以黃顙魚β-肌動蛋白啟動子和生長激素基因為元件構建的黃顙魚本源轉基因載體及其應用的製作方法
2023-12-10 04:24:56 1
專利名稱：以黃顙魚β-肌動蛋白啟動子和生長激素基因為元件構建的黃顙魚本源轉基因載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及黃顙魚β-肌動蛋白的啟動子和生長激素基因以及3』-非翻譯區序列的克隆、重組及啟動子活性分析和應用，並以此為元件構建黃顙魚本源的轉基因載體，屬於基因工程領域。
背景技術：
黃顙魚(Pseudobagrus fulvidraco Richardson)俗稱昂子魚,黃蠟丁。隸屬鯰形目，鮑科，黃顙魚屬。該魚屬溫水性魚類，營底棲生活，個體通常在30 100克左右，廣泛分布於我國內陸水域中。其體表光滑無磷，肉質細嫩，無肌間刺，蛋白質含量15. 37%，胺基酸總量14. 19%,必需胺基酸指數達73. 34，賴氨酸含量較高，味道鮮美，具有很高的營養價值，且其肉味甘、平，有祛風、利尿之功效，深受消費者歡迎。從水產經濟角度來說，黃顙魚是一種優質高檔魚類，在國內外擁有成熟的消費市場。近年來，其平均價格一直穩中有升，一般在20 40元/千克，僅南京市場年銷售量就達70萬公斤以上，而蘇錫常及上海銷售量更大。在國際市場上，黃顙魚深受東南亞各國消費者喜愛，尤其是韓國每年要從我國進口數百噸黃顙魚商品魚，是出口創匯的優良品種。然而，目前市場上銷售的黃顙魚主要來自於野生資源的捕撈，由於該魚生長速度慢、個體規格偏小，通常要兩年才能性成熟，加上該魚產卵量低，市場供應的商品魚不僅數量少且個體小(多為50克左右)，遠遠不能滿足市場的需求。為解決這些問題，國內學者進行了許多有益的嘗試，主要集中在人繁馴養、品種改良和養殖環境的優化方面，但從國內外水產動物研究的趨勢來看，從分子水平對魚類基因組進行改造，定向培育新型養殖品種是最有潛力的一種方法；更具重要意義的是轉生長激素基因魚餌料係數低，養殖周期短，當年即可上市，能顯著降低魚類養殖成本。目前轉生長激素基因魚在加速魚體生長，增大魚體個頭，提高餌料的利用率等方面都顯示了良好的效果。在魚類基因工程育種中，採用「全魚」技術，即所轉基因全部來自於受體魚自身品系，製作成的大規格的轉基因魚，被認為是確保轉基因在生物安全，生態環境安全，食品安全及消費者認可等方面因素後的最佳選擇。目前歐洲許多國家已經批准轉基因魚在飼料上的應用，我國的轉基因鯉魚也製作成功。但轉基因黃顙魚的研發尚未有文獻和研究涉及，因此構建黃顙魚本源轉基因載體具有廣泛的經濟效益前景。
發明內容
本發明的目的在於提供黃顙魚肌動蛋白的啟動子、生長激素基因及其3』 -非翻譯區序列以及以此為元件構建的黃顙魚本源生長激素轉基因載體。本發明的目的通過如下技術方案實現1.黃顙魚β-肌動蛋白啟動子的克隆(1)本發明根據GenBank上已有的魚類β -肌動蛋白啟動子序列，在同源保守區內設計一條上遊引物P1，其位置在CAAT box附近。之後再將其外顯子進行序列比對，在 β-肌動蛋白的3號外顯子的保守區內設計一條下遊引物P2，通過這對引物來克隆黃顙魚的β-肌動蛋白啟動子。(2)提取黃顙魚腦垂體組織的基因組DNA，並以此為模板，用Ρ1，Ρ2為引物，擴增出黃顙魚的β-肌動蛋白啟動子序列。該啟動子序列包含β-肌動蛋白基因表達調控序列、 外顯子1以及部分外顯子2的序列，全長為1756bp。(3)將PCR擴增的β -肌動蛋白啟動子序列克隆進pMD 18-T載體中，命名為 pActinproexon—To(4)為了證明黃顙魚β-肌動蛋白啟動子的活性，將β-肌動蛋白啟動子插入到黃色螢光蛋白載體中，看能否驅動螢光蛋白的表達。通過轉基因斑馬魚的活體實驗，證明了 β-肌動蛋白啟動子能夠有效地驅動黃色螢光蛋白在斑馬魚體內的廣泛表達。2.黃顙魚生長激素基因及其3』 -非翻譯區序列的克隆(1)參照GenBank中已發表的魚類生長激素基因cDNA序列，在同源保守區設計一對兼併引物(P3和P4)擴增該基因的開放閱讀框(ORF)序列。(2)提取黃顙魚的腦組織的總RNA並通過逆轉錄得到用於PCR反應的cDNA模板。 隨後用P3，P4為引物，擴增出黃顙魚生長激素基因的開放閱讀框序列，即蛋白質編碼序列。 該序列全長全長60;3bp，編碼200個胺基酸。(3)將PCR擴增的生長激素開放閱讀框序列序列克隆進pMDIS-T載體中，命名為 pGHORF-T。(4)為了通過3』 -RACE反應獲得黃顙魚生長激素基因的3』 -非翻譯區序列 (3』-UTR)，在終止密碼子上遊IOObp處設計引物P5。另一引物為含有接頭序列的通用引物 UPM。(5)提取黃顙魚的腦組織的mRNA並通過逆轉錄得到用於PCR反應的cDNA模板。隨後用P5，UPM為引物，擴增出黃顙魚生長激素基因3』 -非翻譯區序列。