一種表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgRNA的載體及應用的製作方法
2024-04-03 03:18:05
本發明屬於生物技術領域，涉及一種載體，具體涉及一種表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體及其應用。
背景技術：
適體核酶(aptazyme)適體核酶型核糖開關是近年出現的一種人工基因調控開關。最常見的適體核酶由錘頭狀核酶和適體組成，結構清晰，易於設計。作為一種順式作用元件，適體核酶型核糖開關在特異性配體的作用下，無需蛋白分子輔助，即可通過調節自身剪切反應，調控mrna的翻譯，可應用於多種細胞的基因調控。一個已經報導的適體核酶p1-f5(etal.，2010；ketzer，etal.，2014)在與茶鹼結合後可以發生自身剪切，從而造成mrna的切割和降解，從而起到調控基因表達的作用。
clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(crispr)/crispr-associated(cas)9系統成功被改造為第三代人工核酸內切酶，與鋅指核酸內切酶(zincfingerendonuclease，zfn)和類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，talen)一樣可用於各種複雜基因組的編輯。目前該技術成功應用於人類細胞、斑馬魚和小鼠以及細菌的基因組精確修飾，修飾類型包括基因定點突變、基因定點敲入、兩位點同時突變和小片段的缺失。由於其突變效率高、製作簡單及成本低的特點，被認為是一種具有廣闊應用前景的基因組定點改造分子工具。cas9核酸酶可以在sgrna指導下結合任何含有pam序列的dna，sgrna中20個核酸序列通過鹼基互補配對靶向特定dna，穩定cas9與目的dna的結合。可以通過改變sgrna序列，使之結合到任意位點，sgrna與目標dna互補配對確保cas9作用位點特異性。但是，後續研究發現根據鹼基錯配數目、位置以及鹼基特性差異，cas9容許grna20nt序列與靶dna之間存在不同數目的錯配。引起的脫靶問題，限制cas9編輯技術在臨床中的應用。已有的研究指出通過控制crispr-cas9系統的作用時間，既在達到切割編輯目的後關閉crispr-cas9系統，可以避免過度切割的脫靶效應。
經過改造的crispr/cas9也可以用於對靶基因的表達進行激活或者抑制，將cas9蛋白進行突變後得到的沒有切割活性的突變體dcas9具有在sgrna序列引導下結合目標基因的但不切割的特性，研究人員將dcas9與轉錄激活結構域vp64融合後構建的dcas9-vp64分子成為可以靶向特定基因的轉錄激活因子。同理將轉錄抑制結構域krab融合在dcas9的3』末端，獲得的dcas9-krab分子則成為了可以靶向特定基因的轉錄抑制因子。但在基因治療和功能研究中，對特定基因的表達調控往往需要更精準的時間控制。所以對於dcas9-vp64或dcas9-krab介導的基因表達也需要有效的控制手段。
對crispr/cas9系統介導的基因組編輯以及dcas9-vp64或dcas9-krab介導的基因表達激活和抑制的主要調控段是通過對cas9類蛋白的轉錄，轉錄後，翻譯後等水平進行調節。如davis等人對cas9蛋白進行了改造，使其在藥物4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)存在時發生翻譯後的蛋白編輯，產生活性的cas9蛋白，從而啟動crispr/cas9系統進行基因編輯。也有研究者使用四環素調控系統調控cas9蛋白或者sgrna表達來調控crispr/cas9活性，但這樣的調控系統會需要引入額外的順式調控元件和反式調節因子。
通過不引入額外的順式調控元件和反式調節因子的途徑調控sgrna進而控制crispr/cas9活性的方法為一新的策略。申請人研究發現，通過構建一種表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體，在進行基因編輯和轉錄調控時，通過在培養基中加入適體核酶p1-f5的配體茶鹼，引起該適體核酶自我剪切從而造成sgrna的斷裂，使sgrna引導的crispr/cas9系統失活。這樣的調控方法避免了額外的順式調控元件和反式調節因子的引入，該載體質粒上所佔體積小，同時具有受配體藥物調控的特徵。
技術實現要素：
本發明的目的在於，提供一種表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體。
為了實現上述任務，本發明採用如下的技術解決方案：
一種表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體，其特徵在於，在表達的sgrna-az2.0骨架的四鹼基環(tetraloop)以及莖環2(stemloop2)位置插入適體核酶p1-f5；通過kpnⅰ與ecorⅰ位點和ecorⅰ與speⅰ位點，分別將u6啟動子、sgrna-az2.0骨架依次連入載體puc19/ekshl中，獲得載體pu6-sgrna-az2.0；使用bsaⅰ酶切載體pu6-sgrna-az2.0，並利用粘性末端連入針對目標基因的sgrna序列，獲得pu6-sgrna-az2.0-targetsite。
根據本發明，所述插入的適體核酶是p1-f5的序列為：
ggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcc。
