抗腫瘤等作用森下 倍一，華蟾毒配基及含蟾酥製劑等對開胸豚鼠的強心作用，國外醫學.中醫中藥分冊，1987， 9(2): 42; JingYetal， Selective inhibitory effect of bufalin on growth of human tumor invitro: association with the induction of apotosis in leukemia HL-60 Cell.Jpn丄CancerRes.1994， 85: 645; 王傳社，李燕燕等，脂蟾毒配基對人宮頸癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用，北京中醫藥大學學 報，2006.29 (3): 184-187;金向群，蟾蜍化學與藥理作用的研究進展，中草藥，1996.27 (4): 246-248
然而，目前的蟾蜍製劑，例如蟾酥鎮痛膏、蟾酥注射液、華蟾素注射液和複方蟾皮膠囊 等都仍然是以粗提取物入藥，成分極為複雜，除含有蟾毒配基、蟾蜍毒素、B引哚類生物鹼(如 5-羥色胺，蟾蜍色胺、蟾蜍噻嚀等)外，還含有胺基酸、還原糖、甾類、肽類等多種類型的
化學成分。因此，在臨床使用中，蟾蜍製劑具有以下兩個主要缺點①對腫瘤細胞的殺傷率 低，②出現過敏反應，血管刺激症狀，消化道和心臟毒性等不良反應的發生率高，這都是由 於未能去除無效、不良反應成分，未能對真正的有效的成份進行控制造成的。
本申請人經過深入研究，從蟾蜍中提取分離得到一種蟾毒配基提取物，其提取方法簡單 方便、適合於工業化生產，該提取物的抗腫瘤活性明顯增強，克服了蟾蜍製劑存在的缺陷。
發明內容
本發明提供了一種蟾毒配基提取物，蟾毒配基(以華蟾毒精計)在該提取物中的重量百 分含量為55%-100%，優選為80%-100%，更優選為90%-100%。
所說的蟾毒配基中含有華蟾毒精、脂蟾毒配基，其在該提取物中的重量百分含量分別為 15%~25%。
蟾毒配基中還含有沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈和蟾毒靈等。
蟾毒配基提取物的含量可以採用常規的測定方法，但是優選本發明所提供的方法以華
蟾毒精(或脂蟾毒配基)計，用紫外分光光度法，在300nM下進行測定。或以華蟾毒精及脂蟾 毒配基為對照品，用HPLC法測定(用十八垸基矽烷鍵合矽膠為填充劑；0.5%磷酸二氫鉀溶液 -乙腈(50: 50)為流動相；檢測波長為296nm;柱溫4(TC)，面積歸一化法計算含量。
本發明還提供了蟾毒配基提取物的製備方法蟾酥、蟾皮或幹蟾用乙醇提取，回收乙醇
後濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的醇洗脫，再用高濃度的醇洗脫，收集洗脫液，減 壓回收溶劑，乾燥後或經萃取後即得。
其中所說的低濃度乙醇是指10-50%的乙醇，優選為30-40%;所說的高濃度乙醇是指 60-100%的乙醇，優選為70-100%。
其中所說的大孔樹脂可以選擇非極性或者極性大孔樹脂，所說的非極性大孔樹脂可以選 自HPD-IOO、 700， AB誦8， DlOl， X-5， D4020等;極性大孔樹脂可以選自HPD400、 450、 600、 HPD800, S-8， NAK-9等。其中優選HPD-IOO、 AB-8。
蟾毒配基提取物最優選的製備方法為取乾燥蟾酥用95%的乙醇提取2次，用醇量為10 倍，每次提取的時間為90分鐘，合併濾液，濾液減壓回收乙醇至無醇味，上HPD-100大孔 樹脂柱，先用水洗脫，再用40%乙醇洗脫，再用95%的乙醇洗脫，收集後者，減壓回收溶劑， 乾燥即得。
本發明還提供了以蟾毒配基提取物作為活性成分的藥物組合物。
本發明提供了蟾毒配基提取物對腫瘤細胞的抑制作用，以及在製備治療抗腫瘤藥物中的應用。
