一種檢測個體胰島素抵抗遺傳易感性的試劑盒的製作方法

2023-12-09 06:34:01

專利名稱：一種檢測個體胰島素抵抗遺傳易感性的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測個體胰島素抵抗遺傳易感性的試 劑盒，通過同時檢測與胰島素抵抗遺傳易感性密切相關的編碼脂聯蛋白的C1Q和膠原結構域(ADIP0Q)、 編碼單核細胞和巨噬細胞所產生的腫瘤壞死因子-a (TNF-a)和編碼白細胞介素-6 (IL-6)的三種基因上 的單核苷酸多態性位點基因型來評估個體胰島素抵抗遺傳易感性。
背景技術：
糖尿病是一種十分常見的代謝系統疾病。2型糖尿病患者中，多數存在胰島素抵抗(IR)。大量研究表 明IR早於糖尿病發生的10 20年，表現為不同程度的高胰島素血症、肥胖及收縮壓升高；若病情繼續 發展，將出現糖耐量異常，患者主要表現為大血管病變、微量蛋白尿、餐後高血糖及高胰島素血症；而當 出現糖尿病時，則出現空腹和餐後髙血糖，並伴有微血管及大血管併發症。目前，胰島素抵抗問題，已日 益受到關注。
胰島素抵抗問題的發生，是由生活習慣等外界因素和遺傳體質共同決定的，不同的人在相同的環境下， 發生胰島素抵抗的可能性不同，因此採取的預防措施也不同，利用現代科學研究成果，開發一項基於分子 遺傳基礎的胰島素抵抗風險評估產品將對胰島素抵抗的發生起到預警、個性化防治作用，具有很強的社會 意義和市場前景。
目前對涉及胰島素抵抗通路的一些基因已經進行了大量研究。其作用機制、生化功能、通路情況、調 控、轉錄等等方面都有明確可靠的研究結果；己經有可靠的檢測方法、儀器設備和檢測試劑等。
目前，己知，編碼脂聯蛋白的C1Q和膠原結構域(WHP0Q)、腫瘤壞死因子--a (TNF-a)和白細胞介素 -6 (IL-6)的三種基因與胰島素抵抗有密切關係。
ADIPOQ為脂聯蛋白的C1Q和膠原結構域編碼基因，它編碼一種在結構上與膠原X和VIII以及補體Clq 類似的蛋白質。這種基因主要在脂肪組織中表達，所編碼的蛋白質在血液中循環，並且和代謝以及激素產 生過程有關。它的突變或異常表達等都會引起胰島素等代謝綜合症。研究表明ADIP0Q3號外顯子的變異與 基因本身的表達及其產物的水平有密切關係。研究表明rs2241766 (G129T)為該外顯子上的同義突變，其 所改變的密碼子頻率可影響基因表達水平，並且與胰島素抵抗有關。通過大量關聯性分析表明，脂聯素基 因外顯子Glyl5Gly多態性與2型糖尿病相關,GG基因型者具有2型糖尿病高易感性。
TNF-a全稱腫瘤壞死因子-a (Tumor necrosis factor-a )，為編碼單核細胞和巨噬細胞所產生的腫瘤 壞死因子的基因，由該基因編碼的蛋白是一種多功能的細胞因子，它能顯著誘導巨噬細胞以抑制細齒生長， 誘導多種細胞因子產生間接調節免疫細胞的活性，增強特異性免疫保護功能。國內外的眾多研究表明TNF-o基因上的多態現象與胰島素，過氧化脂質，血脂，血糖，瘦素等因素相關。TNF-a塞K的缺陷可以直接 導致炎症，並大大提高糖尿病、骨疾病、腫瘤、冠心病的患病機率。TNF-a位於第六號染色體6p21.3位 置，基因全長2.8kb， mRNA全長1669bp，共有4個外顯子，編碼234aa的蛋白。TNF-a是一種分子量為 25kD的膜蛋白，並以17kD大小存在於循環中。rsl800629是位於第六號染色體上TNF- a基因啟動區-一個 G/A多態，研究表明其與胰島素抵抗的發生發展、糖尿病的發病有關。通過大量關聯性分析表明，TNF-a 導致胰島素抵抗的機制之一是脂肪分解增強,FFA釋放增多,該基因變異所導致的脂肪分解差異可能是群體 中胰島素抵抗程度變異的機制。
IL-6是一種前炎性細胞因子，它可由多種細胞產生，基礎狀態下血漿中IL-6水平主要來自脂肪組織分 泌，作為一種自分泌、旁分泌和內分泌激素剌激肝細胞生成多種急性時相的蛋白質調節機體免疫，參與體 內的脂肪、葡萄糖等能量代謝，誘導胰島素抵抗，破壞胰島B細胞，在糖尿病發生發展中起著重要作用。 人IL-6基因定位於7p21，全長4.8kb,由5個外顯子，4個內含子組成，mRNA全長1125bp,編碼213個氨 基酸。IL-6是一種多功能細胞因子，參與多種細胞的生長、分化和功能調節，在免疫和炎症反應中具有重 要作用，是機體重要的免疫-神經-內分泌調節因子。近年發現其除可由免疫細胞和免疫輔助細胞產生外， 尚可由非免疫細胞， 一些典型的內分泌細胞，如脂肪細胞等分泌，且在糖脂代謝中起作用，現認為其是一 種具有內分泌性質的細胞因子，可能導致胰島素抵抗。IL-6基因具有許多單核苷酸多態性位點例如啟動子區位點G572C、 G573C、 C634G、 G174C、 G597A等；IL-6基因還有許多5'側翼區域及3'側翼區域數目 變異串聯重複等多態性。 一些報導認為，IL-6基因調節區-174位的G/C變異(rsl800795)可能改變IL-6 的轉錄，是導致血清與組織中IL-6高水平表達的主要原因，並且可能影響機體胰島素的抵抗性，從而與 糖尿病的發病有關。發明內容基於編碼脂聯蛋白的C1Q和膠原結構域(ADIP0Q)、編碼單核細胞和巨噬細胞所產生的腫瘤壞死因子-a (TNF-a)和編碼白細胞介素-6 (IL-6)的三種基因上的3個SNPs位點多態性可用來評估個體胰島素抵 抗遺傳易感性的基礎上，本發明提供一種檢測個體胰島素抵抗遺傳易感性的試劑盒。