基於體外定點突變獲得的油菜抗多種ALS抑制劑類除草劑基因及應用的製作方法
2024-03-01 14:25:15
一、技術領域
本發明涉及一種基於體外定點突變獲得的油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因及應用，屬於生物技術領域。
二、
背景技術：
田間雜草的生長一方面與農作物競爭養分和生長空間，給農作物正常生長發育帶來嚴重影響；另一方面人工除草費時費工增加勞動成本。而現代農業生產中越來越多的依靠化學除草劑來防除雜草。然而，除草劑在殺死雜草的同時往往也對農作物帶來不同程度的危害。因此，培育抗除草劑作物新品種對除草劑的推廣應用和農作物的輕簡化栽培均具有重要的現實意義。
除草劑主要是通過抑制或幹擾植物關鍵的代謝過程而抑制植物生長或殺死植物。以胺基酸生物合成過程中的關鍵酶為靶標，是研發新型高效除草劑的一個重要方向和熱點，已成功開發的除草劑的靶酶有乙醯乳酸合成酶、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)和穀氨醯胺合成酶(gs)等。美國孟山都(monsanto)公司以epsps為靶酶開發的有機磷除草劑草甘膦，自1974年在美國註冊登記以來，因其廣譜、高效、低毒、易分解、低殘留和對環境相對安全等優點在全球100多個國家得到應用。德國hoechst公司以gs為靶酶開發的有機磷除草劑草銨膦在歐洲及北美被廣泛使用。
而以乙醯乳酸合成酶(als)為靶酶開發的除草劑，己經成為新型高效除草劑的主流產品。als是催化分支胺基酸如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成第一步的酶。als抑制劑類除草劑能抑制植物細胞內的als酶活性，阻礙支鏈胺基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)生物合成，從而抑制植物細胞的分裂和生長。1961年美國杜邦(dupont)公司首先報導了嘧啶類化合物的活性及對植物體內als酶的抑制作用，1982年該公司成功研發了第一個磺醯脲類除草劑氯磺隆(chlorsulfuron)。繼氯磺隆研發成功以來眾多國際化學公司以als為靶酶相繼開發成功了咪唑啉酮類、磺醯胺類、嘧啶水楊酸類和三唑嘧啶磺醯胺類除草劑，具體的除草劑品種和商品名更是不計其數。以als為靶酶開發的除草劑具有選擇性強、殺草譜廣，活性高、使用劑量低，對哺乳動物毒性小等優點，既可作土壤處理劑也可莖葉噴施，因其除草效率高、使用方便深得廣大用戶歡迎。該類除草劑作用位點單一，長期使用極易讓雜草產生抗藥性，但同時也為誘變作物產生抗性、為選育非轉基因抗除草劑品種提供了便利。
利用傳統誘變技術如化學誘變劑處理種子可以誘導植物細胞als基因的鹼基發生點突變，進而導致als酶蛋白的胺基酸發生替換，而變得對除草劑不在敏感。而更多的抗als類除草劑基因是來自一些雜草。由於大量使用這類除草劑，使得抗該als類除草劑的抗性生物型雜草數量急劇增加，據不完全統計全球30多個國家已經發現抗als抑制劑類除草劑的雜草生物型有98種，其中雙子葉雜草68種，單子葉雜草30種，已成為產生抗性雜草最為嚴重的一類除草劑。研究表明抗als抑制劑類除草劑的雜草生物型中絕大多數是有靶標基因發生位點突變產生的。
如als酶蛋白第122位點(均以模式植物擬南芥als胺基酸位點計算)的丙氨酸被纈氨酸取代，對咪唑啉酮類除草劑產生抗性；第197位點的脯氨酸被組氨酸、或蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、穀氨醯胺取代，對磺醯脲類除草劑產生
迄今為止，在已經發現的als基因中，有8個位點，總計約26個胺基酸的替換突變會對相應的除草劑產生抗性。這8個位點分別是：ala122、pro197、ala205、asp376、arg377、trp574、ser653、gly654，這些位點所標註的數值均是相對於模式植物擬南芥的als酶蛋白胺基酸序列的位置。
