白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其應用的製作方法
2023-12-10 04:32:21
專利名稱：白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及文昌魚熱休克蛋白，特別涉及白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其應用。
背景技術：
文昌魚(Amphioxus)隸屬脊索動物門(Chordate)頭索動物亞門 (Cephalochordate)，它處於無脊椎動物進化到脊椎動物一個重要的過渡階段，是現存生物中最類似於脊椎動物亞門直接祖先的類群之一。因其獨特的進化地位，且結構簡單，身體半透明，基因組僅為人類的1/6，呈現出基因倍增前脊椎動物祖先的基因組的特徵(1、 Balczarek, K. A.，Lai, Z. C.，Kumar，S.，Evolution of functional diversification of the pair box (Pax)DNA-binding domains. Molecular. Biology and Evolution[J]. 1997. (14)，擬9-842.)。隨著對文昌魚的研究日益深入，佛羅裡達文昌魚(Brmchiostoma flloridae)全基因組測序完成，尤其是文昌魚實驗室連續繁殖的成功(2、Zhmg，Q. J.， Sun，Y.，Zhong，J.，Li，G.，Lii, Χ. Μ.，Wang, Y. Q，Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generation in laboratory. Journal of Experimental Zoology(Molecular and Developmental Evolution)[J]. 2007，308(4)， 464-47 ，極大地推動了文昌魚的模式化進程。在其他模式生物中成功應用的生物技術，如 RNA幹擾技術，顯微注射和細胞培養技術等同樣在文昌魚中逐步建立。作為一種新型的模式生物，研究其調控目的基因表達的分子工具是必不可少的，到目前為止，文昌魚中只有 ^οχ D基因啟動子(3、Yu，J· K. ,Holland,N. D.，Holland，L Ζ. ,Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.Development Biology. 2004. (274)， 452-461)，Vent, Goosecoid and Chord 基因啟動子(4、Kozmikova, I.，Smolikova, J.， Vlcek, C. , Kozmik,Ζ. ,. Conservation and diversification of an ancestral chordate gene regulation network for dorsoventral patterning. Public Library of Scicence One. 2011.6(2))被報導。在現有的幾種模式生物中，已建立了一些調控基因表達系統，如四環素誘導系統(5、 Gossen, M. ， and Bujard， H. ， Anhydrotetracycline, a novel effector for the tetracycline controlled gene expression systems in eukaryotic cells. Nucleic Acids Research,1993. 21，4411—4412)，Gal/UAS 系統(6、Lewandoski, Μ.，Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2001. 2(10), 743-755)，或是開發一些組織特異性的啟動子或是增強子，如vasa基因啟動子能使下遊目 ^ ^^ ^ ^^ O、Tanaka, M. ，Kinoshita, M. ，Kobayashi, D. ，Nagahama, Y.， Establishment of medaka(Oryzias latipes)transgenic lines with the expression of green fluorescent protein fluorescence exclusively in germ cells :a useful model to monitor germ cells in a live vertebrate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. 98 (5)，2544-2549)，腎細胞特異的鈣粘著蛋白基因的啟動子能引導報告基因在腎臟和生殖泌尿道中特異表達(8、Shao, X.L.，Johson, J. E.，Richardson, J. Α. , Hiesberger, Τ. , Igarashi, P. , Aminimal Ksp-Cadhe—rin promoter linked to a green fluorescent protein reporter gene exhibits tissue-specific expression in the developing kidney and genitourinary tract.Journal of American. Sociology. 