一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法

2024-04-01 08:20:05

專利名稱：一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術，具體地說是一種提高水稻種子Y-氨基丁酸含量的方 法。
背景技術：
Y-氨基丁酸(Y-amino butyric acid，GABA)是廣泛分布於動植物中的一種非蛋 白質胺基酸，是生物體內的天然活性成分。Y-氨基丁酸在動物體內是一種抑制性神經傳遞 物質，能介導中樞神經系統的抑制性神經傳導，系統地對腦血管進行調節。除腦和脊髓外， 已在多種哺乳動物的近30種外周組織中發現Y-氨基丁酸(GABA)的存在。現有技術表明 Y _氨基丁酸(GABA)是生物體內的生理活性成分，具有降血壓、抗焦慮、改善腦機能、增強 長期記憶力的功能。所以Y-氨基丁酸(GABA)是一種很好的醫療藥物及保健品的原料。高 血壓是危害人類健康的常見疾病，近十幾年來發病率逐步升高。現有技術治療高血壓藥物， 效果都不理想。Y「氨基丁酸對於治療和預防高血壓疾病具有獨特的效果和巨大的應用潛 力。水稻是農業生產中的重要糧食作物，也是人類賴以生存的主要食品。水稻種子中 含有數量有限的Y-氨基丁酸，不能滿足人類的保健要求。發明提供一種有效提高水稻 種子中Y-氨基丁酸含量的方法，是非常有意義的。利用這種方法生產的產品，做為種子 使用，具有遺傳功能，可以提高F1代稻穀中的Y -氨基丁酸含量；做為食物，可以充分利用 Y-氨基丁酸(GABA)對人類的降血壓、抗焦慮、改善腦機能、增強長期記憶能力的藥理功 效，促進人類健康，減輕心血管疾病的危害，延長人類壽命。Y -氨基丁酸合成酶(GABA synthase )，也稱為穀氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)，是合成氨基丁酸的關鍵酶。水稻中有多種基因，似似是其 中的一種。日本學者Kazuhito Akama研究發現，在水稻中過量表達AsG^MC 0sGAD2末端 30個胺基酸缺失後，GABA的含量提高了 100倍；證明了胺基酸序列C末端的30個胺基酸會 抑制其自身的活性。這種方法在的缺點是雖然在一定程度上提高了水稻中Y-氨基丁酸 含量，但提高的是其在整個水稻植株中的含量；而且後代會出現矮化，白化，卷葉，不育等嚴 重表型缺陷現象。RT-PCR分析結果，和水稻植株的其它組織相比，GAD2在成熟的種子中表 達量低。本發明利用基因工程方法，將5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列共同轉化水 稻植株，不僅會使GAD2A C30特異地在水稻種子中表達；而且水稻種子中的Y _氨基丁酸 (GABA)含量明顯提高；其後代表型正常。經廣泛查閱國內外出版物，檢索國內外專利文獻，未發現與本發明主題和技術方 案完全相同專利和技術文獻的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種提高水稻種子Y-氨基丁酸含量的方法。本發明涉及水稻種子特異性表達啟動子的克隆、關鍵酶基因序列GAD2A C30的克隆、載體構建、遺傳轉 化、PCR及Western Blot分子檢測、Y -氨基丁酸提取及含量測定，發明了提高水稻種子中 Y 「氨基丁酸GABA含量的方法，為Y -氨基丁酸大規模生產奠定了基礎。本發明是通過以下技術方案實現的
提高水稻種子Y-氨基丁酸含量的方法，包括以下步驟
(1)從越光水稻中克隆5.3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列；
(2)把5.3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列連於表達調控序列，形成含有5. 3kbGtl 啟動子序列和GAD2A C30序列的植物表達載體；
(3)將含5.3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列的植物表達載體轉化到根癌農桿菌， 獲得含有5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列植物表達載體的根癌農桿菌菌株；
(4)將步驟(3)根癌農桿菌遺傳轉化水稻，獲得PCR及WesternBlot檢測陽性的轉基 因水稻植株；
(5)對步驟(4)獲得的轉基因水稻水稻種子中Y-氨基丁酸含量進行HPLC檢測，γ-氨 基丁酸含量顯著提高，後代表型正常。步驟(1)從越光水稻中克隆的GAD2A C30序列是在GAD2基因的cDNA末端缺失 90bp，終止密碼子TAG上遊90bp的一段cDNA序列，編碼胺基酸序列為缺失C末端30個氨 基酸的序列。步驟(2)中5. 3kbGtl啟動子序列末端序列，距最末端一個鹼基600bp處設計一條 上遊特異性引物及一條GAD2A C30序列的下遊特異性引物，PCR方法對所述轉基因水稻進 行分子檢測結果擴增出2013bp大小的特異DNA片段的陽性轉基因水稻植株。步驟(5)所述的HPLC法測定水稻種子中γ-氨基丁酸含量的方法為
(1)色譜柱為Hypersil ODS C18 柱 125mm X 4. Omm , 5ym ；
(2)流動相A醋酸鈉緩衝液的製備方法取醋酸鈉2.72g，三乙胺0.2mL，加水溶解， 冰醋酸調節PH至7. 3，加水至IOOOmL ；
(3)流動相B的製備方法pH值7.2的1. 35%醋酸鈉、乙腈、甲醇重量比為 100 175 225 ；
(4)梯度洗脫0 4min,流動相B的比例從0.5%增加至26%，維持6min後，增加至 100%,維持 7min ；
(5)流速為ImL · rnirT1 ；
(6)檢測波長338nm，柱溫40°C。本發明的要點在於