除草劑抗性基因在培育抗除草劑農作物中得到廣泛的應用。人們通過各種途徑或技術手段分離獲得除草劑抗性基因並轉入到各種經濟農作物中，以獲得抗除草劑的農作物新品種。
目前在油菜中報導的als基因突變位點比較少，僅限於197位、574和653位的胺基酸替換。swanson等通過誘變劑乙基亞硝基脲誘變油菜小孢子，選擇獲得了對咪唑啉酮類除草劑具有抗性的油菜pl(或記為pml)和p2(或記為pm2)。p1的抗性突變位點為bnalsl的ser653asp，p2的抗性突變位點是bnals3的trp574leu，p2的抗性水平比p1高。目前國外已商業化的抗咪唑啉酮clearfield油菜都是由這2個突變體轉育而成。
江蘇省農業科學院在油菜和大豆多年輪作的試驗田中發現了1株抗咪唑啉酮類除草劑油菜，培育出抗性穩定的株系m9，該抗性株系的突變位點是bnalsl基因的ser653asp突變。華中農業大學報導從油菜ems突變後代群體中鑑定出幾株抗除草劑苯磺隆的突變體，測序表明它們的突變位點均為bnals3的pro197ser/leu突變。胡勝武等報導通過ems誘變甘藍型油菜中雙9，獲得3株抗除草劑突變體k1、k4、k5。發現抗除草劑突變體k1和k4是由於als基因中第535位c鹼基突變為t，導致其編碼的bnals3蛋白第197位胺基酸由pro突變為ser；而k5則是bnalsl基因序列第544位c突變為t，導致其編碼的bnalsl蛋白發生了pro197ser的改變。
這些部位的改變僅賦予油菜對咪唑啉酮類、磺醯脲類除草劑的抗性，對其它als抑制劑類除草劑則不具抗性。油菜als基因突變多是利用化學誘變劑處理油菜種子，然後篩選抗除草劑突變體，並進一步鑑定抗除草劑突變體的基因型。鑑於誘變具有隨機性，需要篩選大量的種子，工作量比較大。如果能在體外進行定點突變，並通過轉基因途徑驗證突變基因功能，再利用現代的基因編輯技術將突變基因敲入到油菜染色體組中，這樣就可以較快且較精準地獲得新的抗除草劑油菜。
本課題組曾育成抗除草劑油菜種質系m342,抗除草劑油菜m342的als3基因上，存在一個突變位點，即位於核苷酸序列第1667位鹼基由g突變成t，導致其編碼的als蛋白胺基酸序列在556位由色氨酸(w)變成亮氨酸(l)，因此，m342對咪唑啉酮類、磺醯脲類除草劑具有明顯抗性。
三、
技術實現要素：
1、技術問題
本發明旨在油菜已知als3基因序列的基礎上，通過設計pcr引物在特殊位點上引入鹼基突變，再利用重疊pcr技術，最終目的是創造新的點突變位點，探討體外突變在創造油菜新的抗除草劑基因的可行性。
2、技術方案
一種基於體外定點突變獲得油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因，其特徵在於，該基因mals3是利用體外定點突變技術獲得的，是在已經克隆的抗除草劑油菜m342的als3基因序列中引入一個新的突變位點，該位點位於als3基因的第560位，原來是c鹼基，編碼187位的丙氨酸，經突變成t鹼基後則在187位變成了纈氨酸，該基因mals3序列為：seqidno.1。
所述一種基於體外定點突變獲得油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因mals3的應用，是指所述油菜抗多種als除草劑基因mals3在植物抗als除草劑方面的應用，尤其是指所述油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因mals3在植物抗als抑制劑類除草劑方面的應用。als抑制劑類除草劑是指所述als抑制劑類除草劑，是指咪唑啉酮類、磺醯脲類、三唑嘧啶磺醯胺類或嘧啶水揚酸類除草劑，尤其是指咪唑乙醯胺、苯磺隆、雙氟磺醯胺或雙草醚除草劑。
所述的應用，具體是指所述油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因mals3在擬南芥抗als抑制劑類除草劑方面的應用，具體為：