2002. 13,1824-1836)。然而以上所提到兩種方法存在不可克服的弊端，一是需要開發數目眾多的組織特異性的啟動子或是增強子，同時不易調控靶基因的表達(9、 Rome, C. , Couillaud, F. , Moonen,C. Τ. W. ,Spatial and temporal control of expression of therapeutic genes using heat shock protein promoters. Methods[J]. 2005.35, 188-198)，二是化學藥物誘導，對機體有害或有潛在的副作用(10、Oda, S.，Mikami, S.， Urushihara,Y. ,Murata,Y. ,Kamei,Y. ,Deguchi,Τ. ,Kitano,Τ. ,Fujimori,K. Ε. ,, Yuba,S., Todo,Τ. ,Mitani,H. ,Identification of a functional medaka heat shock promoter and characterization of its ability to induce exogenous gene expression in medaka in vitro and in vivo. Zoological Science. 2010. 27 (5)，410-415)。因而，在新型模式生物文昌魚中需要建立更好的表達調控系統。 近年來，熱休克蛋白基因啟動子被廣泛用於調控外源基因表達(ll、aioji，W. ,and Sato-Madda,M. ,2008. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development Growth & Differentiation. 50，401-406)。在醫療中，人的 Hsp70B 啟動子被用於腫瘤細胞的靶向治療。正常條件下，下遊基因在熱休克蛋白基因控制下不表達或表達量很低，應激後表達急劇上調。該啟動子不僅受熱誘導，還受所處環境的重金屬鹽，胺基酸類似物，滲透壓等刺激。熱休克蛋白基因啟動子在在果蠅，斑馬魚，小鼠等都得到了很好的研究和應用，但不清楚這些報導的熱休克蛋白基因啟動子是否也能在文昌魚中很好的發揮作用。除此之外，自身啟動子應該比其他物種來源的要更合適文昌魚的研究。
發明內容
本發明的目的在於提供白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子。本發明的第二目的在於提供白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子在調控白氏文昌魚基因表達中的應用。所述白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子的核苷酸序列為caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60
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ttcggaaaaa ttgtagatct tgggagaagg ttcttccgag tggtttataa gcgccgcaga 720agcgaactct ggtcattcag tttccagaga agcgaagcaa agttatccag agtgagaacg 780tagagcgatt g791。所述白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子可有效調控下遊基因表達。其受熱誘導的特性對研究某些對生物機體產生毒性的基因非常重要，可避免毒性基因持續表達導致的對生物體造成的有害影響。也可以白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子對感興趣的基因功能展開不同時間上，不同空間上(即不同組織器官)的研究。將該啟動子介導的目的基因整合到文昌魚基因組中，建立轉基因文昌魚，即可對文昌魚的不同發育時期或是不同部位的目的基因進行研究。由此可見，白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子可用於調控白氏文昌魚基因的表達。白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子熱誘導效果明顯，基礎性表達活力低。且因生物機體都有一定程度的耐熱能力，不會對對機體造成損傷，熱處理操作簡單，使得白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子的應用廣泛。本發明成功克隆了文昌魚熱休克蛋白70基因的上遊791bp序列，並將該片段載入帶有綠色螢光蛋白(GFP)的報告載體，在斑馬魚胚胎及鯉魚上皮瘤細胞系(EPC細胞系)進行功能檢驗，已證明該片段確實是熱誘導的啟動子，可作為調控文昌魚基因時空表達的分子開關。
圖1為轉染重組質粒的鯉魚上皮瘤細胞在不同溫度刺激後的GFP表達情況電鏡圖。在圖1中，上方為白光下的電鏡圖，下方為螢光下的電鏡圖，溫度分別為25°C，31°C， 34°C，37°C。
