玉米品種中糯1號純度檢測試劑盒的製作方法
2023-12-08 13:28:01 1
專利名稱：玉米品種中糯1號純度檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用SSR技術進行玉米品種純度檢測的專用試劑盒。
背景技術：
對當前推廣面積較大的玉米品種中糯1號的純度檢測目前主要有田間形態鑑定、同工酶鑑定及RAPD鑑定，但形態鑑定昂貴、耗時和工作量大；同工酶鑑定需要種子發芽，且具有組織特異性，故費時費力，準確度不高；RAPD技術雖已篩選出若干引物，但穩定性差。SSR技術具有多態性豐富、準確可靠、簡單快速、易於自動化的優點，成為玉米品種純度鑑定首選技術之一。然而由於該技術出現較晚，在中糯1號純度檢測上尚未應用。
為了克服現有檢測方法費時費力、穩定性差的不足，本發明在SSR技術的基礎上，開發了一套適於中糯1號純度檢測的試劑盒產品，利用該產品不僅檢測結果穩定可靠，而且操作簡單方便。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是首先從DNA提取、PCR擴增、電泳檢測等環節對現有SSR技術進行了優化，建立了一套快速準確的適於玉米純度檢測的SSR操作程序如下(1)DNA提取採用郭景倫等[1]的玉米單粒種子DNA快速提取法並加以改進將單粒幹種子的胚剝下，放入1.5ml離心管中，加入300μl氯仿後研磨，然後加入300μl DNA提取液(100mM Tris-HCl，100mM EDTA 8.0，500mM NaCl，1.5％SDS)混勻後於10000r/min離心2min，吸上清液加入預先裝有300μl異丙醇和300μl NaCl(500mM)的1.5ml離心管中，等DNA成團後用滅菌槍尖挑出，經70％乙醇洗滌後加入200μl TE 8.0，待充分溶解後備用。改進後提取的DNA質量提高。該方法比常規的液氮提取法簡單快速。(2)SSR擴增反應體系20μl反應液中包括10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，0.001％Gelatin，2.5mmol/L MgCl2，0.16mmol/L 4dNTP，0.25μmol/L SSR引物，1單位Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板。
反應程序94℃預變性5min，一個循環；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35個循環。PCR擴增儀上進行擴增。(3)電泳PCR產物變性後在4.5％測序膠上分離。預電泳85W，20min；電泳80W，40min。與其它電泳方法相比，使用測序膠電泳時間短，解析度高。(4)銀染檢測10％冰醋酸固定3min；雙蒸水快速漂洗1次，不超過10s；0.2％AgNO3溶液染色5min；顯影液(3％NaOH，0.5％甲醛)顯影；10％冰醋酸定影。該銀染法僅需約15分鐘，而一般銀染法需約1.5小時。
其次篩選中糯1號純度鑑定的特徵引物適用於玉米品種純度鑑定的SSR引物應具有以下兩個特徵①引物本身多態性信息量要高，從而具有較強的鑑別雜株的能力；②在玉米雜交種及其雙親間表現多態性，從而可以鑑別雜交種中最常見的自交苗。基於以上認識，首先根據文獻資料，從Maize Database上公布的SSR引物中初步選擇500個SSR引物進行合成，從中篩選出多態性高、帶型清晰、重複性好的引物50個作為玉米品種鑑定的一套核心引物；從核心引物中進一步篩選出在中糯1號父本、母本和雜交種間表現差異的引物，並通過田間常規鑑定與室內鑑定比較，驗證引物可靠性，確定出中糯1號純度鑑定的特徵引物bnlg589、phi116、phi083、umc1065、nc004、phi109188、umc1571、umc1904(引物序列可查詢MaizeDatabase)。
最後，製作一套中糯1號的的純度檢測試劑盒(包括以上8個不同的引物)該試劑盒提供優化後的操作程序、PCR全套反應體系及中糯1號標準電泳圖譜。使用其中任一試劑盒均可對中糯1號進行純度檢測，不同試劑盒的檢測結果可相互驗證；使用整套試劑盒還可對中糯1號進行真偽檢測。本發明的有益效果是簡單快速地檢測中糯1號樣品的純度，檢測結果穩定，容易統計，檢測一份樣品(100粒種子)從送樣到出結果僅需4-5小時，保證了送檢樣品當日即可出結果。利用該試劑盒，一般種子質檢室只需具備常規的分子生物學設備就可按提供的操作步驟進行實際檢測。
2)所用DNA樣品也可通過籽粒發芽，用微量CTAB法、SDS法等獲得。其它步驟同上。
3)擴增產物也可用非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，常規銀染法檢測。其它步驟同上。
附參考文獻1.郭景倫，趙久然，孔豔芳等。玉米單粒種子DNA提取新方法及在玉米種質鑑定中的應用研究。種子，1999，237-38。
權利要求
1.一套玉米品種中糯1號純度及真偽檢測專用試劑盒(共8個)，包括操作程序、PCR全套反應體系，中糯1號標準電泳圖譜。其特徵是每個試劑盒分別包含中糯1號純度鑑定的特徵引物bnlg589、phi116、phi083、umc1065、nc004、phi109188、umc1571、umc1904，每個試劑盒均可用於中糯1號純度檢測，不同試劑盒檢測結果可相互驗證。全套試劑盒還可用作中糯1號真偽檢測。
2.一種適於玉米品種純度檢測的優化的SSR操作程序，包括DNA提取、PCR擴增、電泳、銀染檢測等環節的優化組合。其特徵是DNA提取法在郭景倫等的玉米單粒種子DNA快速提取法基礎上進一步提高DNA提取質量；PCR擴增時間僅需約2小時；銀染檢測在快速銀染法基礎上進一步簡化，僅需約15分鐘。優化組合後的操作程序僅需4-5個小時即可完成1份送檢樣品(100粒)的純度檢測。
全文摘要
一套適於中糯1號純度檢測的簡單快速、準確穩定的試劑盒產品(共8個)，提供操作步驟、PCR全套反應體系、中糯1號標準電泳圖譜。其特徵是每個試劑盒分別包含中糯1號純度鑑定的一個特徵引物，使用其中任一試劑盒均可對中糯1號進行純度檢測，不同試劑盒的檢測結果可相互驗證；使用整套試劑盒還可對中糯1號進行真偽檢測。使用該試劑盒僅需4－5個小時即可完成1份送檢樣品(100粒)的純度檢測。
文檔編號G01N27/447GK1456683SQ0311941
公開日2003年11月19日 申請日期2003年3月12日 優先權日2003年3月12日
發明者趙久然, 王鳳格, 郭景倫 申請人:北京市農林科學院玉米研究中心