1)引物設計：
2)抗除草劑油菜als3基因克隆：以抗除草劑油菜m342基因組dna為模板，用引物對alsf/alsr及高保真dna聚合酶擴增油菜的als3基因；
擴增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm35-s-alsf1μl，10μmalsr1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補足ddh2o到50μl；
溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec，58℃，30sec，72℃2min，35個循環後，72℃，5min，瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物，膠回收純化2kb的pcr產物並克隆到peasy-t1載體上經測序確定，獲得克隆有抗除草劑油菜m342als3基因的peasy-t1質粒；
3)利用重疊pcr引入鹼基突變
以克隆有抗除草劑油菜m342的als3基因的peasy-t1質粒為模板，分別用引物對alsf/alsrm和alsfm/alsr擴增出上遊片段大小為572bp和下遊片段大小為1412bp；
擴增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm引物取1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補足ddh2o到50μl；
溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35個循環後，72℃，5min。
瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物分別回收大小約572bp和1412bp的上、下遊pcr產物。後以上、下遊產物的混合物為模板，用引物對alsf/alsr擴增出全長的als3基因序列。
擴增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm引物取1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補足ddh2o到50μl；
溫度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35個循環，72℃，5min。
瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物分別回收大小約2000bp的片段，然後克隆到peasy-t1上，並測序分析，該產物序列除了在560處引入了點突變c/t外，其餘鹼基序列與m342的als3基因序列完全一致，定名為mals3；
4)植物表達載體構建：以載體pcambia2300質粒dna為模板，分別用引物對p0390-35sf/35sr和als-nosf/nosp0390r擴增35s啟動子序列(約450bp)和nos終止子序列(約250bp)，膠回收相應大小的pcr產物；
以克隆有mals3基因的peasy-t1質粒為模板，用引物對35s-alsf/alsr擴增mals3基因，膠回收大小約2000bp的pcr產物，通過重組反應克隆到smali酶切線性化的pcambia0390載體上。反應體系如下：5×cemultisbuffer4μl，mals3pcr產物2μl，35spcr產物2μl，nospcr產物2μl，exnasetm2μl，線性化載體4μl,ddh2o2μl，於37℃下反應30min，後取5-10μl反應液轉化大腸桿菌dh5α，挑克隆pcr鑑定，抽提質粒酶切鑑定，最終經測序確定後，由此獲得的質粒定名為p0390-mals3；
5)擬南芥轉化:用上述獲得的植物表達載體質粒p0390-mals3轉化農桿菌gv3101，採用農桿菌液浸花的方法轉化擬南芥；