具體實施例方式實施例1白氏文昌魚熱休克蛋白70(Hsp70)基因啟動子序列獲取1、分離含有Hsp70的BAC克隆通過人(GenebankID :NM_005345),小鼠(Genebank ID :ΝΜ_010479)，斑馬魚(Genebank ID :NM_131397)，及佛羅裡達文昌魚 Hsp70 (JGI protein ID :277443)序列比對後，在保守位點設計一對特異引物，Hsp70-F CGGCTTACTTCAACGACT，Hsp70_R GACGACAGCGTCCTCTT。該引物首先在白氏文昌魚基因組水平上進行PCR(聚合酶鏈式反應) 擴增，能有效擴增到391b的序列，經測序驗證為目的基因片段。因此採用這對引物到白氏文昌魚基因組 BAC 文庫(Wang，W. ,Xu,H. L.，Lin，L. P. ,Su B. ,Wang, Y. Q. ,Construction of a BAC library for Chinese amphioxus Branchiostoma belcheri and identification of clone containing Amphi-Pax genes. Genes & Genetic Systems.2005. 80(3), 233-236.)篩選包含有Hsp70的BAC克隆，共篩選了 94塊384孔板，其中在69，77號板上篩選到陽性克隆。選取69號板進一步篩選，21B位置的克隆為陽性克隆。2、Hsp 70上遊區域序列分析將篩選到的含有Hsp 70的BAC克隆69-21B (所在文庫的編號)質粒進行測序(由深圳華大基因完成)。序列注釋採用Genscan Qittp://genes, mit. edu/GENSCAN. html)和 Genwise (http://www. ebi. ac. uk/Tools/ffise2/index. html)在線軟體。截取 Hsp70 基因
5起始密碼子ATG上遊1200bp序列進行在線軟體(http://www. fruitfly. org/seq_tools/ promoter, html)預測潛在的啟動子及其轉錄元件搜尋(http://www. cbil. upenn. edu/ cgi-bin/tess/tess)。預測結果發現起始密碼上遊的非編碼區預測出一個核心啟動子，最重要的是，該區域包含了三個熱休克元件(heat shock element HSE)，針對這些重要的調控元件所在的區域設計一對特異引物，引物序列為Hsp70-pro-F -.CTCGAG CAATGGCTAACACGACATCAC,下劃線斜體部分為 Β ο I 酶切位點；Hsp70-pro-R GAATTC CAATCGCTCTACGTTCTCACT,下劃線斜體部分為 EcoR I 酶切位點，對潛在的啟動子區域(791bp)進行PCR擴增，獲得白氏文昌魚熱休克蛋白70基因
啟動子。所得白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子的核苷酸序列為caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60
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tagagcgattg791。實施例2白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子1、構建重組表達質粒將擴增啟動子區域的PCR經Xho IjEcoR I雙酶切處理，載入經過同樣雙酶切處理的pAcGFPl-l(該載體無啟動子，Clontech)載體中，轉化DH5a菌株，經PCR及酶切鑑定後得到陽性克隆進行測序，證明插入片段無誤，然而進行功能驗證。2、顯微注射斑馬魚胚胎因文昌魚胚胎顯微注射技術暫時還不夠穩定，申請人將所構建好的重組質粒注射到斑馬魚胚胎中進行驗證。注射的斑馬魚胚胎處於單細胞時期，從胚胎的動物級注入，每個胚胎注射量約為1 2nl，注射的重組質粒濃度約為lOOng/μ 1，顯微操作儀為Narishige IM-30型。200枚胚胎用於注射組，分為2組，一組用於熱激，一組不熱激，作為對照，每組 100枚。24h後，由於機械損傷，熱激的胚胎剩下95枚存活，對照的胚胎剩下94枚。將熱機組的胚胎置於預熱好的37°C水浴中，處理0.證，對照組不處理，一直處於培養箱中。熱激4h後，檢測各胚胎螢光表達情況。最後熱激組一共觀察到39條魚出現螢光，對照組出現 12條，即熱激組有41. (39/95)的胚胎檢測到報告基因的表達，沒有經過熱激處理的有12.8% (12/94)的胚胎檢測到GFP的表達。經過熱誘導的胚胎，檢測到發螢光的胚胎比率明顯上調，證實了克隆的序列為誘導型的啟動子。2. 3轉染細胞鯉魚上皮瘤細胞EPC培養於含5%胎牛血清的L15培養基(Gibco)中，25°C生化培養箱中傳代培養。轉染前，細胞更換無血清的新鮮培養基中，本實驗採取脂質體轉染。分別將Iyg 質粒DNA及5 μ L的脂質體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)稀釋到250 μ L的無血清培養基中，各自混勻靜止5min後，再將兩種溶液混合均勻，室溫靜置20min。待DNA-脂質體複合物形成後，緩慢均與加入到各細胞培養皿中。輕輕來回晃動，然後置於25°C培養箱中培養。