該試劑盒包括-檢測ADIP0Q基因上rs2241766號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性炎光探針對； 檢測TNF- a基因上rsl800629號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性螢光探針對； 檢測IL-6基因上rsl800795號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性螢光探針對； 螢光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩沖液、去離子水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對ADIPOQ基因上rs2241766號SNP位點、TNF-a基因上 rsl800629號SNP位點、IL-6基因上rsl800795號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含這3個SNPs位 點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有 SEQ ID NO: 1和2、 3和4、 5和6所示序列的引物對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。本領 域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限於這二對引物。本試劑盒中所述的特異性炎光探針對是指針對過ADIPOQ基因上rs2241766號SNP位點、TNF-a基因 上rsl800629號SNP位點、IL-6基因上rsl800795號SNP位點而設計，能通過螢光定量PCR技術特異性檢 測出這3個SNPs位點基因型的Taqman探針對。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地， 試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 7和8、 9和10、 11和12所示序列的Taqraan探針對。特異性螢光探針對 可用常規的探針合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特異性螢光T叫man探針對不 限於這三對探針，所有可用於螢光定量PCR法檢測本發明中所述用來評估個體胰島素抵抗遺傳易感性的3 個SNPs位點的探針均在本發明範圍內。本發明試劑盒的組分和含量包括3fd 10 X螢光定量PCR反應緩衝液，0. 3nl 25mM dNTP混合液，L8nl 25raM MgCl2溶液，0.075(il (5units/nl) Taq DNA聚合酶，20(iM特異性引物對每條引物各0.225nl，lOfiM特異性螢光探針對每條探針各0.25nl，去離子水15.975(il。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例1.檢激試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:螢光定量PCR反應使用可個體抗氧化遺傳易感性的螢光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和螢光探針對-有義引物l: 5' - TTCTACTGCTATTAGCTC -3' (SEQ ID NO: 1) 反義引物1: 5' - CTTGAGTCGTGGTTT -3' (SEQ ID NO: 2) 有義引物2: 5' - GAGGCMTAGGTTTTGAGGG -3' (SEQ ID NO: 3) 反義引物2: 5' - GGACCCTGGAGGCTGM _3' (SEQ ID NO: 4) 有義引物3: 5' - ACTTTTCCCCCTAGTTG _3' (SEQ ID NO: 5) 反義引物3: 5' — TGTGCMTGTGACGTC -3' (SEQ ID NO: 6) 帶VIC螢光基團探針l: 5' - CGGgCATGAC -3' (SEQ ID NO: 7) 帶FAM螢光基團探針l: 5' - CGGtCATGAC -3' (SEQ ID NO: 8) 帶VIC螢光基團探針2: 5' - CATGaGGACGG -3' (SEQ ID NO: 9) 帶FAM螢光基團探針2: 5' — CATGgGGACG -3' (SEQ ID NO: 10) 帶VIC螢光基團探針3: 5' - CTTGCcATGCTAAA -3' (SEQ ID NO: 11) 帶FAM螢光基團探針3: 5' - CTTGCgATGCTAAA-3' (SEQ ID NO: 12)有義引物1,反義引物1、帶VIC螢光基團探針1、帶FAM螢光基團探針1特異地針對檢測ADIPOQ基 因上rs2241766號SNP位點多態性；有義引物2，反義引物2、帶VIC螢光基團探針2、帶FAM螢光基團探針2特異地針對檢測TNF- a基 因上rsl800629號SNP位點多態性；有義引物3，反義引物3、帶VIC螢光基團探針3、帶FAM螢光基團探針3特異地針對檢測IL-6基因 上rs 1800795號SNP位點多態性；3個SNPs位點分別進行3次獨立的螢光定量PCR反應，每個反應的體系為總體積10nl，包含濃度為 20ng/pl的DNA模板2nl、 l^il 10 X螢光定量PCR反應緩衝液、0. lpl 25mM dNTP混合液、0. 6^1 25mM MgCh 溶液、0.025nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20pM的有義引物和反義引物各0. 225jil、 10一的帶VIC 螢光探針和帶FAM螢光探針各0. 25nl，去離子水5. 325^1。在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50'C、 2分鐘，95'C、 10分鐘，進行60個循環的 95'C、 30秒，6(TC、 l分鐘。反應結束後在ABI7900型螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光呈。