6)抗除草劑擬南芥植株的篩選：播種經農桿菌gv3101(含質粒p0390-mals3)轉化處理的擬南芥t0代種子，在苗期進行als抑制劑類除草劑的抗性鑑定，經過除草劑篩選，獲得抗除草劑植株。其中所述als抑制劑類除草劑是指所述als抑制劑類除草劑是指咪唑啉酮類、磺醯脲類、三唑嘧啶磺醯胺類或嘧啶水揚酸類除草劑，尤其是指咪唑乙醯胺、苯磺隆、雙氟磺醯胺或雙草醚除草劑。
3、有益效果
迄今為止，在已經發現的als基因中，有8個位點，總計約26個胺基酸的替換突變會對相應的除草劑產生抗性。這8個位點分別是：ala122、pro197、ala205、asp376、arg377、trp574、ser653、gly654，這些位點所標註的數值均是相對於模式植物擬南芥的als酶蛋白胺基酸序列的位置。目前在油菜中報導的als基因突變位點比較少，僅限於197位、574和653位的胺基酸替換。這些部位的改變僅賦予油菜對咪唑啉酮類、磺醯脲類除草劑的抗性，對其它als抑制劑類除草劑則不具抗性。油菜als基因突變多是利用化學誘變劑處理油菜種子，然後篩選抗除草劑突變體，並進一步鑑定抗除草劑突變體的基因型。鑑於誘變具有隨機性，需要篩選大量的種子，工作量比較大。如果能篩選到位點進行體外突變，並通過轉基因途徑驗證確定突變基因功能，再利用現代的基因編輯技術將突變基因敲入到油菜染色體組中，這樣就可以較快地獲得新的抗除草劑油菜。
抗除草劑油菜m342的als3基因上，存在一個突變位點，即位於核苷酸序列第1667位鹼基由g突變成t，導致其編碼的als蛋白胺基酸序列在556位由色氨酸(w)變成亮氨酸(l)，因此，m342對咪唑啉酮類、磺醯脲類除草劑具有明顯抗性。本發明在抗除草劑油菜m342的als3基因上，引入第二個突變位點，探討體外突變在創造油菜新的抗除草劑基因的可行性，通過引物設計在特殊位點上引入鹼基突變，再利用重疊pcr技術，最終目的是創造新的點突變位點。
本發明通過大量試驗篩選到抗除草劑油菜m342的als3基因的核苷酸序列第560處，將鹼基c突變為t，使其編碼的蛋白質序列在第187位的丙氨酸(a)突變成纈氨酸(v)。通過轉基因技術驗證突變基因對als抑制劑類除草劑的抗性。我們發現突變後的als3基因具有2個突變位點，分別是a187v和w556l。除了對咪唑啉酮類、磺醯脲類除草劑具有抗性外，該雙突變位點的基因對三唑嘧啶磺醯胺類和嘧啶水揚酸類除草劑也不再敏感，本發明為創造油菜新的抗除草劑基因提供了一種途徑，並獲得一個具有2個突變位點的抗als抑制劑類除草劑的基因，也為新的抗除草劑基因的應用奠定了實驗基礎。
本發明應用體外定點突變技術獲得一個具有雙突變位點即a187v和w556l的油菜mals3基因，該雙突變位在油菜基因組中尚未見文獻報導。經過轉基因擬南芥初步的功能驗證，結果表明含此雙突變位點的油菜mals3基因對除草劑等多種als抑制劑類除草劑咪唑啉酮類(咪唑乙醯胺)、磺醯脲類(苯磺隆)、三唑嘧啶磺醯胺類(雙氟磺醯胺)和嘧啶水揚酸類(雙草醚)具有明顯的抗性。該抗性基因可用於抗除草劑農作物的培育。
四、附圖說明
圖1.突變位點示意圖。
mutatedals、m342和z11526.1分別指定點突變後的als基因、m342的als基因和序列號為z11526.1的als3基因的局部鹼基序列；mutatedprotein和wildalsprotein為點突變後翻譯的als蛋白的胺基酸序列。其中靠近5』端的突變位點是新引入的突變位點，3』端的突變位點是m342原來具有的突變位點。
圖2.重疊pcr的電泳結果。
第1欄為分子量標記(mkd2000:1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)，第2欄為基因5』端的大小約為570bp的pcr產物，第3欄為3』末大小約為1400bp的pcr產物，第4欄重疊pcr的最終產物也即為全長的pcr產物，大小約為1960bp的目標片段。
圖3.所克隆的經點突變的bnmals3基因核甘酸序列及其編碼蛋白的胺基酸序列。