本發明所提供的蟾毒配基提取物可以以口服或非口服形式給藥，單元劑量0.01-200mg， 優選為0.05-100mg，更優選為0.1-20mg，給藥量因藥物不同而各有不同。
經口服給藥時，可以與常規的藥用輔料如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、包衣劑等
混合，將其製成顆粒劑、膠囊、軟膠囊、片劑、滴丸或乳劑等形式給藥。非口服形式給藥時， 可以製備成注射液、凍乾粉針劑、輸液劑等。製備上述製劑時，可使用常規的製劑技術，但 優選本發明所提供的方法。
具體實施例方式
以下實施例更詳細地說明本發明，但不以任何形式限制本發明。 實施例一蟾毒配基提取物的製備
取乾燥蟾皮10kg用80%的乙醇提取4次，用醇量為9倍，每次提取的時間為120分鐘， 合併濾液，濾液減壓回收乙醇至無醇味，上AB-8大孔樹脂柱(天津南開大學化工廠生產)， 先用水洗脫，再用30%乙醇洗脫，再用80%的乙醇洗脫，收集後者，減壓回收溶劑，水溶液 先以乙酸乙酯等量萃取2次，乙酸乙酯層減壓回收溶劑，乾燥得到蟾皮提取物42g，蟾毒配 基的含量為55.3%，其中含華蟾毒精15.1%，含脂蟾毒配基15.8%。 實施例二蟾毒配基提取物的製備
取乾燥蟾酥lkg用80%的乙醇提取4次，用醇量為9倍，每次提取的時間為120分鐘， 合併濾液，濾液減壓回收乙醇至無醇味，上AB-8大孔樹脂柱(天津南開大學化工廠生產)， 先用水洗脫，再用30%乙醇洗脫，再用80%的乙醇洗脫，收集後者，減壓回收溶劑，千燥得 到蟾毒配基提取物172g，以華蟾毒精計，蟾毒配基的含量為70.3%，其中含華蟾毒精20.1%， 含脂蟾毒配基17.8%。 實施例三蟾毒配基提取物的製備
取乾燥蟾酥2kg用95%的乙醇提取2次，用醇量為10倍，每次提取的時間為90分鐘， 合併濾液，濾液減壓回收乙醇至無醇味，上AB-8 (天津南開大學化工廠生產)大孔樹脂柱， 先用水洗脫，再用40%乙醇洗脫，再用95%的乙醇洗脫，收集後者，減壓回收溶劑，乾燥得 到蟾毒配基提取物332 g，以華蟾毒精計，蟾毒配基的含量為85.6%，其中含華蟾毒精21.4%， 含脂蟾毒配基20.3%。 實施例四蟾毒配基提取物的製備
取乾燥蟾酥2kg用95%的乙醇提取2次，用醇量為10倍，每次提取的時間為90分鐘， 合併濾液，濾液減壓回收乙醇至無醇味，上HPD-100大孔樹脂柱(滄州寶恩化工有限公司生 產)，先用水洗脫，再用40%乙醇洗脫，再用95%的乙醇洗脫，收集後者，減壓回收溶劑， 乾燥得到蟾毒配基提取物332g，以華蟾毒精計，蟾毒配基的含量為90.6%，其中含華蟾毒精 22.3%,含脂蟾毒配基21.5%。 實施例五蟾毒配基提取物乳劑的製備
將實施例四製備得到的蟾毒配基提取物0.5 g、 200g大豆油、100g大豆磷脂、2g等滲劑 等混合，加熱至60 8(TC，全部溶融，加入高速搗碎機中，同時加入適量的水，高速攪拌3 分鐘以上，反覆3次以上，直到得到均勻的乳劑。 實施例六蟾毒配基提取物滴丸的製備
稱取處方量的880g聚乙二醇-6000在85T: 95T:下熔融，緩慢加入實施例四製備得到的蟾 毒配基提取物lg攪拌，依次加入15g硬脂酸、4.5g吐溫-80、 0.5g亞硫酸鈉、充分攪拌均勻 後，將混合在75 85"C恆溫條件下滴入液體石蠟冷卻液中冷凝成丸，再用毛邊紙吸去多餘的 石蠟即得。
實施例七蟾毒配基提取物軟膠囊的製備
稱取200g氫化棕櫚油，加入到1300g藥用豆油中，加熱混勻，製得軟膠囊基質，將lg 實施例四製備得到的蟾毒配基提取物加入到基質中，攪拌均勻，膠體磨研磨，製得軟膠囊內
容物。按明膠甘油水(l: 0.3: l)制膠，採用軟膠囊機壓丸，製得1000粒軟膠囊。 實施例八蟾毒配基提取物片劑的製備
稱取實施例四製備得到的蟾毒配基提取物lg， 100g澱粉，40g預膠化澱粉、9g羧甲基澱 粉鈉，充分混合均勻，過80目篩，加入95%乙醇適量製成軟材，12目制粒，60。C乾燥3小 時，12目篩整粒，加入顆粒總重0.3%的硬脂酸鎂，調整片重約150mg，壓片，共製得IOOO 片。