從日本優質水稻品種越光中克隆5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列，構建含上 述DNA分子的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序 列同時導入越光水稻細胞並再生出水稻植株。PCR檢測目的基因5. 3kbGtl啟動子序列和 GAD2Δ C30序列的整合情況；Western Blot檢測轉基因水稻種子中GAD2 Δ C30蛋白的表達 情況，高效液相色譜測定轉基因水稻中GABA的含量。本發明包括如下具體步驟
(1)根據已有序列設計特異引物克隆越光水稻中5 1力位7啟動子序列和G^iMOO序
列；
4(2)把5.3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列可操作性地連於表達調控序列，形成含 有5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列的植物表達載體；
(3)將含5.3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列的植物表達載體轉化到根癌農桿菌， 獲得含有5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列植物表達載體的根癌農桿菌菌株；
(4)利用所構建的根癌農桿菌遺傳轉化水稻，獲得經PCR及WesternBlot檢測為陽性 的轉基因水稻植株；
(5)對獲得的轉基因水稻植株種子中GABA含量進行HPLC檢測，獲得GABA含量顯著提 高，且後代表型正常的轉基因水稻植株。所述的PCR檢測中，根據5. 3kbGtl啟動子序列末端序列，距最末端一個鹼基600bp 處，設計一條上遊特異性引物，下遊特異性引物則位於GAD2A C30序列上，PCR方法對所述 轉基因水稻進行分子檢測，結果擴增出2013bp大小的特異DNA片段的為陽性轉基因水稻植株。上述高效液相色譜測定GABA含量的方法如下色譜柱為Hypersil ODS C18柱 125mmX4. Omm，5 μ m。流動相A為醋酸鈉緩衝液，製備方法是取醋酸鈉2. 72g，三乙胺 0. 2mL,加水至適量使其溶解，用冰醋酸調節pH至7. 3後，加水至1000mL。流動相B為pH7. 2 的1.35 %醋酸鈉乙腈甲醇=100 175 225，均勻混合。梯度洗脫0 4min，流動 相B的比例從0. 5%增加至26%,維持6min後，增加至100%,維持7min ；流速為ImL .mirT1 ； 檢測波長338nm，柱溫40°C。本發明的5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列共轉化策略提高水稻種子GABA 含量的方法，採用基因工程方法，將5 3kbGtl啟動子序列和似似」序列導入水稻中，獲 得了 GABA高產的轉基因水稻植株。GABA高產的轉基因水稻植株的獲得，可以顯著增加水稻 種子中Y-氨基丁酸的含量，水稻種子中Y-氨基丁酸的含量是非轉化對照水稻種子的8. 3 倍。本發明對提高水稻種子中Y-氨基丁酸含量，低具有重要意義。對於通過食用水稻種 子，增加人體內的Y-氨基丁酸，治療和預防高血壓疾病具有獨特的效果和促進作用。本發明的優點是
1、水稻種子中Y-氨基丁酸的含量增加顯著；
2、本發明水稻種子Y-氨基丁酸的高含量性狀，具有遺傳功能，可以使F1代仍然具有 Y-氨基丁酸的高含量性狀；
3、本發明水稻種子產品對治療和預防人類高血壓疾病有促進作用；
4、方法可靠，便於實施，實用性強。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發明，這些實施例僅用於說明本發明而不用於 限制本發明的。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等 分子克隆實驗室手冊 New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 中所述的 條件；或按照製造廠商所建議的條件。本發明實施例選用日本優質水稻品種「越光」，越光水稻具有病蟲害發生率低，成 熟落黃好，倒伏率很低，穗層整齊，米粒晶瑩透亮的優點。
實施例1
水稻5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列的克隆。1.組織分離(Isolation)
將水稻種子剝去外殼，用75%乙醇浸泡1. 5 min，倒掉酒精，再用0. HgCl2滅菌 10 min,無菌水衝洗5—6次，用無菌吸水紙吸乾表面水分，接種於無激素的MS (Murashige and Skoog, 1962)固體培養基中，25°C、12h / 12h光照培養，即可獲得水稻無菌苗，兩周後， 切取葉片和莖段用於RNA提取。2. RNA 的分離(RNA isolation)
稱取0. 8 g所述的水稻無菌試管苗，用液氮速凍後，迅速用研缽研碎，加入盛有1 mL TRIzol (TRIzol Reagents,GIBCO BRL,USA)的 1.5 mL Eppendorf 管中，充分振蕩後，於 室溫下放置5 min，加200ul氯仿，用力振蕩20sec，室溫放置5 min後，於4°C、12，OOOg離 心15 min。將約500ul上清液吸入乾淨的1. 5 mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇， 顛倒混勻，室溫下放置IOmin後，於4°C、12，OOOg離心10 min ；棄上清，加IOOOul 75%乙 醇清洗，充分振蕩後，於4°C、8，OOOg離心5min ；室溫乾燥20min後溶於40ul RNAase-free 水中。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測定RNA含量。3.基因克隆(Cloning of the genes) 3. 1 5. 3kbGtl啟動子序列的克隆