其中紅色部分為編碼als蛋白質的突變位點。
圖4.轉基因抗除草劑擬南芥的分子鑑定pcr產物。
第1欄是dna標記mgenstar,d2000plus(5000,3000,2000,1000,750,500,250,100)，第2、3、4欄分別是als3和35s、和nos終止子的pcr產物。
圖5.pp0390-alsmncoi和smai酶切圖譜。
mgenstar,d2000plus(5000,3000,2000,1000,750,500,250,100)
圖6.除草劑篩選獲得的轉基因擬南芥。
圖7.轉基因擬南芥植株的pcr鑑定結果。
圖8.轉基因擬南芥核酸雜交驗證結果。
第1欄是dna分子量標記，第2欄為陰性對照,第3-10是轉基因擬南芥植株基因組dna，第11欄是質粒。
圖9.噴咪唑啉酮類除草劑咪唑乙醯胺效果。
圖10.噴磺醯脲類除草劑苯磺隆效果。
圖11.噴三唑咪啶磺胺類除草劑雙氟磺草胺效果。
圖12.噴嘧啶水揚酸類除草劑雙草醚效果。
五、具體實施方式
(一)材料與方法：
1材料：
1.1抗除草劑甘藍型油菜品系m342(見授權專利zl201310111739.5一種甘藍型油菜抗磺醯脲類除草劑基因及其應用)，系江蘇省農科院經濟作物研究所油菜研究室通過ems誘變獲得，研究證明該品系對磺醯脲類除草劑具有抗性。因其als3基因在1667位的鹼基發生點突變，由原來的g鹼基突變成了t鹼基，導致編碼的蛋白質序列在556位點由色氨酸(w)突變為亮氨酸(l)，即w556l。(見授權專利zl201310111739.5)
1.2fastpfudna聚合酶、克隆載體peasy-t1、tagdna聚合酶、質粒提取、膠回收試劑盒購自南京百斯凱生物技術有限公司，重組克隆試劑盒clonexpresstm，pcrmix購自南京諾唯贊生物科技有限公司。southern雜交試劑盒pcrdigprobesynthesiskit和地高辛雜交檢測試劑盒ii均購自roche公司。農桿菌gv3101系公知公用。
1.3.pcambia0390(genbankno.af234291.1)和pcambia2300(genbankno.af234315.1)質粒系澳大利亞pcambia公司惠贈。(均為公開序列，可以購買。)
2方法
2.1引物設計：應用primerpremier5.0軟體分別依據模板序列設計各類引物。用於構建植物表達載體的引物則根據clonexpresstm快速克隆原理，在擴增引物5』末端添加15個bp與連接片段末端同源的序列(小寫字母為同源序列)(見引物序列表1)。通過重組酶反應將目的基因序列整合到載體中。
2.2.抗除草劑油菜als基因克隆：以抗除草劑油菜m342基因組dna為模板，用引物對alsf/alsr及高保真dna聚合酶擴增油菜的als3基因；擴增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm35-s-alsf1μl，10μmalsr1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補足ddh2o到50μl；溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec，58℃，30sec，72℃2min，35個循環後，72℃，5min，瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物，膠回收純化2kb的pcr產物並克隆到peasy-t1載體上經測序確定，獲得克隆有抗除草劑油菜m342als3基因的peasy-t1質粒；
2.3利用重疊pcr引入鹼基突變：