上述sgrna-az2.0骨架的完整序列為：
gaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。
上述u6啟動子序列如下：
ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattc
上述的載體pu6-sgrna-az2.0完整序列為：
ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。
根據本發明，所述粘性末端連入針對目標基因編輯靶點的長度為19或20個核苷酸，退火構成其sgrna片段的引物序列如下：
glrx3：accgtgaggataggtaggccaac與aaacgttggcctacctatcctca；
vegfa：accgggtgagtgagtgtgtgcgtg與aaaccacgcacacactcactcacc；
pgrnpro：accgcgtcgggacagcctcagca與aaactgctgaggctgtcccgacg。
所述的針對目標基因的sgrna序列是針對目標基因編輯靶點，它們是針對glrx3基因，vegfa基因或者pgrn基因啟動子中的任意一種。但並不只限於這三種。
根據申請人的研究表明，採用本發明構建的表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-targetsite與載體hcas9共轉染hek293細胞，進行了對目標基因的編輯實驗，實驗結果表明，表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-targetsite與hcas9載體共轉染細胞後，對目的基因可以進行有效編輯，並且其編輯活性受到茶鹼的有效調控；採用本發明構建方法構建的表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-targetsite與載體phageef1αdcas9-krab以及載體pgl3-pgrnpro-luc共轉hek293細胞進行基因轉錄抑制的調控實驗，實驗結果表明，表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-targetsite與載體phageef1αdcas9-krab以及載體pgl3-pgrnpro-luc共轉染細胞後，可以對人pgrn啟動子啟動的螢光素酶的表達起到抑制作用，並且其抑制活性受到茶鹼的有效調控。
本發明所構建的表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體，能有效介導cas9蛋白的基因組編輯作用，並使其編輯活性受到茶鹼調控；且能介導dcas9-krab蛋白對目的基因的轉錄抑制，其抑制活性受到茶鹼調控。
附圖說明
圖1是sgrna-az2.0骨架的結構圖。
圖2是pu6-sgrna-az2.0載體結構圖。
圖3是pu6-sgrna-az2.0-targetsite載體結構圖。
圖4是實施例1構建的pu6-sgrna-az2.0-glrx3載體介導的目標基因編輯效率檢測圖。
圖5是實施例2構建的pu6-sgrna-az2.0-vegfa載體介導的目標基因編輯效率檢測圖。
圖6是pgl3-pgrnpro-luc載體結構圖。
圖7是實施例3構建的pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro載體介導的目標基因轉錄抑制活性檢測圖。
下面結合附圖和實施例來對本發明做進一步詳細說明。
具體實施方式
本發明的表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體，在表達的sgrna-az2.0骨架的四鹼基環(tetraloop)以及莖環2(stemloop2)位置插入適體核酶p1-f5；通過kpnⅰ與ecorⅰ位點和ecorⅰ與speⅰ位點分別將u6啟動子、sgrna-az2.0骨架依次連入載體puc19/ekshl中，獲得載體pu6-sgrna-az2.0；使用bsaⅰ酶切載體pu6-sgrna-az2.0，並利用粘性末端連入針對目標基因的sgrna序列，獲得載體pu6-sgrna-az2.0-targetsite(圖3)。
構建的表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體，具體步驟為：
(1)合成在四鹼基環(tetraloop)以及莖環2(stemloop2)位置插入適體核酶p1-f5的sgrna-az2.0骨架；
根據已知序列和發明人設計，合成5』末端帶有ecorⅰ位點，3』末端帶有speⅰ位點的sgrna-az2.0的骨架，這個骨架中適體核酶p1-f5分別插入在原始骨架四鹼基環(tetraloop)以及莖環2(stemloop2)的位置。
(2)合成u6啟動子
根據已知序列合成5』末端帶有kpnⅰ，3』末端帶有ecorⅰ位點的u6啟動子；
(3)構建pu6-sgrna-az2.0載體
將u6啟動子片段經過kpnⅰ與ecorⅰ酶切，sgrna-az2.0的片段經過ecorⅰ與speⅰ酶切，使用1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收兩片段，載體puc19/ekshl(xiao，etal.，2016)通過kpnⅰ與speⅰ酶切後，使用1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收載體；使用t4連接酶將片段u6啟動子，sgrna-az2.0與載體puc19/ekshl連接，產物轉化入大腸桿菌dh5α，挑取單克隆菌株，經過培養後經鹼性裂解法提取質粒dna，通過酶切及測序鑑定獲得陽性克隆為所需要的載體，命名為pu6-sgrna-az2.0。