實施例九蟾毒配基提取物膠囊的製備
稱取實施例四製備得到的蟾毒配基提取物lg，澱粉50g，糊精49g，充分混合均勻，過 80目篩，用95%乙醇制粒，過12目篩，填充於l號膠囊中，共製得1000粒。
試驗例l.蟾毒配基提取物對S畫C-7721和ECV304及對高轉移人源乳腺癌細胞MDA-MB435s、 MDA-MB468、 MDA-MB231的細胞毒活性
材料實施例四製備得到的蟾毒配基提取物
華蟾素注射液安徽金蟾生化股份有限公司
本實驗選用SMMC-7721和ECV304及高轉移人源乳腺癌細胞MDA-MB435s 、 MDA-MB468、 MDA-MB231腫瘤細胞，採用噻唑藍還原法(MTT)，對蟾蜍提取物的細胞毒活 性進行了研究。
按文獻方法沈玲玲，等.貝葉多孔菌提取物對小鼠移植現代應用藥學，1994， 11(4): 9-10，取對數生長的細胞2-2.5 X105/mL，放入96孔板，每孔0.2mL，設鹽水對照組，溶劑
對照組和不同濃度的實驗組，以及華蟾素注射液陽性對照組，每組設3~5個平行孔。實驗組 分別加入不同濃度的藥物2u L，對照組和溶劑對照組分別加入等量的生理鹽水和DMS，而 陽性對照組加入不同濃度的華蟾素注射液2uL。 37'C溫箱孵育45h後，各孔加入10uL的 MTT液(10mg/mL)，繼續培養至48h，吸去上清後加入DMSO 100 w L，待結晶溶解後，即用 酶標儀在570 nm波長測量各孔的OD值，計算細胞生長抑制率。結果見表l，利用學生t測 驗進行組間比較。
從表1數據可知，蟾毒配基提取物對SMMC-7721，ECV304，MDA-MB435s、MDA-MB468、 MDA-MB231腫瘤細胞均有明顯的抑制活性，且抑制強度均遠遠強於華蟾素注射液。
表l蟾毒配基提取物的體外細胞毒作用(wg/ml)
名稱SMMC-7721ECV304435s468231
華蟾素注射液(wg/mL)115.6132.578.4109.7122.3
蟾毒配基提取物(yg/mL)10.811.415.113.620.1
試驗例2 口服蟾蜍配基提取物對腫瘤的抑制作用
材料NIH小鼠，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供
實施例四製備得到的蟾毒配基提取物
華蟾素注射液安徽金蟾生化股份有限公司
本實驗選用NIH小鼠，採用經典的抗腫瘤藥物初篩模型，對蟾毒配基提取物對小鼠移植 肉瘤S180生長的抑制作用及其對荷瘤小鼠壽命的影響進行了研究。
NIH性成熟雄性小鼠120隻，分別按常規方法接種S180肉瘤細胞徐叔雲，等。藥理實 驗方法學(第二版)北京人民衛生出版社，1991， 1423。瘤齡10d的瘤源小鼠拉斷脊椎處死， 無菌剖取瘤塊，取粉紅色瘤組織部位，用滅菌生理鹽水滅菌製成勻漿，調成lXl(^個/mL濃 度的瘤細胞懸液，拌種於實驗小鼠右前肢腋下皮下，0.2mL/只。NIH小鼠分別按體重隨機分 組。按劑量給藥。第1批小鼠於實驗結束時拉斷脊椎處死，完整剝離瘤體，觀察瘤體形態及 出血壞死情況，稱量瘤重，計算各組平均瘤重及平均抑瘤率。第2批小鼠接種後按同樣方法 給藥，標準條件餵養，任其生長，記錄每隻小鼠的死亡時間，計算存活時間和壽命延長率。 結果見表2，表3，利用學生t測驗進行組間比較。
結果表明，0.1 20mg/kg蟾毒配基提取物灌胃給藥，對小鼠移植肉瘤S180有顯著抑制作 用，能夠延長S180荷瘤小鼠的壽命，且有一定的量效關係，其作用強度比華蟾素注射液強。
表2.蟾毒配基提取物對小鼠移植肉瘤S180的抑制作用(7 ±s, n-lO) 組別 劑量(mg/kg) 瘤重(g) 抑瘤率(%)
模型 一 2. 73 ±1.79 華蟾素注射液(高)2001.45 ±0.45**46. 9
華蟾素注射液(中)201. 77±0. 48*35.2