他後，跟換新鮮含有5%胎牛血清的培養基。為考察不同溫度，31°C，34°C，37°C對對啟動子Pl的誘導效果，細胞更換培養基4h 後，開始熱激處理，將細胞培養皿置於31°C，34°C，37°C溫度的水浴鍋中，各處理0. 5h，然後放回培養箱中培養，陰性對照組轉染無啟動子的pAcGFPl-Ι質粒，持續25°C培養。24h後觀在倒置螢光顯微鏡(Nikon TE-2000S)觀察螢光表達情況，轉染含啟動子的重組質粒在不同溫度刺激後，報告基因得到了不同程度的表達，對照組沒有觀察到GFP，正常溫度(25°C ) 培養的EPC細胞中也觀察不到GFP的表達，31°C處理的細胞開始有較弱的報告基因的表達， MO熱激的EPC細胞可以觀察到較強的GFP表達，37°C表達最強烈(參見圖1)。再將細胞消化下來，懸浮於冰冷的PBS中，採用流式細胞儀EPICS XL (Beckman Coulter)檢測GFP的表達量。通過流式細胞儀檢測GFP的表達情況，結果見表1。37°C刺激後表達GFP的細胞約為10. 90%，相比較25°C培養細胞(2. 20% )，GFP表達上調約5倍，同時看出溫度對啟動子有十分顯著的熱誘導效果(AN0VA，P < 0. 01)。表1不同溫度刺激後流式細胞儀檢測GFP陽性細胞的表達
刺激溫度(°c ) GFP陽性細胞比例(％ )
25 (對照)2.20±0.26
313.76±0.23344.55±0.213710.88±0.39 數據充分說明這段791bp的序列具有啟動子的功能，並且是熱誘導的啟動子。可利用其與其它基因建立轉基因文昌魚，開展發育過程中的過表達研究，探討其功能及其發揮作用的時期，為研究文昌魚基因功能提供一個有力的工具。
權利要求
1.白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子，其特徵在於其核苷酸序列為caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60cggtattaacgttatatcaaggactgtgttacctaggcttgagatactgtgttttagatt120atttagctagacatgtcctcgattacatgtatatatagctgaagcaggctctttccagat180tgacacacatagtattatagactaattacaacgcaatattcatatcatgtgcatatgata240tcacaggaataattcttggtacgatttcaggacaacagacgcagacgtctgcacgtgttt300gaaaacacccccctccccctctggactttttacacgctcataatgctacatatgaatggc360tagatactatcacataacgcccaatcgtgcacatgatatt3.3.3.3.3. C 3. 3.aagaaccttt420gtcgccggagaagggacatcttgaaatcggaggacactggagactttctacatctttcca480gaagaaactttccgccatcttgaatgtttacattctcccatggaccagcccattttgcgg540caggtatttacgacacgacgtgacgtcctactgcacgggcggttccagaaagctctggaa600ggtgcgcgcaagttctcgtgttatcctggatgttgtagaagcctagattgttcctgaatg660ttcggaaaaattgtagatcttgggagaaggttcttccgagtggtttataagcgccgcaga720agcgaactctggtcattcagtttccagagaagcgaagcaaagttatccagagtgagaacg780tagagcgattg791。
2.如權利要求1所述的白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子在調控白氏文昌魚基因表達中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述基因是下遊基因。
全文摘要
白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其應用。涉及文昌魚熱休克蛋白，提供白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其在調控白氏文昌魚基因表達中的應用。所述白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子可有效調控下遊基因表達。其受熱誘導的特性對研究某些對生物機體產生毒性的基因非常重要，可避免毒性基因持續表達導致的對生物體造成的有害影響。也可以白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子對感興趣的基因功能展開不同時間上，不同空間上的研究。將該啟動子介導的目的基因整合到文昌魚基因組中，建立轉基因文昌魚，即可對文昌魚的不同發育時期或是不同部位的目的基因進行研究。
文檔編號C12N15/113GK102199604SQ20111006886
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月21日 優先權日2011年3月21日
發明者李光, 李定亮, 王義權 申請人:廈門大學