一種t淋巴細胞的酶聯免疫斑點試驗方法
2023-12-09 06:46:16
一種t淋巴細胞的酶聯免疫斑點試驗方法
【專利摘要】本發明公開了一種T淋巴細胞的酶聯免疫斑點試驗方法，包括以下步驟：採用英國OxfordImmunotec公司生產的T-SPOT.TB試劑盒，取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血5ml，分離外周血單個核細胞放在包被γ-幹擾素抗體的微孔板，加入結核特異性抗原早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培養濾過蛋白(CFP-10)作為刺激原，溫箱培養24h後，洗去抗原致敏效應T淋巴細胞，加入生物素標記的二抗，再經酶聯顯色，在細胞因子分泌的地方形成斑點，通過記錄斑點數檢測結核特異抗原致敏的效應T淋巴細胞數量。本發明方法有助於菌陰肺結核早期篩查。
【專利說明】一種T淋巴細胞的酶聯免疫斑點試驗方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於一種生物學檢測領域，具體是指一種T細胞斑點實驗方法。
【背景技術】
[0002]近年來，結核病的發病率有上升趨勢。菌陰肺結核佔全部肺結核的40%飛0%，菌陰肺結核病人如果不給予治療，近一半的病人將發展為塗陽，成為新的傳染源。目前許多菌陰肺結核患者沒有特異的臨床表現，缺乏典型的影像學特徵，因而僅靠現有的結核診斷手段，極易漏診、誤診，對預後不利，容易造成結核難以控制或傳播。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種T淋巴細胞的酶聯免疫斑點試驗方法，通過該方法有助於菌陰肺結核早期篩查。
[0004]為實現上述目的，本發明的技術方案是採用英國Oxford Immunotec公司生產的T-SP0T.TB試劑盒，取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血5 ml，分離外周血單個核細胞放在包被γ-幹擾素抗體的微孔板，加入結核特異性抗原早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培養濾過蛋白(CFP-1O)作為刺激原，溫箱培養24h後，洗去抗原致敏效應T淋巴細胞，加入生物素標記的二抗，再經酶聯顯色，在細胞因子分泌的地方形成斑點，通過記錄斑點數檢測結核特異抗原致敏的效應T淋巴細胞數量。
[0005]本申請的方法提高了菌陰肺結核早期診斷率，可作為肺結核早期診斷的一項實驗室檢查方法，較傳統的pro試驗有更高的敏感性和特異性。T-SP0T.TB實驗的應用使患者得到早期診斷，及時治療，從而改善菌陰肺結核患者的療效及預後，控制結核的播散。
[0006]下面結合【具體實施方式】對本發明做進一步介紹。
【具體實施方式】
[0007]下面通過實施例對本發明進行具體的描述，只用於對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護範圍的限定，該領域的技術工程師可根據上述發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。
實施例
[0008]對象與方法
一、對象 2012年I月?2012年12月溫州醫科大學定理臨床學院收住的菌陰肺結核60例，同期門診健康普查者20例。所有入組對象均無人免疫缺陷病毒感染、急性病毒感染、妊娠和應用免疫抑制劑等病史。
[0009]1.實驗組:菌陰肺結核患者60例，男43例，女17例。年齡20_52歲，平均35.4± 15.3歲。其中有細菌學或病理學依據伴有其他部位結核感染者21例，其中包括結核性腦膜炎2例、結核性胸膜炎4例、腎結核I例、結核性腹膜炎2例、關節結核3例和淋巴結核9例；無病理學依據,但通過診斷性抗癆治療獲得痊癒的患者39例。入組標準:1典型肺結核臨床症狀和胸部X線表現。2抗結核治療有效。3臨床可排除其它非結核性肺部疾患。4 PPD(5TU)強陽性；血清抗結核抗體陽性。5痰結核菌PCR+探針檢測呈陽性。6肺外組織病理證實結核病變。7支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid BALF)檢出抗酸分支桿菌。8支氣管或肺部組織病理證實結核病變。具備I?6中3項或7?8條中任何I項[2]。
[0010]2.對照組:健康普查者20例，其中男14例，女6例。年齡17-50歲，平均33.2±16.3歲。入組標準:無臨床症狀、胸部X線檢查無肺部疾患，無結核病接觸史的健康志願者，經問卷調查來自結核分枝桿菌感染低暴露風險人群。
[0011]二、方法
1.T-SP0T.TB實驗:採用英國Oxford Immunotec公司生產的T-SP0T.TB試劑盒，按廠商說明書操作。
[0012]1.1檢測步驟:取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血5 ml，分離PBMC放在包被INF- Y抗體的微孔板，加入結核特異性抗原早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培養濾過蛋白(CFP-10)作為刺激原，溫箱培養24h後，洗去抗原致敏效應T淋巴細胞，加入生物素標記的二抗，再經酶聯顯色，在細胞因子分泌的地方形成斑點，通過記錄斑點數檢測結核特異抗原致敏的效應T淋巴細胞數量。
[0013]1.2結果判斷:當空白對照孔內斑點數〈6時，任一實驗孔斑點數減去空白孔斑點數> 6，結果即為有反應性；若空白對照孔斑點數>6，任一實驗孔斑點數大於空白孔斑點數的兩倍，結果也表示有反應性；若上述標準不符合且陽性質控對照孔正常時檢測結果為無反應性。
[0014]2.PPD試驗:pro試劑(成都生物製品研究所生產)0.1 ml (5IU)緩慢注入左前臂掌側中央皮內，72 h觀察反應結果。用手指輕摸硬結的表緣，測量硬結的橫徑和縱徑，得出平均直徑=(橫徑+縱徑)/2，硬結直徑彡4 mm為陰性，5?9 mm弱陽性，l(Tl9mm為陽性，^ 20 mm或〈20 mm局部出現水泡和淋巴管炎為強陽性。
[0015]三、統計學分析採用SPSS18軟體進行統計學分析。計數資料的比較採用卡方檢驗或Fisher精確檢驗進行，p < 0.05為差異有統計學意義。
[0016]結果
1.T-SP0T.TB檢測法與臨床診斷一致率比較。實驗組60例菌陰肺結核患者T-SP0T.TB實驗陽性57例，陰性3例，而20例對照組健康普查者T-SP0T.TB實驗陽性I例，陰性19例。X2 =0.25，P=0.617，P>0.05，說明T-spot檢測法與臨床診斷無統計學差異，即該法與臨床診斷一致率較高。見表I。
[0017]表1.T-SP0T.TB 實驗結果(例)
【權利要求】
1.一種T淋巴細胞的酶聯免疫斑點試驗方法，其特徵在於:包括以下步驟: 採用英國Oxford Immunotec公司生產的T-SP0T.TB試劑盒， 取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血5 ml，分離外周血單個核細胞放在包被Y-幹擾素抗體的微孔板，加入結核特異性抗原早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培養濾過蛋白(CFP-1O)作為刺激原，溫箱培養24h後，洗去抗原致敏效應T淋巴細胞，加入生物素標記的二抗，再經酶聯顯色，在細胞因子分泌的地方形成斑點，通過記錄斑點數檢測結核特異抗原致敏的效應T淋巴細胞數量。
【文檔編號】G01N33/535GK104198693SQ201410371436
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】蔣賢高, 施伎蟬, 朱海燕, 黃默荷, 程愛瓊, 邱彩英 申請人:溫州市中心醫院