該序列全長687bp。(6)將PCR擴增的生長激素基因3』 -非翻譯區序列克隆進pMDIS-T載體中，命名為 pGH3-UTR-T。(7)由於開放閱讀框序列和3』 -非翻譯區序列之間存在160bp的重疊區，通過 OverlappingPCR法介導黃顙魚生長激素基因開放閱讀框序列和3』-非翻譯區序列的重組。 根據已獲得黃顙魚cDNA序列，設計了 2對Overlapping PCR引物P6、P7和P8、P9。(8)以重組質粒pGH ORF-T為模板，用P6和P7為引物，進行第一輪PCR擴增；以重組質粒PGH 3-UTR-T為模板，用P8和P9為引物，進行第一輪PCR擴增。之後以上述兩對引物擴增得到的PCR產物為共同模板，以P6和P9為引物，進行第二輪PCR擴增，獲得包含黃顙魚生長激素基因開放閱讀框和3』-非翻譯區序列的生長激素cDNA。該序列全長1088bp。(9)將Overlapping PCR重組得到的黃顙魚生長激素cDNA克隆進pMD18_T載體中,命名為pGH-cDNA-T。3.黃顙魚本源生長激素轉基因載體的構建(1)為使整個轉基因表達載體從啟動子到加尾信號之間的表達相關序列全部為黃顙魚的本源序列，在通過設計引物PlO JfBamH I位點引入到β-肌動蛋白啟動子序列的 5』 -端。以Ρ10、Ρ11為引物，以pActin proexon-T為模板，PCR擴增得到引入了 BamH I位點的β-肌動蛋白啟動子片段，並將其克隆到PMD18-T載體中，命名為pActin Bproexon-T0(2)通過 BamH I 和 Nco I 雙酶切重組質粒 pActin Bproexon-T 和 pGH-cDNA-T，分別得到黃顙魚的β-肌動蛋白啟動子片段和生長激素cDNA片段(包含開放閱讀框和3』-非翻譯區序列)。隨後將此兩個元件通過BamH I位點克隆到pBluescript-SK質粒中，通過酶切篩選正確的陽性克隆。該本源轉基因元件通過黃顙魚自身的β-肌動蛋白啟動子來驅動自身的生長激素基因的表達。本發明的優點本發明從黃顙魚基因組DNA中獲得了黃顙魚β-肌動蛋白基因啟動子序列，擴充了轉基因魚類的啟動子種類；本發明從黃顙魚總RNA中獲得了黃顙魚生長激素基因開放閱讀框及3』 -非翻譯區序列，擴充了轉基因魚類的基因庫；本發明構建了黃顙魚β -肌動蛋白基因啟動子驅動的黃色螢光蛋白表達載體，並成功在轉基因斑馬魚內穩定表達，該重組載體對魚類轉基因研究具有極大的生物學和生物工程學意義；本發明得到的黃顙魚本源轉基因載體在應用於轉基因黃顙魚育種生產時不含有任何菌源核苷酸，其顯微注射基因片段是一種全黃顙魚本源基因片段。
圖1.黃顙魚β -肌動蛋白啟動子的PCR電泳圖。泳道1為DNA Marker,泳道2為 PCR結果，條帶大小為1756bp。圖2.用黃顙魚β -肌動蛋白啟動子驅動的黃色螢光表達的轉基因斑馬魚幼體96 小時的螢光顯微鏡照片。圖3.黃顙魚生長激素基因開放閱讀框的PCR電泳圖。泳道1為DNA Marker,泳道 2為PCR結果，條帶大小為60;3bp。圖4.黃顙魚生長激素基因3，-RACE的PCR電泳圖。泳道1為DNA Marker，泳道 2為PCR結果，條帶大小為687bp。圖5.黃顙魚生長激素基因overlapping PCR電泳圖。圖A為開放閱讀框的PCR 電泳圖，泳道1為DNAMarker，泳道2為PCR結果，條帶大小為60;3bp ；圖B為3』 -非翻譯區序列PCR電泳圖。泳道1為DNAMarker，泳道2為PCR結果，條帶大小為687bp ；圖C為 overlappingPCR電泳圖，泳道1為PCR結果，條帶大小為lO^bp，泳道2為DNAMarker。圖6.黃顙魚本源轉基因載體pActin promoter-GH的酶切鑑定圖。泳道1為DNA Marker,泳道2為pActin promoter-GH質粒的電泳條帶，泳道3為BamH I和Nco I雙酶切的結果電泳條帶，泳道4為BamH I酶切的電泳條帶。圖7.黃顙魚本源轉基因載體pActin promoter-GH的示意圖。
具體實施例方式實施例1黃顙魚β -肌動蛋白啟動子的克隆1.引物設計將GenBank上已發表的stingcatfish和tilapia等魚類的β -肌動蛋白的啟動子序列進行序列比對，在同源保守區內設計一條上遊引物Ρ1，其位置在CAAT box附近。之後再將其外顯子進行序列比對，在肌動蛋白的3號外顯子的保守區內設計一條下遊引物Ρ2，通過這對引物來克隆黃顙魚的β-肌動蛋白啟動子。
