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抗柑橘潰瘍病pthA-nls基因及其構建方法與應用的製作方法

2024-04-02 18:16:05 1

專利名稱:抗柑橘潰瘍病pthA-nls基因及其構建方法與應用的製作方法
技術領域:
本發明涉及一種抗柑橘潰瘍病基因及其構建方法,尤其是涉及一種利用柑橘潰瘍病的致 病基因/^力/J構建的抗柑橘潰瘍病基因及其構建方法。
背景技術:
柑橘潰瘍病(citrus bacterial canker disease)是由地毯黃單孢桿菌柑橘致病變種 (A/3f力o/B朋as afo; opocVs pv. cArJ')引起的一種細菌性病害。對柑橘苗木、產量及果品 品質影響極大,嚴重危害著柑橘產業的健康發展。到目前為止,還沒有能根除柑橘潰瘍病菌 的特效方法,柑橘品種資源中亦未發現完全抗病的品種,柑橘抗潰瘍病育種多年,沒有取得 實質性進展。發明內容本發明的目的在於提供一種抗柑橘潰瘍病基因及其構建方法。 本發明的目的是通過以下技術方案實現的。研究表明,病原基因ptA4是柑橘潰瘍病亞洲型(A型)致病所必需的因子,;7tW表現出 致病性和無毒性雙重功能,即在非寄主上引起超敏反應,在寄主上引起潰瘍狀症狀。本發明者利用柑橘潰瘍病的致病基因介導廣譜抗性原理,構建了抗柑橘潰瘍病的新 基因戶t)M-"Zs,所述抗柑橘潰瘍病基因pt/^-7 "具有本說明書第5-10頁記載的序列表所示 的序列。其構建方法包括以下步驟(1)引物設計,根據基因銀行登記序列號為U28802的/^力力基因序列設計潰瘍病核定位信號的特異性引物引物名稱 序列 引入酶切位點pl 5' 一gactctagagttgcccagttatctcgccctga- J6a I3,p2 5' —gaggatccgttgcccagttatctcgccctga-3 feffl^Ip3 5' —gcctcgagcaaccatgcgagctxctcttcgttg 5ac Ia-3'p4 5' -cccggggcctcgagcaaccatgcgagctcctct 5"咖Itcgt-3'引物可從上海生工生物工程技術公司購得;(2) NLS序列的克隆,以P1/P3、 Pl/P4、 P2/P3 或P2/P4為引物,以從湖南省柑橘潰瘍病疫區分離的柑橘潰瘍病菌為模板,利用公知的PCR方 法擴增出NLS序列,PCR反應條件為94 。C 4 min; 94 。C 30 sec、 58 'C 30 sec、 72 。C 1.5上遊引物 下遊引物8min, 35個循環,最後72'C延伸IO min; PCR試劑購自MBI公司;(3) PCR產物回收及酶切,PCR 產物用1% 1.5%瓊脂糖凝膠電泳後用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝膠回收試劑盒(可 從Qiagen公司購得)回收純化,操作方法同說明書,純化產物用15 25 U l無菌水溶解;回 收片段用J力a I和&c I雙酶切,其中引物P1 /P4擴增產物採用7力a I和S/ffl3 I雙酶切;引物P2 /P3擴增產物採用^a/^l和5"acl雙酶切;引物P2 /P4擴增產物採用^w^1和5"ac I雙酶切; 酶切反應體系為20 ul:純化產物15ul、兩種酶各1.5 ul、 lOXBuffer 2 ul (Buffer為 MBI公司配套提供);酶切條件為37 'C 5 10 h;酶切產物用1% 1.5%瓊脂糖凝膠電泳後用 Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝膠回收試劑盒(可從Qiagen公司購得)回收純化,操作 方法同試劑盒說明書;內切酶feffl/yi、 5"acl、 5i昭I、 J力aI購自MBI公司;(4)植物表達載 體雙酶切,將pBI121 (基因銀行登記序列號AF485783;可從北京博大泰克生物基因技術有 限公司購得,全序列見http:〃麗,ncbi. nlm. nih. gov/,質粒圖譜見圖l)質粒用J6a I和&c I 雙酶切(如連接擴增P1 /P4產物則用J》al和5feal ;連接P2/P3擴增產物用泡朋yi和i"acl ; 連接P2/P4擴增產物用5MI和6"ac I );酶切反應體系和條件同步驟(3);酶切產物用1% 1.5%瓊脂糖凝膠電泳後用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝膠回收試劑盒(可從Qiagen 公司購得)回收純化,操作方法同試劑盒說明書;(5)連接,將pBI121酶切產物用T4 DNA 連接酶(購自MBI公司)與相應的NLS序列的PCR酶切產物連接,連接反應體系為10 P 1: pBI121 酶切產物4 ul、 NLS序列PCR酶切產物4 yl、 T4 DNA連接酶1 y 1、 10XBuffer (MBI公司配 套提供)1 yl; 16 'C反應15 20 h; (6)克隆,將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a ,克隆操作 方法見《分子克隆實驗指南》(金冬雁等譯,科學出版社,1996)。獲得的陽性克隆基因即 為本發明的新基因,命名為;^力力-/7^,其鹼基對序列見本說明書第5-10頁記載的序列表, "h質粒圖譜見圖2。本發明將病原基因的NLS序列克隆到植物表達載體的/6al和5"acl位點(或 fe/必I /5ac I或/5^c I位點),構建了新基因/^力/l-"^。新基因""可進一步對 柑橘的感病品種進行遺傳轉化,通過對轉基因植株的篩選,可以獲得抗柑橘潰瘍病的新種質。本發明為柑橘抗潰瘍病育種提供了有效工具。