(4)構建靶向人glrx3基因的pu6-sgrna-az2.0-glrx3載體
設計的靶向人glrx3基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由蘇州金唯智公司合成，序列如下(下劃線表示粘性末端序列)：
正向引物序列為：accgtgaggataggtaggccaac；
反向引物序列為：aaacgttggcctacctatcctca。
兩條引物用超純水稀釋成濃度為20μm的溶液，各取20μl混合後於室溫退火1小時。獲得的片段即為靶向人glrx3基因的sgrna片段，其末端帶有特定的粘性末端。載體pu6-sgrna-az2.0經bsaⅰ酶切後，經質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收載體，將靶向人glrx3基因的sgrna片段與經bsaⅰ酶切的載體pu6-sgrna-az2.0連接，產物轉化入大腸桿菌dh5α，挑取單克隆菌株，經過培養後經鹼性裂解法提取質粒dna，通過酶切及測序鑑定獲得陽性克隆為所需要的載體，命名為pu6-sgrna-az2.0-glrx3。
(5)構建靶向人vegfa基因的pu6-sgrna-az2.0-vegfa載體
靶向人vegfa基因的sgrna片段由引物退火形成(fu，etal.，2013)，引物由蘇州金唯智公司合成，序列如下(下劃線表示粘性末端序列)：
正向引物序列為：accgggtgagtgagtgtgtgcgtg；
反向引物序列為：aaaccacgcacacactcactcacc。
兩條引物用超純水稀釋成濃度為20μm的溶液，各取20μl混合後於室溫退火1小時。獲得的片段即為靶向人vegfa基因的sgrna片段，其末端帶有特定的粘性末端。載體pu6-sgrna-az2.0經bsaⅰ酶切後，經質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收載體，將靶向人vegfa基因的sgrna片段與經bsaⅰ酶切的載體pu6-sgrna-az2.0連接，產物轉化入大腸桿菌dh5α，挑取單克隆菌株，經過培養後經鹼性裂解法提取質粒dna，通過酶切及測序鑑定獲得陽性克隆為所需要的載體，命名為pu6-sgrna-az2.0-vegfa。
(6)構建靶向人pgrn基因啟動子的pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro載體
靶向人pgrn基因啟動子的sgrna片段由引物退火形成，引物由蘇州金唯智公司合成，序列如下(下劃線表示粘性末端序列)：
正向引物序列為：accgcgtcgggacagcctcagca；
反向引物序列為：aaactgctgaggctgtcccgacg。
兩條引物用超純水稀釋成濃度為20μm的溶液，各取20μl混合後於室溫退火1小時。獲得的片段即為靶向人pgrn基因啟動子的sgrna片段，其末端帶有特定的粘性末端。載體pu6-sgrna-az2.0經bsaⅰ酶切後，經質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收載體，將靶向人pgrn基因啟動子的sgrna片段與經bsaⅰ酶切的載體pu6-sgrna-az2.0連接，產物轉化入大腸桿菌dh5α，挑取單克隆菌株，經過培養後經鹼性裂解法提取質粒dna，通過酶切及測序鑑定獲得陽性克隆為所需要的載體，命名為pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro。
以下是發明人給出的具體實施例，需要說明的是，以下的實施例是較佳的例子，本發明並不限於這些實施例
實施例1：
本實施例構建的表達靶向人glrx3基因的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體如下：
表達的sgrna-az2.0骨架(骨架結構圖如圖1所示)中，在四鹼基環(tetraloop)以及莖環2(stemloop2)位置插入適體核酶p1-f5，其中適體核酶p1-f5序列如下：
ggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcc。
sgrna-az2.0骨架的完整序列為：
gaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。
u6啟動子序列如下：
ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattc。
載體pu6-sgrna-az2.0完整序列為：
ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。
在兩個bsaⅰ中插入的靶向人glrx3基因的sgrna序列如下：
tgaggataggtaggccaac。
上述的表達靶向人glrx3基因的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體構建方法步驟如下：
1、合成在四鹼基環(tetraloop)以及莖環2(stemloop2)位置插入適體核酶p1-f5的sgrna-az2.0骨架；