步驟3: SNP基因型分析熟悉螢光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識螢光定量PCR儀上顯示的最終樣品螢光量，根 據不同序列探針VIC和FAM螢光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行個體胰島素抵抗遺傳易感性檢測的服務 步驟l: DNA提取由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔採樣拭進行口腔上皮細胞取樣，採用矽膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的ADIP0Q基因上rs2241766號SNP位點、TNF-a 基因上rsl800629號SNP位點、IL-6基閔上rsl800795號SNP位點分別進行螢光定量PCR檢測，確定這3 個SNPs位點的基因型。步驟3:個體胰島素抵抗遺傳易感性的分析通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具個體胰島素抵抗遺傳易感性的分析報告單。報告中詳細說 明了被檢測者胰島素抵抗遺傳易感性的髙低，並由醫師向被檢者詳細說明和解讀個體胰島素抵抗遺傳易感 性分析報告單。序列表<110〉上海主健生物工程有限公司<120〉 一種檢測個體胰島素抵抗遺傳易感性的試劑盒<勝12 1 18 DNA 人工序列引物 <400〉 1TTCTACTGCT ATTAGCTC 18 2 〈211> 15 ■ 人工序列引物 2CTTGAGTCGT GGTTT 15〈210〉 3 20 <212〉腿 人工序列〈223>引物 3GAGGCAATAG GTTTTGAGGG 20 4〈211> 17 DNA <213〉人工序列〈223〉引物 〈400〉 4GGACCCTGGA GGCTGAA<210〉 5 17 ■ 人工序列引物 5ACTTTTCCCC CTAGTTG 6 〈211〉 16 DNA 人工序列〈220〉引物 6TGTGCAATGT GACGTC 7〈211> 10 DNA 人工序列探針〈400〉 7 CGGgCATGAC 8 <211〉 10 <212〉腿 <213〉人工序列<223〉探針<400〉 8CGGtCATGAC 10 9 11 DNA 人工序列探針 9CATGaGGACG G 11 10 10 DNA 人工序列探針 10CATGgGGACG 10<210〉 11 〈211〉 14 DNA 人工序列<220〉<223〉探針 <400〉 11CTTGCcATGC TAAA 14<210〉 12 14 〈212>DNA <213〉人工序列<220〉<223〉探針 <揚12CTTGCgATGC TAAA 1權利要求
1. 一種檢測個體胰島素抵抗遺傳易感性的試劑盒，其特徵在於包括同時檢測編碼脂聯蛋白的C1Q和膠原結構域基因(ADIPOQ)上rs2241766號SNP位點、編碼單核細胞和巨噬細胞所產生的腫瘤壞死因子-α基因(TNF-α)上rs1800629號SNP位點、編碼白細胞介素-6基因(IL-6)上rs1800795號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性引物對是指針對ADIPOQ基因上 rs2241766號SNP位點、TNF- a基因上rsl800629號SNP位點、IL-6基因上rsl800795號SNP位點而設計， 能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性螢光探針對是指針對ADIP0Q基因上 rs2241766號SNP位點、TNF- a基因上rsl800629號SNP位點、IL-6基丙上rsl800795號SNP位點而設計， 能通過螢光定量PCR技術特異性檢測出這3個SNPs位點基閒型的Taqman探針對。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在丁-:所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO: 1和2、 3 和4、 5和6所示序列的引物對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性螢光探針選自具有SEQIDNO: 7和8、 9和10、 11和12所示序列的Taqman探針對。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒的組分和含量包括3nllOX螢光定量PCR反 應緩衝液，0.3一 25mM dNTP混合液，1.8nl 25mM MgC12溶液，0.075pl (5units/nl) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對每條引物各0.225jil，10^M特異性螢光探針對每條探針各0.25nl，去離子水15.975fil。 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測個體胰島素抵抗遺傳易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測編碼脂聯蛋白的C1Q和膠原結構域基因(ADIPOQ)上rs2241766號SNP位點、編碼單核細胞和巨噬細胞所產生的腫瘤壞死因子-α基因(TNF-α)上rs1800629號SNP位點、編碼白細胞介素-6基因(IL-6)上rs1800795號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針對、用於螢光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測與胰島素抵抗遺傳易感性密切相關的ADIPOQ、TNF-α、IL-6三種基因上的單核苷酸多態性位點基因型來評估個體胰島素抵抗遺傳易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101240317SQ20071003716
公開日2008年8月13日 申請日期2007年2月6日 優先權日2007年2月6日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司