根據5激力位7啟動子的序列(SEQ ID NO. 1)設計上下遊引物，並在上遊和下遊上分 別引入限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以越光水稻基因組DNA為模板，利用PCR擴 增出5. 3kbGtl啟動子的序列後進行測序。DNA序列測定由上海生工生物工程技術有限公 司採用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與GENBANK中所報導的水稻 5. 3kbGtl啟動子的序列(SEQ ID NO. 1) 一致； 3. 2似似」CJO序列的克隆 3. 2. 1第一鏈cDNA的合成 3.2.2水稻GAD2A C30序列編碼區的PCR擴增
根據所述水稻似似基因的編碼序列(SEQ ID N0. 2)分別設計擴增出其cDNA末 端缺失90bp (終止密碼子TAG上遊90bp)的編碼框的上下遊引物，並在上遊和下遊引物上 分別引入限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴 增後進行測序。DNA序列測定由上海生工生物工程技術有限公司採用3730自動測序儀完 成。測序結果表明，所克隆的序列與GENBANK中所報導的水稻似似(SEQ ID N0. 2)編碼 序列去除cDNA末端90bp —致。本實施例採用基因克隆方法從水稻中獲得序列正確的水稻5. 3kbGtl啟動子序列 和G^iMOO序列，通過基因與種子特異性表達啟動子序列融合構建植物，表達載體遺傳 轉化植物體代謝工程策略，提高水稻種子GABA含量提供了一個在水稻種子中特異性表達 的啟動子序列和一個缺失cDNA末端90bp的關鍵酶基因。實施例2
含5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列的植物表達載體的構建。1.植物表達載體PCAMBIA1304+-5激力兌7的構建
以pBI121和pCAMBIA1304為材料，構建植物表達載體pCAMBIA1304+。具體地，HindIII / EcoRI 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ；回收 pBI121_GUS 表達盒及 pCAMBIA1304 大片段；連接轉化，挑取單克隆菌落抽提質粒酶切驗證。結果表明，植物表達載體 PCAMBIA1304+構建成功。以pCAMBIA1304+為表達載體，將實施例1中5. 3kbGtl啟動子連 於其上。將 Hind III / Xba I 雙酶切 pMD18T_5 3kbGtl 和 pCAMBIA1304+ 回收 5 3kbGtl 和 PCAMBIA1304+大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。2.植物表達載體 pCAMBIA1304+-5 3kbGtl~GAD2A C30 的構建
以上述PCAMBIA1304+-5激力位7為基礎，用實施例1中的GAD2Δ C30替 換pCAMBIA1304+-5激力位7上的基因。具體地將BamH I / Sac I雙酶切 PCAMBIA1304+-5 3kbGtl 和 pMD18T_似似」C30,回收 pCAMBIA1304+_5 3kbGtl 大片段和 GAD2A OO序列小片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。從而獲得 含 5. 3kbGtl 和 GAD2A C30 的植物表達載體 pCAMBIA1304+_5 3kbGtl~GAD2A C30o本實施例將水稻種子中特異表達的啟動子序列5. 3kbGtl及GABA生物合成途徑關 鍵酶基因的修飾基因似似」可操作性地連於表達調控序列，形成含5 3kbGtl啟動子序 列和GAD2A C30序列的植物表達載體，該表達載體可用於通過代謝工程策略來提高水稻種 子GABA含量。實施例3
根癌農桿菌介導5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列遺傳轉化水稻獲得轉基 因水稻植株。 1.含5 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列植物表達載體根癌農桿菌工程菌 的獲得
將實施例2中含5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列的植物表達載體轉入根 癌農桿菌EHA105，並進行PCR驗證。結果表明，含5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2Δ C30序列 植物表達載體己成功構建到根癌農桿菌菌株。 2.根癌農桿菌介導5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2Δ C30序列轉化水稻 2. 1.水稻愈傷組織的誘導 將水稻種子剝去外殼，用75%乙醇浸泡1. 5 min，倒掉酒精，再用0. 1% HgCl2滅 菌10 min，無菌水衝洗5— 6次，用無菌吸水紙吸乾表面水分，接種於MS (Murashige and Skoog,1962)+3mg/L 2，4D固體培養基中，25°C暗培養。10天後，從水稻種子胚的周圍生長 出米黃色的愈傷組織；
2. 2.農桿菌與水稻愈傷組織的共培養
將上述的米黃色的水稻愈傷組織，放入含活化好的根癌農桿菌工程菌的MS懸液 中浸泡15 min，輕輕搖動使愈傷組織與菌液充分接觸；倒出懸液，用無菌吸水紙吸乾表面餘 菌，轉到共培養培養基(MS+ ASlOOymol / L)中，暗培養3d。以浸泡在不帶有根癌農桿菌 的MS液體培養基中的愈傷組織為對照；