根據已知序列和發明人設計，由江蘇金唯智公司合成5』末端帶有ecorⅰ位點，3』末端帶有speⅰ位點的sgrna-az2.0的骨架，在sgrna-az2.0骨架中，適體核酶p1-f5分別插入在原始骨架四鹼基環(tetraloop)及莖環2(stemloop2)的位置。
2、合成u6啟動子
由江蘇金唯智公司合成5』末端帶有kpnⅰ，3』末端帶有ecorⅰ位點的u6啟動子。
3、構建pu6-sgrna-az2.0載體
將u6啟動子片段經過kpnⅰ與ecorⅰ酶切，sgrna-az2.0的片段經過ecorⅰ與speⅰ酶切，使用1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收兩片段，載體puc19/ekshl(xiao，etal.，2016)通過kpnⅰ與speⅰ酶切後，使用1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收載體；使用t4連接酶將片段u6啟動子，sgrna-az2.0與載體puc19/ekshl連接，連接條件為：puc19/ekshl載體0.5μl，片u6啟動子段2μl，sgrna-az2.0片段2μl，2×t4dna快速連接酶緩衝液5μl，t4dna快速連接酶0.5μl，25℃反應1個小時後轉化感受態細胞dh5α，並塗布於含有100μg/ml的氨苄青黴素的lb平板中。挑取菌落接種到含有100μg/ml的氨苄青黴素的lb培養液中，14～16小時後，經鹼性裂解法提取質粒dna，通過酶切及測序鑑定獲得陽性克隆。將所獲得陽性克隆命名為pu6-sgrna-az2.0載體，該pu6-sgrna-az2.0載體結構圖如圖2所示。
4、構建靶向人glrx3基因的pu6-sgrna-az2.0-glrx3載體
設計的靶向人glrx3基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由蘇州金唯智公司合成，序列如下(下劃線表示粘性末端序列)：
p1：accgtgaggataggtaggccaac；
p2：aaacgttggcctacctatcctca。
兩條引物用超純水稀釋成濃度為20μm的溶液，各取20μl混合後於室溫退火1小時。獲得的片段即為靶向人glrx3基因的sgrna片段，其末端帶有特定的粘性末端。載體pu6-sgrna-az2.0經bsaⅰ酶切後，經質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收載體，將靶向人glrx3基因的sgrna片段與經bsaⅰ酶切的載體pu6-sgrna-az2.0連接，連接條件為：pu6-sgrna-az2.0載體0.5μl，靶向人glrx3基因的sgrna片段2μl，2×t4dna快速連接酶緩衝液5μl，t4dna快速連接酶0.5μl，去離子水2μl，25℃反應1個小時後轉化感受態細胞dh5α，並塗布於含有100μg/ml的氨苄青黴素的lb平板中。挑取菌落接種到含有100μg/ml的氨苄青黴素的lb培養液中，14小時～16小時後，經鹼性裂解法提取質粒dna，通過酶切及測序鑑定獲得陽性克隆。將所獲得陽性克隆命名為pu6-sgrna-az2.0-glrx3。
實施例2：
本實施例構建的表達靶向人vegfa基因的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體如下：
實施例1中靶向人glrx3基因的sgrna序列由靶向人vegfa基因的sgrna序列替換。在兩個bsaⅰ中插入的靶向人vegfa基因的sgrna序列如下：
ggtgagtgagtgtgtgcgtg。
載體的其它結構與實施例1相同。
其構建方法步驟4中，構建靶向人vegfa基因的pu6-sgrna-az2.0-vegfa載體的方法是：
靶向人vegfa基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由蘇州金唯智公司合成，序列如下(下劃線表示粘性末端序列)：
p3：accgggtgagtgagtgtgtgcgtg；
p4：aaaccacgcacacactcactcacc。
其餘構建方法與實施例1相同，構建成表達靶向人vegfa基因的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-vegfa。
實施例3：
本實施例構建的表達靶向人pgrn基因啟動子的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體如下：
實施例1中靶向人glrx3基因的sgrna序列由靶向人pgrn基因啟動子的sgrna序列替換。在兩個bsaⅰ中插入的靶向人pgrn基因啟動子的sgrna序列如下：
cgtcgggacagcctcagca。
載體其它結構與實施例1相同。
其構建方法步驟4中，構建靶向人pgrn基因啟動子的pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro載體的方法是：
靶向人pgrn基因啟動子的sgrna片段由引物退火形成，引物由蘇州金唯智公司合成，序列如下(下劃線表示粘性末端序列)：
p5：accgcgtcgggacagcctcagca；
p6：aaactgctgaggctgtcccgacg。
其餘構建方法與實施例1相同，構建成表達靶向人pgrn基因啟動子的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro。
為了驗證構建的表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體的有益效果，發明人採用實施例1構建的表達靶向人glrx3基因的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-glrx3，實施例2構建的表達靶向人vegfa基因的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-vegfa，實施例3構建的表達靶向人pgrn基因啟動子的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro進行了實驗，實驗情況如下：
1、表達靶向人glrx3基因的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體對目標基因的編輯效率和藥物調控效果
發明人將實施例1中構建的載體pu6-sgrna-az2.0經過ecorⅰ與speⅰ雙酶切，使用1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收載體，然後插連入由蘇州金唯智公司合成的5』端帶有ecorⅰ位點，3』端帶有speⅰ位點的不帶有適體核酶修飾的sgrna骨架片段，該片段序列如下：
gaattcggtctccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。
所獲得的載體命名為pu6-sgrna，該載體為表達不帶有適體核酶修飾的sgrna的載體，其表達的sgrna不會受到茶鹼藥物的調控，在本實驗中作為對照。載體pu6-sgrna中也插入了靶向人glrx3基因的sgrna序列，其方法與實施例1中構建方法步驟4相同，獲得的載體命名為pu6-sgrna-glrx3。接種hek293細胞於24孔板，每孔1×105個細胞，共同轉染表達cas9的蛋白的載體hcas9(addgene，#41815)與pu6-sgrna-az2.0-glrx3進入細胞；而同時，共同轉染表達cas9的蛋白的載體hcas9與pu6-sgrna-glrx3進入細胞，作為陽性對照。細胞培養基中加入或不加入終濃度為3mm的茶鹼。48小時後提取細胞基因組dna。使用巢式pcr擴增基因組中包含編輯位點的區域。
外巢反應：
引物：
p7:actcaaactggaggctggag；
p8:gctgcacccagtaaaacacga。
反應體系：
聚合酶鏈式反應的條件是：94℃，30秒，98℃，10秒70℃，30秒(每個循環下降1℃)72℃，30秒，10個循環，98℃，10秒，60℃，30秒，72℃，30秒，25個循環。
內巢巢反應：
引物：
p9:aggtaccccccagtctctgggattaca；
p10:aagatctaaaagcaaagcagatcctcca。
反應體系：
聚合酶鏈式反應的條件是：94℃，30秒，98℃，10秒，60℃，30秒，72℃，30秒，30個循環。
所獲得的pcr產物經過pcr儀器變性退火的程序是：
95℃，5分鐘；95℃-85℃，每秒降低2℃(-2℃/s)；85℃-25℃，每秒降低0.1℃(-0.1℃/s)。
產物經過質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收後，測量含量，然後使用經典的t7endonucleasei內切酶檢測法檢測各組中目標基因的編輯效率。具體方法如下：每組取pcr產物dna500ng，0.5μl的t7endonucleasei(neb,m0302s)內切酶，2μl的10×buffer，補水至總體積20μl。37℃，反應20分鐘。結束後進行1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。t7endonucleasei內切酶能夠將pcr產物中不配對的部分切斷，如果pcr產物被切開成兩條小的條帶，則說明其在目標位置發生了基因組編輯，產生了鹼基突變，而兩條小的條帶的亮度越亮，則說明基因組編輯的效率越高。結果見圖4所示，在不是加入藥物茶鹼時，pu6-sgrna-az2.0-glrx3與pu6-sgrna-glrx3均能介導cas9進行基因組編輯，但加入茶鹼後，載體pu6-sgrna-az2.0-glrx3介導cas9進行基因組編輯的效應被明顯的削弱，而pu6-sgrna-glrx3介導cas9進行基因組編輯的效應則無明顯變化。此結果說明，表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體介導cas9對人glrx3位點基因組編輯的效應可有有效的被茶鹼控制。
2、表達靶向人vegfa基因的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體對目標基因的編輯效率和藥物調控效果
發明人在載體pu6-sgrna中也插入了靶向人vegfa基因的sgrna序列，其方法與實施例1中構建方法步驟4相同，獲得的載體命名為pu6-sgrna-vegfa。接種hek293細胞於24孔板，每孔1×105個細胞，共同轉染表達cas9的蛋白的載體hcas9與pu6-sgrna-az2.0-vegfa入細胞；而同時，共同轉染表達cas9的蛋白的載體hcas9與pu6-sgrna-vegfa進入細胞，作為陽性對照。細胞培養基中加入或不加入終濃度為3mm的茶鹼。48小時後收取細胞提取細胞基因組dna。使用降落pcr擴增基因組中包含編輯位點的部分。
引物：
p11:tccagatggcacattgtcag；
p12:agggagcaggaaagtgaggt。
反應體系：