迄今為止，在已經發現的als基因中，有8個位點，總計約26個胺基酸的替換突變會對相應的除草劑產生抗性。這8個位點分別是：ala122、pro197、ala205、asp376、arg377、trp574、ser653、gly654，這些位點所標註的數值均是相對於模式植物擬南芥的als酶蛋白胺基酸序列的位置。目前在油菜中報導的als基因突變位點比較少，僅限於197位、574和653位的胺基酸替換。這些部位的改變僅賦予油菜對咪唑啉酮類、磺醯脲類除草劑的抗性，對其它als抑制劑類除草劑則不具抗性。油菜als基因突變多是利用化學誘變劑處理油菜種子，然後篩選抗除草劑突變體，並進一步鑑定抗除草劑突變體的基因型。鑑於誘變具有隨機性，需要篩選大量的種子，工作量比較大。如果能在體外進行定點突變，並通過轉基因途徑驗證突變基因功能，再利用現代的基因編輯技術將突變基因敲入到油菜染色體組中，這樣就可以較快地獲得新的抗除草劑油菜。
抗除草劑油菜m342的als3基因上，存在一個突變位點，即位於核苷酸序列第1667位鹼基由g突變成t，導致其編碼的als蛋白胺基酸序列在556位由色氨酸(w)變成亮氨酸(l)，因此，m342對咪唑啉酮類、磺醯脲類除草劑具有明顯抗性。本發明在抗除草劑油菜m342的als3基因上，引入第二個突變位點，探討體外突變在創造油菜新的抗除草劑基因的可行性，通過引物設計在特殊位點上引入鹼基突變，再利用重疊pcr技術，最終目的是創造新的點突變位點。
經過與多種植物的als基因的核酸序列和編碼的胺基酸序列比對分析，本發明嘗試找到油菜的als3基因的核苷酸序列第560位鹼基由c突變成t，對應的als酶蛋白第187位點，該位點原來編碼的是丙氨酸(a)，現通過生物技術實驗將其突變成纈氨酸(v)。
根據序列測定結果，設計2對特異性引物旨在als基因編碼區的560位將c鹼基替換成t鹼基。以克隆有抗除草劑油菜m342的als3基因的peasy-t1質粒為模板，分別用引物對alsf/alsrm和alsfm/alsr擴增出上遊片段(大小為572bp)和下遊片段(大小為1412bp)；
擴增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm引物取1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補足ddh2o到50μl；
溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35個循環後，72℃，5min。
瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物分別回收大小約572bp和1412bp的上、下遊pcr產物。後以上、下遊產物的混合物為模板，用引物對alsf/alsr擴增出全長的als3基因序列。
擴增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm引物取1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補足ddh2o到50μl；
溫度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35個循環，72℃，5min。
瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物分別回收大小約2000bp的片段，然後克隆到peasy-t1上，並測序分析，該產物序列除了在560處引入了點突變c/t外，其餘鹼基序列與m342的als3基因序列完全一致，定名為mals3；
分別用引物對alsf/alsrm和alsfm/alsr擴增出上遊和下遊2個片段，分別回收後，以上、下遊pcr產物混合物為模板，用全長引物alsf/alsr擴增出全長序列alsm，然後克隆到peasy-t1上，並測序分析。
2.4植物表達載體構建：以載體pcambia2300質粒dna為模板，分別用引物對p0390-35sf/35sr和als-nosf/nosp0390r擴增35s啟動子序列(約450bp)和nos終止子序列(約250bp)，膠回收相應大小的pcr產物；以克隆有mals3基因的peasy-t1質粒為模板，用引物對35s-alsf/alsr擴增mals3基因，膠回收大小約2000bp的pcr產物，通過重組反應克隆到smali酶切線性化的pcambia0390載體上。
反應體系如下：5×cemultisbuffer4μl，mals3pcr產物2μl，35spcr產物2μl，nospcr產物2μl，exnasetm2μl，線性化載體4μl,ddh2o2μl，於37℃下反應30min，後取5-10μl反應液轉化大腸桿菌dh5α，挑克隆pcr鑑定，抽提質粒酶切鑑定，最終經測序確定後，由此獲得的質粒定名為p0390-mals3；
2.5擬南芥轉化採用農桿菌液浸花的方法轉化擬南芥。具體步驟首先用p0390-mals3質粒轉化農桿菌gv3101，挑取轉化農桿菌gv3101單克隆於5ml添加了利福平10mg/l、慶大黴素50mg/l、卡那黴素25mg/l的yeb液體培養基中，28℃搖床培養過夜。取1ml菌培養液於50ml相同培養基中再培養過夜至od600為0.8～1.0，離心，收集菌體，用ms液體培養基洗滌菌體1次，離心，菌體重新懸浮於ms液體培養基中，od600值在0.8左右。並加入silwetl-77至0.01％，混勻。每株花序浸泡1分鐘，處理10株，一周後，重複處理一次。成熟時收穫種子，日光下曬乾。
2.6抗除草劑擬南芥植株的篩選將收穫到的種子播種於含有蛭石和營養土(2：1)的小盆缽中，於光照培養箱中培養。培養條件光照16h,溫度22℃，黑暗8h，溫度18℃。待種子萌發至子葉展平時，於葉面噴施15μg/ml的苯磺隆溶液，由此篩選轉基因抗除草劑苯磺隆的t0代植株。讓t0植株繼續生長至開花結籽。將收穫到的t0代植株上的種子播種在盆缽中，即為t1代植株。待子葉展平後，再用15μg/ml的苯磺隆溶液噴施，篩選抗除草劑植株。讓抗性植物繼續生長至10餘片真葉時，分別噴施咪唑乙醯胺(166.67μg/ml)、苯磺隆(15μg/ml)、雙氟磺醯胺(4.15μg/ml)和雙草醚(10μg/ml)，進行各種als抑制劑類除草劑的抗性鑑定。
2.7轉基因抗除草劑擬南芥的分子鑑定：取抗除草劑轉基因擬南芥植株的葉片用ctab方法提取基因組dna，進行pcr鑑定和southern雜交鑑定。pcr鑑定的擴增體系是：2×pcrmix10μl，引物saf和sar各1l，去離子水7μl，dna模板1μl。溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃35sec，35個循環後，72℃，5min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物。southern雜交鑑定探針為螢光標記的35s啟動子序列，探針長度為454bp。雜交實驗按照試劑盒說明書進行。
3.結果
3.1.體外定點突變als3基因克隆與分析
本實驗目的是利用體外定點突變技術在已經克隆的抗除草劑油菜m342的als3基因序列中引入一個新的突變位點。如圖1所示。該位點位於als3基因的第560位，原來是c鹼基，編碼187位的丙氨酸，經突變成t鹼基後則在187位變成了纈氨酸。我們通過在相應區域設計特定的含有突變鹼基t的pcr引物擴增目的基因片段引入突變，使其突變後的鹼基由c變成t。經體外突變的als3基因定名為mals3。
經克隆、測序，mals3序列除了在560處引入的點突變(c/t)外其它的鹼基序列與m342的als3基因序列完全一致。利用ncbi網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析mals3基因的序列結構，結果顯示，該基因編碼區全長由1959bp組成，編碼652個胺基酸(圖3)。其中masl3基因序列與z11526.1的基因序列亦顯示高度同源，但存在4個snp位點的差異：其中2個snp導致編碼蛋白質序列的改變,分別是560鹼基序列由c變為t，導致187位的丙氨酸突變成了纈氨酸(a187v)該位點為新引入的突變位點，和第1667位鹼基g變為t，導致als蛋白質第556位的色氨酸突變為了亮氨酸(w556l)，為m342原有的突變位點。