2. 3.抗性愈傷組織的篩選和植株再生
將所述的共培養3 d的水稻愈傷組織用無菌水衝洗10次後轉入至IOOml含500mg / L Cef的去離子水中，25°C，120rpm振蕩2hr，棄去水，吸去愈傷組織表面過多的水分。轉移愈 傷組織至選擇培養基MS+3mg/L 2, 4D+250mg / L Cef中，經過4周的選擇培養，轉移正常成 活的愈傷組織至新的選擇培養基中再培養3周，以便進一步篩選抗性愈傷，另外還能夠使具有抗性的愈傷組織得到增殖。經過兩次選擇培養後，轉移那些生長旺盛的愈傷組織至預 分化培養基(MS+1. Omg/L 6-BA+2. Omg / L NAA+5. Omg / L ABA)中，25°C，暗培養 3 周。從 預分化培養基中轉移愈傷組織至分化培養基MS+2.0mg/L 6-BA+l. Omg / L IAA+1. Omg / L NAA中，25°C，每天約14hr光照培養2000lux。3周後看到從愈傷組織上生長出再生苗，將這 些小苗連同其愈傷轉移至生根培養基(1 / 2 MS)中，讓其生根，直至小苗長到三角瓶頂部。 打開三角瓶的封口膜，讓無菌苗適應外界環境1 一 2天；小心地將無菌苗從三角瓶中取出， 立即用自來水洗去根部的培養基。將每株無菌苗分開轉移到含有1/2MS培養液約5cm直徑 大小的塑料培養皿中，放置培養室中，90%的溼度，200C，每天14hr光照4000 Iux培養7_10 天；轉移無菌苗至泥土中進行正常生長。3.轉基因水稻植株的PCR檢測
根據5. 3kbGtl啟動子序列末端序列，距最末端一個鹼基600bp處設計一條上遊 特異性引物，和已有的GAD2A C30序列的下遊引物配對，用PCR方法對所述轉基因水稻進行 分子檢測。結果表明，利用此對特異引物，擴增出2013bp大小的特異DNA片段。而以非轉 化普通水稻基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。這說明5 1力位7啟動子序列和 GAD2Δ C30序列已經整合到水稻基因組中。本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用於轉化水稻的含 5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列的植物表達載體的根癌農桿菌菌株，利用所構建的 根癌農桿菌菌株轉化水稻細胞，獲得經PCR檢測的轉基因水稻。實施例4
利用Western blot檢測GAD2 Δ C30蛋白在轉基因水稻植株中的表達。1.蛋白的提取
1.1 取 KH2PO4 0.2 g/L, Na2HPO4 1. 15 g/L, KCl 0.2 g/L, NaCl 8 g/L 混合均勻，配 制1*PBS溶液；取50 mg新鮮轉基因水稻葉片，加入IOOul 1*PBS，放入1.5ml Eppendorf 管中研磨；
1. 2 13000rpm, 4° C 離心 20 分鐘；
1.3將上清液收集於一新管中，備用；以上過程在冰上進行。2.蛋白定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入Iml Bradford試劑，混勻後，分光光度計測OD595 ；蛋白含量計算1 OD595= 28. 57mg。3. SDS-PAGE分離蛋白SDS_PAGE的製備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989); 3. 1加樣前，將樣品置於含50mmol/L DTT的加樣緩衝液(2*加樣緩衝液甘油2. 4g,
IM Tris-HCl pH6. 8 Iml ；溴酚蘭0. 01%, H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘放置冰上，冷卻後 上樣；
3.2室溫100V電壓下聚丙烯醯胺凝膠電泳，直到指示劑溴酚蘭前沿達到凝膠底部。4.蛋白質向硝酸纖維膜上轉移
4.1 轉移之前，用轉移緩衝液(39 mmol 甘氨酸，48 mmol Tris Base,0. 037% SDS, 20% 甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；
4. 2室溫下用半乾式電轉儀轉移lh，凝膠兩側各墊3層Whatman濾紙。5.硝酸纖維膜上蛋白的檢測
5.1將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37° C緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶於100ml 1*PBS (含0. 5g疊氮鈉)；
5. 2再將濾膜浸泡在洗滌緩衝液中，37° C洗滌兩次，每次15分鐘； 5. 3加入第一抗體抗水稻GAD2的抗體，37° C溫育30分鐘； 5.4同步驟5. 2，洗滌三次；
5. 5加入第二抗體抗兔IgG，37° C溫育30分鐘；同步驟5. 2，洗滌兩次； 5. 6加入底物顯色觀察蛋白條帶。實施例5
利用HPLC測定轉基因水稻種子中GABA含量。5.1.樣品製備
準確稱取5 g轉基因水稻種子樣品於250mL三角瓶中，加入乙醇-水(體積比為 60 40)溶液30 mL於70°C水浴中回流兩次(每次30 min)，合併提取液並濃縮至一定 體積，經0. 45 μ m濾膜過濾後-20°c保存。5. 2.色譜條件及系統適用性以及標準溶液的配製