聚合酶鏈式反應的條件是：94℃30秒，98℃10秒70℃30秒(每個循環下降1℃)72℃30秒10個循環，98℃10秒60℃30秒72℃30秒，25個循環。
所獲得的pcr產物經過pcr儀器變性退火，t7e1內切酶檢測法檢測各組中目標基因的編輯效率。其具體方法與實驗1中相同。結果見圖5所示，圖中顯示，在不是加入藥物茶鹼時，pu6-sgrna-az2.0-vegfa與pu6-sgrna-vegfa均能介導cas9進行基因組編輯，但加入茶鹼後，載體pu6-sgrna-az2.0-vegfa介導cas9進行基因組編輯的效應被明顯的削弱，而pu6-sgrna-vegfa介導cas9進行基因組編輯的效應則無明顯變化。此結果說明，本發明的表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體介導cas9對人vegfa位點基因組編輯的效應可有有效的被茶鹼控制。
上述實驗1和實驗2說明，表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體介導cas9對目標位點基因組編輯的效應可有效的被茶鹼控制。
3、表達靶向人pgrn基因啟動子的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體介導dcas9-krab蛋白對目標基因轉錄抑制效率和藥物調控效果
首先，發明人構建了人pgrn啟動子啟動表達螢光素酶的載體pgl3-pgrnpro-luc，方法簡述如下：
使用引物
p13：ggtaccaggatacttctttgttg；
p14：agatctctcctccctgcttcctct。
以人胚腎hek293細胞系的基因組為模板，擴增人pgrn啟動子，其序列如下：
ggtaccaggatacttctttgttgtgggggattgttctgtgtgtcgtgtgatgtttagtgggattgctggcccttacctaccagatgccagtgtccctccaccctgagttgtgacaacccagattgtctccagacactcctaaatgtccctggccggcaaaattgccgctgctcaagaatcacggctttgacgattagactttgtgatatttgtttcagtctgtttaggttttttttcttctacctgtatttttttctggttctgggtggttgtaattagtaggttattgatcgattcacctaacatttcatgaaagtttcatgtgtgtgtgtgtttcaatagaagcataaactatactccctagtctcaagatacacaggaaggaaaataagcacaaatgtgtcaccagggcacagactagtactaggtcctcagcaggccaggtgtcttatccgctgtctgggtctgctctagctccaggcttagaacccctgccacacgactccacagctcggttggcaccctttccctcctccgacttctgctgcctcgagcttggttagccatccccctgcccctgcctcatcctcagctccagttccttgctcaggctgcagcagtctccatcccctgtgcagacactgccgttcctccacggcccagtatcaggctttccctgggcctctcctctctcctggcccatctcccatcatccatctctgcctggcccaggccctttggcaccaagcaggctgactcttgtcactggctaatctgttctgtggtacattttctctcctcaccctcccatatcaattcctcgaaggcagggccgatctggagactaggaagccacttctctttcgacagcccccaccacagcccagcccgtgccaggcacccagcagctcctgaagcccactggcattgaacatggcattcaatccctgccaagcctgcccttcccatctggtttcccagggctcttcccaacacctcctcctccacctgccagttaaaatcttcccagactcagctcaaggagatgctcctaaggtggaatgaaatctcttcttccccacctggagacaatctacttcctctccctacacctggcaactggcgcacaaccttgtatcttaaattagattcagcctgagactgtctcccaccaatccctgctccctgtcctgctgagcaccttgaggaaagggctttggggctgtttatctttgtcctggaaaccatccttcaactcactctggggcctgcctagcatgtcaaccgagtttggagaatagggcagaatagggcaggacaggacaggacaagacagggcaggataggataggagcgagccagctcagtagctcacatttgtaatcccagcgccttggggggctgcggtaggagaatcgctttgggagcaggagttgcaggccgcagtgagctatgatcagcttgggcgactgagcgagaccctgtctctaaaacaaacacacaagtccgggcgcggtggctcatgcctgtaatcttagcactttgggaggccgaggtgggcggatcacgaggtcaagaaatcgagaccatcctggccaacatggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaattagctgggcgtggtggtgcgcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatcgcttgaacccgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgtgccactgcactccagcctggcgacagagtgagactccgtctcagaacaaacaaacaaaaggatagaaaggcgagcacaaatattcccaattcataacactccctcgcactgtcaatgccccagacacgcgctatcatctctagcaaactcccccaggcgcctgcaggatgggttaaggaaggcgacgagcaccagctgccctgctgaggctgtcccgacgtcacatgattctccaatcacatgatccctagaaatggggtgtggggcgagaggaagcagggaggagagatct。
將pcr產物經質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收，克隆至pgemt-easy載體，測序鑑定獲得陽性克隆為所需要的載體，命名為pgemt-easy-pgrnpro；將載體pgemt-easy-pgrnpro經過kpnⅰ與bglⅱ雙酶切後，經過1％的瓊脂糖凝膠電泳後回收pgrnpro片段，將其連接入經同樣酶切的pgl3-basic載體上，經轉化後，挑取克隆，經過培養後經鹼性裂解法提取質粒dna，通過酶切及測序鑑定獲得陽性克隆為所需要的載體，命名為pgl3-pgrnpro-luc(載體結構如圖6所示)。
發明人在已有載體pu6-sgrna中也插入了靶向人pgrn基因啟動子的sgrna序列，其方法與實施例1中構建方法步驟3相同，獲得的載體命名為pu6-sgrna-pgrnpro。
接種hek293細胞於24孔板，每孔1×105個細胞，共同轉染表達dcas9-krab的蛋白的載體phageef1αdcas9-krab(addgene，#50919)，pgl3-pgrnpro-luc與pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro入細胞；而同時，共同轉染載體phageef1αdcas9-krab，pgl3-pgrnpro-luc，pu6-sgrna-pgrnpro進入細胞，作為陽性對照。細胞培養基中在不同時間點加入濃度為3mm的茶鹼。24小時後收取細胞，使用試劑盒測試不同時間點加入茶鹼後，各組細胞的螢光素酶表達變化，結果由實驗組值與對照組值之間的比值來呈現。pgl3-pgrnpro-luc上的pgrn啟動子的活性會被靶向其啟動子的sgrna和具有轉錄抑制作用的dcas-krab9蛋白所抑制，而加入茶鹼後pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro表達的靶向人pgrn基因啟動子的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna中包含的適體核酶會發生自剪切，使整個系統對pgrn啟動子的抑制活性解除，所以實驗結果中螢光素酶活力比值擴大，說明實驗組中pgrn啟動子的活性提高，即說明藥物加入解除了該系統中的轉錄抑制的作用。結果見圖7，結果表明，加入茶鹼後的2個小時螢光素酶報告基因的活力就開始快速上升。
上述實驗3說明，本發明的表達靶向人pgrn基因啟動子的受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體介導dcas9-krab的轉錄抑制作用可以被茶鹼有效調控。
核苷酸或胺基酸序列表
陝西師範大學
一種表達受茶鹼調控的適體核酶修飾型sgrna的載體及應用
1
108
適體核酶p1-f5
dna
1
ggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcc
2
309
sgrna-az2.0骨架:
2
gaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt
3
284
u6啟動子
3
ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattc
4
587
pu6-sgrna-az2.0
4
ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt
5
23
glrx3正向引物
5
accgtgaggataggtaggccaac
6
23
glrx3反向引物
6
aaacgttggcctacctatcctca
7
24
vegfa正向引物
7
accgggtgagtgagtgtgtgcgtg
8
24
vegfa反向引物
8
aaaccacgcacacactcactcacc
9
23
pgrnprosgrna正向引物
9
accgcgtcgggacagcctcagca
10
23
pgrnprosgrna反向引物
10
aaactgctgaggctgtcccgacg
11
101
sgrna骨架片段
11
gaattcggtctccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt
12
20
glrx3編輯區域擴增外巢引物p7
12
actcaaactggaggctggag
13
21
glrx3編輯區域擴增外巢引物p8
13
gctgcacccagtaaaacacga
14
27