Pl 5 『-GTGWGTGACGCMGGACCAATC-3，(W = A+T, M = T+C)P2 5 『-CCATXTCXTCCCAGTTGGTYACAAT-3，(X = A+G, Y = G+C)2.基因組DNA提取取成體黃顙魚腦垂體剪碎於1. 5ml已滅菌的離心管中，加入一定量(m/v = 1/10，以IOml每g組織為宜)的消化緩衝液(IOmM Tris-Cl, pH 8.0,1% SDS，100 μ g/ml蛋白酶K)後放置37°C水浴鍋中不時輕微振蕩消化5小時，到組織塊消化完全；然後加入相等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1)提取兩次，將水相轉移至乾淨的1. 5ml已滅菌的離心管中，並加入3M氯化鈉至終濃度為0. 3M ；再加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動離心管，直至溶液完全融合，可以觀察到白色絮狀沉澱；將其以3000g，離心 10分鐘；用70%的乙醇洗滌沉澱後在室溫下乾燥，並在100 μ 1 TEdOmM Tris-Cl,pH 8.0， ImM EDTA)中溶解；溶解後加入十分之一體積3M醋酸鈉(pH = 5. 6)，加入(無核酸酶)RNase A至濃度100 μ g/ml ；37°C放置5分鐘，加入10% SDS至最終濃度0. 2%;再加入相等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1)提取兩次，將水相轉移至乾淨的1. 5ml已滅菌的離心管中，並加入3M氯化鈉至終濃度為0. 3M ；再加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動離心管， 直至溶液完全融合，可以觀察到白色絮狀沉澱，1200g離心10分鐘，乾燥，20 μ 1 IOmM TE中溶解，並保存-80°C待用。3.PCR擴增以上述基因組DNA為模板，用P1、P2擴增黃顙魚β-肌動蛋白基因啟動子，PCR反應體系如表1 表1. PCR反應體系
MilliQ H2O12.1μ1
10 X buffer (無 Mg2+) 2μ1 25mM Mg2+2μ1
5μΜΡ1Ιμ 5^mp2叫
5mM dNTP0.8μ1
rTaq 酶0.1 μ
基因組 DNAΙμ (200ng)
Total20μ PCR擴增反應條件95°C預變性時間5分鐘，每個循環包括94°C變性1分鐘，58°C 復性45秒，72°C延伸2分鐘，循環30次，最後一個循環結束時72°C延伸10分鐘。反應結束後取5 μ 1 PCR產物，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果(圖1)。4. PCR產物的T載體連接按Takara pMD18_T載體說明書進行PCR產物和pMD_18T 載體連接，體系如表2:表2 連接體系
權利要求
1.黃顙魚β-肌動蛋白啟動子，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，其特徵在於所述序列表中序列1的5』 -端1至1017位鹼基為啟動子區域。
2.黃顙魚的生長激素基因及其3』-非翻譯區，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。其特徵在於所述序列表中序列2的5』 -端1至603位鹼基為胺基酸編碼區域；604至1088位鹼基為3，-非翻譯區序列；1070至1075位鹼基為Poly A加尾信號。
3.含有權利要求1所述啟動子的真核表達載體。
4.含有權利要求2所述基因的真核表達載體。
5.含有權利要求1所述啟動子的重組微生物。
6.含有權利要求2所述基因的重組微生物。
7.權利要求1所述黃顙魚肌動蛋白啟動子在黃顙魚基因育種中的應用。
8.權利要求2所述黃顙魚生長激素在促進魚類生長中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種黃顙魚的β-肌動蛋白啟動子、生長激素基因及其3』-非翻譯區序列以及以此為元件構建的黃顙魚本源轉基因載體。本發明獲得了黃顙魚的β-肌動蛋白啟動子序列以及外顯子1和部分外顯子2的序列，還獲得了黃顙魚生長激素基因的胺基酸編碼序列和3』-非翻譯區序列，並以獲得的黃顙魚β-肌動蛋白的啟動子、生長激素編碼基因以及3』-非翻譯區為元件構建黃顙魚本源生長激素轉基因載體。本發明用黃顙魚自身的β-肌動蛋白的啟動子驅動其自身的生長激素基因表達的方法來構建轉基因載體，能有效地避免轉基因魚所面臨的生物安全性問題，對黃顙魚基因育種與人工繁殖有重大的實際意義和應用前景。
文檔編號C12N15/18GK102191270SQ20101011612
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月3日 優先權日2010年3月3日
發明者宋偉, 熊熙文, 趙慶順 申請人:南京大學