色譜柱為Hypersil ODS C18柱(125_ X4. Omm，5 μ m)；流動相A為醋酸鈉緩衝液 (取醋酸鈉2. 72g,三乙胺0. 2mL,加水至適量使溶解，用冰醋酸調節pH至7. 3後，加水 至IOOOmL)；流動相B為1.35%醋酸鈉(pH7. 2)-乙腈-甲醇(100 175 225)；梯度洗 脫0 4min，流動相B的比例從0.5 %增加至26 %，維持6min後，增加至100%，維持 7min ；流速為ImL · min—1 ；檢測波長338nm,柱溫40 °C ；
取GABA標準品約10. 5mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，搖 勻，作為對照品溶液；
為了使被測品可做高靈敏度螢光檢測，本法採用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生測定的方 法，而且OPA本身不幹擾分離與檢測，不必除去過量試劑，色譜圖基線比較平穩，其靈敏 度比茚三酮法高出10倍。按上述的色譜條件洗脫，GABA的出峰時間為6.24min，峰型良好。5.3.標準曲線的製作
將所述對照品溶液分別取lul，3ul，5ul，8ul，10ul，在上述色譜條件下進樣，記錄圖譜 及色譜參數，分別以峰面積⑴對標準品濃度(χ)進行回歸分析，製作標準曲線。5. 4.樣品GABA含量的測定
將5. 1中-20°C保存的樣品各取IOul加樣檢測，記錄各組分峰面積，代入線性回歸方 程，計算即得樣品GABA含量。在本發明中共轉5. 3kbGtl啟動子序列和GAD2A C30序列顯著提高水稻種子中 GABA含量。共轉5 3kbGtl啟動子序列和似似」序列的水稻種子中GABA平均含量是非 轉化普通種子的8. 3倍，且後代表型正常。本實施例採用HPLC法測定了轉基因水稻種子中GABA含量。採用共轉化5. 3kbGtl 啟動子序列和GAD2A C30序列的代謝工程策略獲得了 GABA高產的水稻植株，為提高水稻種 子中GABA含量提供了一種理想方法。上述實施例僅為本發明的優選例，並不用來限制本發明，凡在本發明的原則之內， 所做的任何修改和變化，均在本發明的保護範圍之內。本發明涉及的序列及記號分列如下 SEQ ID NO. 1的信息
9上海師範大學
一種提高水稻種子Y-氨基丁酸含量的方法 1
PatentIn version 3.3 1 5391 DNA
水稻(Oryza sativa) 1
tctccgggtcatcgataggtggggcccacctattggccccttcttcctccttagccggt60cagcaaccgcCgCCgCCtgCcccaaccaccgacattattttagttatattggtggtcgaa120atttgtctataacgaccgtcaacactccacacgaacccggcgagcgcctcgaacatcgtg180ggcgcgcgcccactgccaccgccgtcgaccgcgacgagcgccttgacatggacgatgggc240tcggacgtgaaccggaacgacctatgcaggagcggctccctcagtgcatcaccggtggcg300gcatcgtcgtCggCtgCCgtgaagtagtagacggtctgcacaacgatggcgatgttctgg360tcgaggttggagaggtagtagagaccacccttcgtctccgccgctggcaccaccagggtt420ggtacccctcgcttcactccaagctccacggcggcggcttcttgcccctgcaatcactgg480ccagcctgcccaagaggataaaagtgagagaaagagaggaggaagggagatgaggggaaa540gagggaggtgatgacatggattactgatatgtagggttcacgtgggttccacgctgactc600agccgccacgtcggataaaaccgggatcaaagctaccgaatgacctaaagtgaacagttt660tgtaaattgagggatgtcatgtatccggttttgtggttgatggacgattttgtaactcga720tgacaaattgagcgacctgcggtgtactttttccttccgccctgtgtggaggcccaaaca780ttcagcccattcccaacctggcactgacatgcgggccattccaaagccttgcacagtttc840acctctcacccgcgcctccgcttcctcccgcctccccaaacgatgccgcctccgcctccg900tcttcccgtctcctcgccctcctctccgcgCgCCgCCCgCCgCCCCCgCtccgccgcctc960ctccagatccacgcccacctcctcgccgccggcctccttcaagacttctcctccctcctc1020gccgccgcctacgcgctctccaccaccgccaccgccacggacgcccgcacctcgccgccc1080tccccgctccgccacgcgctcgcgctcctctcctcgctcccggcctccgcctacaacgcc1140gccatccgagcactctccctctccgacgacggcgaccgccatggccacggcgtcgtccgc1200cgctgcctcccgctctaccgcgccctcctccgctccgggaCCgCgCgCCCcgaccacctc1260acgttcccgttcctgctcaaggcctgcgcgCgCCtgCgggagtggggatacggcgacgcg1320gccctcgcgcacgtcctccgcctcggcctcgactccgacgtcttcgtggtgaacgcggcc1380acgcacttcctatcgatccgcgggcccatggaggacgcacgcaggctgttcgaccgaagt1440cctgtgagggacttggtgtcgtggaacacgctgatcggagggtacgtgcggcgggggaac1500ccagcggaggcgctggagctgttctggaggatggtggcagaggatgcagtggtgaggcct1560gatgaggtcacgatgatcgcggctgtgtcggggtgtgggcagatgcgtgacctggagctt1620gggaggcggcttcatgggttcgtggatagtgacggagtgagttgcactgtgaggctgatg1680aatgcgctgatggatatgtacatcaagtgtggcagtttagagatggcaaagtctgtgttc1740gagaggatcgagcacaggacagttgtctcttggacgacgatgatcgtggggtttgccaag1800ttcggattgatgggcgatgcacgtaaagtgtttgatgagatgcctgaaagggatgtgttc1860ccatggaatgcactcatgaccggttatgtgcagtgtaagcagtgcaaggaggccctttcc1920ttgtttcatgagatgcaggaagcaagtgtggtgcctgatgagatcacaatggtcaatctt1980ctaactgcttgttcgcagctcggagcattagaaatggggatgtgggttcaccggtacatt2040gagaaacatcgccttgtatttagtgttgcgcttggcacatctctcattgacatgtacgct2100aagtgtggaaacattgagaaagctatccacattttcaaagaaattcccgagaaaaatgca2160ctcacatggacagcaatgatatgtggtctagcaaatcatggacatgccaatgaggccata2220gagcacttccggacaatgatagagcttggacagaagccagatgagattacgtttataggt2280gttctttcagcatgctgtcatgctggtttggtgaaagaaggtcgggaatttttctctctg2340atggagacaaaatatcatcttgagaggaaaatgaaacattattcatgtatgatagactta2400ctaggcagggcaggccatttagacgaagcagagcagctagtaaacac tatgcctatggaa2460cctgatgcagtagtttggggtgctatcttctttgcttgtaggatgcaaggtaatatctct2520cttggagaaaaggcagcaatgaaattggtagaaattgatcctagtgatagtggaatctat2580gtgctactggctaatatgtatgcagaagcgaacatgaggaagaaggctgacaaagtcagg2640gctatgatgagacatttgggagtggagaaagttcctgggtgtagctgcattgagttgaat2700ggtgtggttcatgaatttatcgtgaaggacaagtcacatatggatagtcatgctatttat2760gactgcttgcatgagatcaccctacaaataaagcatactgcagatttgcttagcatttct2820gcggctggtgcggtgtagtgttctgttggctggaacagctggctgagctgtgcaagatga2880tatgtgcagttgtgatgcacaattcacagatgcaggaactcgatcatgctgatttgtgct2940ggtttgccaggccatgttctgagaagggtatacttcatgttgattactatctgaggcatt3000ccccgagaattttctggtcgttcttttgcagcttgatgtcaatggaaacaatatgttcca3060ctacatattgcaaagttcttgtatgctctttactcaaccctcacgtgcggagcacttcct3120gggtaagtgtggttctcatgctctgttttgcctcctccatttctcctccgttgcatttaa3180agtcacatccccctcctcaggttttctccattagctctctgtagtccttgctgtactctc3240cttggtattccatgctgtcctactacttgcttcatccccttctacattttgttctggttt3300ttggcctgcatttcggatcatgatgtatgtgatttccaatctgctgcaatatgaatggag3360actctgtgct3.3. C C 3. C 3.3. Caacatgaaatgcttatgaggcctttgctgagcagccaatc3420ttgcctgtgtttatgtcttcacaggccgaattcctctgttttgtttttcaccctcaatat3480ttggaaacatctatctaggttgtttgtgtccaggcctataaatcatacatgatgttgtcg3540tattggatgtgaatgtggtggcgtgttcagtgccttggatttgagtttgatgagagttgc3600ttctgggtcaccactcaccattatcgatgctcctcttcagcataaggtaaaagtcttccc3660tgtttacgttattttacccactatggttgcttgggttggttttttcctgattgcttatgc3720catggaaagtcatttgatatgttgaacttgaattaactgtagaattgtatacatgttcca3780tttgtgttgtacttccttcttttctattagtagcctcagatgagtgtgaaaaaaacagat3840tatataacttgccctataaatcatttgaaaaaaatattgtacagtgagaaattgatatat3900agtgaatttttaagagcatgttttcctaaagaagtatatattttctatgtacaaaggcca3960ttgaagtaattgtagatacaggataatgtagactttttggacttacactgctacctttaa4020gtaacaatcatgagcaatagtgttgcaatgatatttaggctgcattcgtttactctcttg4080atttccatgagcacgcttcccaaactgttaaactctgtgttttttgccaaaaaaaaatgt4140