glrx3編輯區域擴增內巢引物p9
14
aggtaccccccagtctctgggattaca
15
28
glrx3編輯區域擴增內巢引物p10
15
aagatctaaaagcaaagcagatcctcca
16
20
vegfa編輯區域擴增引物p11
16
tccagatggcacattgtcag
17
20
vegfa編輯區域擴增引物p12
17
agggagcaggaaagtgaggt
18
23
pgrn啟動子擴增引物p13
18
ggtaccaggatacttctttgttg
19
24
pgrn啟動子擴增引物p14
19
agatctctcctccctgcttcctct
20
2033
pgrn啟動子
20
ggtaccaggatacttctttgttgtgggggattgttctgtgtgtcgtgtgatgtttagtgggattgctggcccttacctaccagatgccagtgtccctccaccctgagttgtgacaacccagattgtctccagacactcctaaatgtccctggccggcaaaattgccgctgctcaagaatcacggctttgacgattagactttgtgatatttgtttcagtctgtttaggttttttttcttctacctgtatttttttctggttctgggtggttgtaattagtaggttattgatcgattcacctaacatttcatgaaagtttcatgtgtgtgtgtgtttcaatagaagcataaactatactccctagtctcaagatacacaggaaggaaaataagcacaaatgtgtcaccagggcacagactagtactaggtcctcagcaggccaggtgtcttatccgctgtctgggtctgctctagctccaggcttagaacccctgccacacgactccacagctcggttggcaccctttccctcctccgacttctgctgcctcgagcttggttagccatccccctgcccctgcctcatcctcagctccagttccttgctcaggctgcagcagtctccatcccctgtgcagacactgccgttcctccacggcccagtatcaggctttccctgggcctctcctctctcctggcccatctcccatcatccatctctgcctggcccaggccctttggcaccaagcaggctgactcttgtcactggctaatctgttctgtggtacattttctctcctcaccctcccatatcaattcctcgaaggcagggccgatctggagactaggaagccacttctctttcgacagcccccaccacagcccagcccgtgccaggcacccagcagctcctgaagcccactggcattgaacatggcattcaatccctgccaagcctgcccttcccatctggtttcccagggctcttcccaacacctcctcctccacctgccagttaaaatcttcccagactcagctcaaggagatgctcctaaggtggaatgaaatctcttcttccccacctggagacaatctacttcctctccctacacctggcaactggcgcacaaccttgtatcttaaattagattcagcctgagactgtctcccaccaatccctgctccctgtcctgctgagcaccttgaggaaagggctttggggctgtttatctttgtcctggaaaccatccttcaactcactctggggcctgcctagcatgtcaaccgagtttggagaatagggcagaatagggcaggacaggacaggacaagacagggcaggataggataggagcgagccagctcagtagctcacatttgtaatcccagcgccttggggggctgcggtaggagaatcgctttgggagcaggagttgcaggccgcagtgagctatgatcagcttgggcgactgagcgagaccctgtctctaaaacaaacacacaagtccgggcgcggtggctcatgcctgtaatcttagcactttgggaggccgaggtgggcggatcacgaggtcaagaaatcgagaccatcctggccaacatggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaattagctgggcgtggtggtgcgcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatcgcttgaacccgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgtgccactgcactccagcctggcgacagagtgagactccgtctcagaacaaacaaacaaaaggatagaaaggcgagcacaaatattcccaattcataacactccctcgcactgtcaatgccccagacacgcgctatcatctctagcaaactcccccaggcgcctgcaggatgggttaaggaaggcgacgagcaccagctgccctgctgaggctgtcccgacgtcacatgattctccaatcacatgatccctagaaatggggtgtggggcgagaggaagcagggaggagagatct