3.2植物表達載體構建
為進一步驗證經過體外突變獲得的雙位點突變基因抗als抑制劑類除草劑的功能，本研究將pcr獲得的mals3基因序列(1959bp)、35s啟動子序列(454bp)和nos終止子序列(253bp)(圖4)，利用重組克隆技術，克隆到了pcambia0390的smali位點，獲得的植物表達載體，初步命名為p0390-mals3。該質粒dna經限制性內切酶smali切可以獲得由35s、mals編碼序列nos終止子組成的大小為2993bp的片段，見圖5。並經過測序進一步驗證各目的片段連接正確。
3.3轉基因擬南芥篩選與鑑定
經過除草劑篩選，初步獲得9個抗除草劑擬南芥株系(圖5)。並進一步用特異性引物對其基因組dna進行了pcr鑑定。本實驗設計了高度特異性引物對，上、下遊引物分別取自35s啟動子3』末端序列和mals3基因5』末端序列，pcr擴增產物預期大小為374bp。經檢測所有經除草劑苯磺隆篩選到的陽性植株均可以擴增出相應大小的pcr產物(圖6)。
3.4轉基因擬南芥核酸雜交驗證結果
進一步驗證轉基因抗除草劑擬南芥是真正的轉基因擬南芥，本實驗對其進行了核酸雜交實驗，結果也證明獲得的抗除草劑擬南芥均為轉基因擬南芥。雜交結果見圖8。
3.5轉基因擬南芥抗除草劑特性驗證
為檢驗轉mals3基因擬南芥抗除草劑特性，我們在擬南芥苗期(10張葉片期)依此應用4種als抑制劑類除草噴霧葉片。結果見圖9-12。
噴咪唑啉酮類除草劑效果:見圖9,上為轉基因苗,下為非轉基因對照。左上下為噴水處理，右上下為噴除草劑處理。本實驗噴除草劑咪唑乙醯胺，濃度為田間使用濃度，換算成有效濃度為166.67μg/ml。實驗結果顯示，非轉基因擬南芥在噴除草劑後死亡,而轉基因擬南芥能正常生長,表明轉基因擬南芥對咪唑啉酮類除草劑具有明顯抗性。
噴磺醯脲類除草劑效果:見圖10,上為轉基因苗,下為非轉基因對照。左上下為噴水處理，右上下為噴除草劑處理。本實驗噴除草劑苯磺隆，濃度為田間使用濃度，換算成有效濃度為15μg/ml。實驗結果顯示，非轉基因擬南芥在噴除草劑後死亡,而轉基因擬南芥能正常生長,表明轉基因擬南芥對磺醯脲類除草劑具有明顯抗性。
噴三唑嘧啶磺醯胺類除草劑效果:見圖11,上為轉基因苗,下為非轉基因對照。左上下為噴水處理，右上下為噴除草劑處理。本實驗噴除草劑雙氟磺草胺，濃度為田間使用濃度，換算成有效濃度為4.15μg/ml。實驗結果顯示，非轉基因擬南芥在噴除草劑後死亡,而轉基因擬南芥能正常生長,表明轉基因擬南芥對三唑嘧啶磺醯胺類除草劑具有明顯抗性。
噴嘧啶水揚酸類除草劑效果:見圖12,上為轉基因苗,下為非轉基因對照。左上下為噴水處理，右上下為噴除草劑處理。本實驗噴除草劑雙草醚，該除草劑系嘧啶水揚酸類除草劑，濃度為田間使用濃度，換算成有效濃度為10μg/ml。實驗結果顯示，非轉基因擬南芥在噴除草劑後死亡,而轉基因擬南芥能正常生長,表明轉基因擬南芥對嘧啶水揚酸類除草劑具有明顯抗性。
小結：本發明嘗試應用體外定點突變技術獲得一個具有雙突變位點即a187v和w556l的油菜mals3基因，該雙突變位在油菜基因組中尚未見文獻報導。經過轉基因擬南芥初步的功能驗證，結果表明含此雙突變位點的油菜mals3基因對多種als抑制劑類除草劑咪唑啉酮類(咪唑乙醯胺)、磺醯脲類(苯磺隆)、三唑嘧啶磺醯胺類(雙氟磺醯胺)和嘧啶水揚酸類(雙草醚)具有明顯的抗性。該抗性基因可用於抗除草劑農作物的培育。
seqidno.1:
sequencelisting
江蘇省農業科學院
基於體外定點突變獲得的油菜抗多種als除草劑基因及應用
0
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patentinversion3.3
1
1959
dna
油菜m342
mals3
(1)..(1959)
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