11ataggaaagttgcttttaaaaaatcatatcaatccattttttaagttatagctaatactt4200aattaatcatgcgctaataagtcactctgtttttcgtactagagagattgttttgaacca4260gcactcaagaacacagccttaacccagccaaataatgctacaacctaccagtccacacct4320cttgtaaagcatttgttgcatggaaaagctaagatgacagcaacctgttcaggaaaacaa4380ctgacaaggtcatagggagagggagcttttggaaaggtgccgtgcagttcaaacaattag4440ttagcagtagggtgttggtttttgctcacagcaataagaagttaatcatggtgtaggcaa4500cccaaataaa3. C 3. C C 3.3.3.3. atgcacaaggcagtttgttgtattctgtagtacagacaaa4560actaaaagtaatgaaagaagatgtggtgttagaaaaggaaacaatat catgagtaatgtg4620tgagcattatgggaccacgaaataaaaagaacattttgatgagtcgtgtatcctcgatga4680gcctcaaaagttctctcaccccggataagaaacccttaagcaatgtgcaaagtttgcatt4740ctccactgacataatgcaaaataagatatcatcgatgacatagcaactcatgcatcatat4800catgcctctctcaacctattcattcctactcatctacataagtatcttcagctaaatgtt4860agaacataaacccataagtcacgtttgatgagtattaggcgtgacacatgclCclclclt CclCcl4920gactcaagcaagataaagcaaaatgatgtg 3. C 3. 3.3.3.3. Ctccagagctatatgtcatat4980tgcaaaaagaggagagcttataagacaaggcatgactcac￡1￡1￡1￡1￡Ι 0￡Ι ttgcctttcg5040tgtcaaaaagaggagggctttacattatccatgtcatattgcaaaagaaagagagaaaga51003. C 3.3. C 3. C 3.3. gctgcgtcaattatacatatctgtatgtccatcattattcatccaccttt5160cgtgtaccacacttcatatatcatgagtcacttcatgtctggacattaacaaactctatc5220ttaacatttagatgcaagagcctttatctcactataaatgcacgatgatttctcattgtt5280tctcacaaaaagcattcagttcattagtcc 3. C 3.3. C 3.3. C 3.tggcatccataaatcgcccc5340atagttttcttcacagtttgcttgttcctcttgtgcgatggctccctagcc 5391SEQ ID NO. 2的信息〈210〉 2〈211〉 1503〈212〉 DNA〈213〉水稻(Oryza sativa)〈400〉 2atggttctgacgcacgtcgaggcggtggaggagggcagcgaggcggcggcCgCCgtgttC60gcgtcgaggtacgtgcaggaCCCggtgCCgaggtacgagctcggcgagaggtcgatatcc120aaggacgccgcgtaccagatcgtccacgacgagctcctcctggacagcagCCCgCgCCtg180aacctggcgtccttcgtcaccacctggatggagcccgagtgcgacaggctcatcctcgag240gccatcaacaagaactacgccgacatggacgagtaccccgtcaccaccgagctccagaac300cggtgcgtgaacatcatagcgaggctgttcaatgcgccggtgggcgacggcgagaaggcg360gtcggggtgggcacggtggggtcgtcggaggccataatgctggccgggctggcgttcaag420CggCggtggCagaaccggcggaaggcggcggggaagccccacgacaagcccaacatcgtg480acgggggccaacgtgcaggtgtgctgggagaagttcgcgcgctacttcgaggtggagctc540aaggaggtgaagctgaccgaaggctgctacgtgatggaccccgtcaaggccgtggacatg600gtcgacgagaacaccatctgcgtcgccgccatcctcggctccaccctcaccggcgagttc660gaggacgtcaggcgcctcaacgacctcctcgccgccaagaacaagcggacgggttgggac720acgccgatccacgtcgacgcggcgagcggcgggttcatcgcgccgttcatctacccggag780ctggagtgggacttccggctgccgctggtgaagagcatcaacgtcagcggccacaagtac840gggctcgtctacgccggcgtcgggtgggtcatctggcgcaacaaggaggacctccccgag900gagctcatcttccacatcaactacctcggcgccgaccagccaaccttcacgctcaacttc960tccaaagggtccagtcagattattgcgcaatattaccagtttcttcgactcggatttgag1020gggtacaagagcgtgatgaagaactgcatggagagcgcgaggacgctccgggagggcctg1080gagaagacggggcggttcaccatcatctccaaggaggagggcgtgccgctggtggccttc1140acgttcaaggacggcgccggcgcgcaggccttcaggctgtcgtcgggcctgcgccggtac1200gggtggatcgtgccggcgtacacgatgccggcggcgctggagcacatgacggtcgtccgc1260gtcgtcgtccgggaagacttCggCCggCCgctcgccgagcggttcctgtcccacgtcagg1320atggccctggacgagatggacctcgccgccagggcccccgtgcccagggtgcagctcacc1380atcgagctcggccccgcccggaccgccggcgaggaggcctcgatcagggtggtcaagagc1440gaggccgtgcccgtgcgcaagagcgtcccgctcgtcgccggcaaaaccaagggcgtttgc1500
tag
權利要求
一種提高水稻種子γ 氨基丁酸含量的方法，包括以下步驟(1)從越光水稻中克隆5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列；(2)把5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列連於表達調控序列，形成含有5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列的植物表達載體；(3)將含5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列的植物表達載體轉化到根癌農桿菌，獲得含有5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列植物表達載體的根癌農桿菌菌株；(4)將步驟(3)根癌農桿菌遺傳轉化水稻，獲得PCR及Western Blot檢測陽性的轉基因水稻植株；(5)對步驟(4)獲得的轉基因水稻植株種子中γ 氨基丁酸含量進行HPLC檢測，γ 氨基丁酸含量顯著提高，後代表型正常。
2.根據權利要求1所述的提高水稻種子Y-氨基丁酸含量的方法，其特徵在於步驟(1)從越光水稻中克隆的GAD2AC30序列是在GAD2基因的cDNA末端缺失90bp，終止密碼 子TAG上遊90bp的一段cDNA序列，編碼胺基酸序列為缺失C末端30個胺基酸的序列。
3.根據權利要求1所述的提高水稻種子Y-氨基丁酸含量的方法，其特徵在於步驟(2)中5.3kbGtl啟動子序列末端序列，距最末端一個鹼基600bp處設計一條上遊特異性引 物及一條GAD2A C30序列的下遊特異性引物，PCR方法對所述轉基因水稻進行分子檢測結 果擴增出2013bp大小的特異DNA片段的陽性轉基因水稻植株。
4.根據權利要求1所述的提高水稻種子Y-氨基丁酸含量的方法，其特徵在於步驟 (5)所述的HPLC法測定水稻種子中Y -氨基丁酸含量的方法為(1)色譜柱為Hypersil ODS C18 柱 125mm X 4. Omm , 5ym ；(2)流動相A醋酸鈉緩衝液的製備方法取醋酸鈉2.72g，三乙胺0.2mL，加水溶解， 冰醋酸調節PH至7. 3，加水至IOOOmL ；(3)流動相B的製備方法pH值7.2的1. 35%醋酸鈉、乙腈、甲醇重量比為 100 175 225 ；(4)梯度洗脫0 4min,流動相B的比例從0.5%增加至26%，維持6min後，增加至 100%,維持 7min ；(5)流速為ImL · rnirT1 ；(6)檢測波長338nm，柱溫40°C。
全文摘要
本發明涉及基因工程技術，一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法。天然的水稻種子中γ-氨基丁酸含量很低，無法滿足人類治療和預防高血壓疾病的保健要求。本發明包括以下步驟從水稻中克隆出5.3kbGt1啟動子序列和穀氨酸脫羧酶GAD2ΔC30序列，構建含5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列的植物表達載體，遺傳轉化水稻獲得轉基因水稻植株，PCR檢測目的基因5.3kbGt1啟動子序列和GAD2ΔC30序列的整合，RT-PCR分析檢測轉基因水稻種子中GAD2ΔC30蛋白的表達，測定水稻種子中γ-氨基丁酸含量。本發明方法可顯著提高水稻種子中γ-氨基丁酸含量，具有遺傳功能，有利於保護人民的健康。
文檔編號A01H5/00GK101948855SQ201010263299
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月26日 優先權日2010年8月26日
發明者廖攀, 開國銀, 張倩飛, 許輝, 黃志偉 申請人:上海師範大學