華蟾素注射液(低)22. 32±0. 41*15. 0
蟾毒配基提取物(高)201.09±0. 50**60. 1
蟾毒配基提取物(中)21.41±0. 34"48. 3
蟾毒配基提取物(低)0. L1. 81 ±0. 38*33. 7
與模型組比較'，P<0.05;**， P<0. 01
表3.蟾毒配基提取物對小鼠壽命的影響(7±s，n=12)
組別齊慢(mg/kg)平均生存時間(d)壽命延長率tt)
模型—25.4±4. 7
華蟾素注射液(高)20036. 3±3. 2M42.9
華蟾素注射液(中)2033. 9 ±3. 4**33. 4
華蟾素注射液(低)228. 7±4. 413.0
蟾毒配基提取物(高)2034. 7 ±4. 4"36. 6
蟾毒配基提取物(中)230. 6±3. 7*20.5
蟾毒配基提取物(低)0. 125. 7±4. 91. 2
與模型組比較'，P<0. 05; "， P<0.0權利要求
1、一種蟾毒配基提取物，其特徵在於以華蟾毒精計，蟾毒配基的重量百分含量為55％-100％。
2、 根據權利要求1所述的蟾毒配基提取物，其特徵在於以華蟾毒精計，蟾毒配基的重量百分 含量為80%-100%。
3、 根據權利要求1所述的蟾毒配基提取物，其特徵在於以華蟾毒精計，蟾毒配基的重量百分 含量為90%-100%。
4、 根據權利要求l-3所述的蟾毒配基提取物，其特徵在於含有華蟾毒精和脂蟾毒配基，其重 量百分含量分別為15%~25%。
5、 根據權利要求l-4所述蟾毒配基提取物的製備方法，其特徵在於包括如下歩驟蟾酥、蟾 皮或幹蟾用乙醇提取，回收乙醇後濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的醇洗脫，再用 高濃度的醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，乾燥後或經萃取後即得。
6、 根據權利要求5所述蟾毒配基提取物的製備方法，其特徵在於其中所說的低濃度乙醇是指 10-50%的乙醇，高濃度乙醇是指60-100%的乙醇。
7、 根據權利要求6所述蟾毒配基提取物的製備方法，其特徵在於其中所說的低濃度乙醇是指 30-40%的乙醇，高濃度乙醇是指70-100%的乙醇。
8、 根據權利要求5-7所述蟾毒配基提取物的製備方法，其特徵在於其中所說的大孔樹脂可以 選擇非極性或者極性大孔樹脂，所說的非極性大孔樹脂可以選自HPD-100、 700， AB-8， D101， X-5， D4020;極性大孔樹脂可以選自HPD400、 450、 600、 HPD800, S-8， NAK-9。
9、 根據權利要求8所述蟾毒配基提取物的製備方法，其特徵在於其中所說的大孔樹脂為 HPD掘、AB-8。
10、 根據權利要求l-4所述蟾蜍提取物對腫瘤細胞的抑制作用，以及在製備治療抗腫瘤藥物 中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種從蟾皮或蟾酥中提取得到的蟾毒配基提取物，其中蟾毒配基(以華蟾毒精計)重量百分含量可達55％以上。其提取方法為蟾酥、蟾皮或幹蟾用乙醇提取，回收乙醇後濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的醇洗脫，再用高濃度的醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，乾燥後或經萃取後即得。本發明還提供了以該提取物作為活性成分的藥物組合物，以及該類提取物抑制腫瘤細胞活性的作用和在製備抗腫瘤藥物中的應用。
文檔編號A61K35/56GK101176739SQ20061007010
公開日2008年5月14日 申請日期2006年11月8日 優先權日2006年11月8日
發明者傑 何, 姜永濤, 英 張, 邱鷹昆, 陳繼永 申請人:山東綠葉製藥有限公司