圖1為植物表達載體pBI121質粒圖譜; 圖2為pthA-nls質粒圖譜。
具體實施方式
下面結合優選實施例對本發明作進一步描述。實施例1(1)以從湖南省衡陽市南嶽區柑橘潢瘍病疫區分離的柑橘潰瘍病菌為模板,以P1/P3為 模板,利用PCR方法擴增出NLS序列,PCR反應條件為94 'C 4 min; 94 'C 30 sec, 58 °C 30 sec, 72 。C 1.5 min, 35個循環,最後72 'C延伸IO min; (2) PCR產物用1W 1. 5%瓊脂糖凝 膠電泳後用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝膠回收試劑盒(購自Qiagen公司)回收純 化,純化產物用15 25 nl無菌水溶解;回收片段用J力al和5"acI雙酶切酶切反應體系為 20 nl:純化產物15 lU、兩種酶各1.5 lil、 10XBuffer 2 u 1; (3)植物表達載體pBI121 雙酶切,將pBI121質粒用X6al和5"acI雙酶切反應體系和條件同步驟(2),酶切產物用1%~ 1.5%瓊脂糖凝膠電泳後用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝膠回收試劑盒(購自Qiagen 公司)回收純化,操作方法同試劑盒說明書;(4)將pBI121酶切產物用T4DNA連接酶與相應 的NLS序列的PCR酶切產物連接,連接反應體系為IO ul: pBI121酶切產物4 lU、 NLS序列PCR 酶切產物4 yl、 T4 DNA連接酶1 ixl、 10XBuffer 1 ul; 16 。C反應15 20 h: (5)將連接 產物轉化大腸桿菌DH5a ,獲得的陽性克隆基因即為本發明的新基因,命名為/7tA4-""。/77逮因通過公知的農桿菌介導法導入到柑橘感病品種甜橙中,轉基因植株經離 體接種柑橘潰瘍病菌表現出很強的抗性。 實施例2以從湖南省衡陽市南嶽區柑橘潰瘍病疫區分離的柑橘潰瘍病菌為模板,以P1 /P4為模 板,利用PCR方法擴增出NLS序列,PCR產物用1W 1.5W瓊脂糖凝膠電泳後回收純化,純化產 物用15 25 nl無菌水溶解;回收片斷用J6a I和5fea I雙酶切;酶切反應體系為20 iU:純 化產物15 ul、兩種酶各l. 5 ul、 10XBuffer2 u 1;將pBI121質粒用/力a I和5Jaa I雙酶切。 酶切產物用1% 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳後回收純化。將pBI121酶切產物與NLS序列的PCR酶切產 物用T4 DNA連接酶連接,連接反應體系為IO yl: pBI121酶切產物4 u 1、 NLS序列PCR酶切產 物4 ul、 T4 DNA連接酶lwl、 10XBuffer 1 ul。 16 'C反應15 20 h。將連接產物轉化大 腸桿菌DH5a,獲得的陽性克隆基因即為本發明的新基因,命名為/^W-"7s。將ptA4-T7^S因通過公知的農桿菌介導法導入到柑橘感病品種甜橙中,轉基因植株經離 體接種柑橘潰瘍病菌表現出很強的抗性。實施例3以從湖南省衡陽市南嶽區柑橘潰瘍病疫區分離的柑橘潰瘍病菌為模板,以P2 /P3為模 板,利用PCR方法擴增出NLS序列,PCR產物用W 1.5劣瓊脂糖凝膠電泳後回收純化,純化產物 用15 25 wl無菌水溶解;回收片段用5affl/ZI和5scI雙酶切;酶切反應體系為20 u 1:純化產物15 ul、兩種酶各1.5 ul、 10XBuffer 2 ul;將pBI121質粒用Sa7z/ZI和&c I雙酶切。 酶切產物用1% 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳後回收純化;將pBI121酶切產物與NLS序列的PCR酶切產 物用T4 DNA連接酶連接,連接反應體系為IO ul: pBI121酶切產物4 nl、 NLS序列PCR酶切產 物4 nl、 T4 DNA連接酶1 ul、 lOXBuffer 1 ul。 16 。C反應15 20 h;將連接產物轉化大 腸桿菌DH5a,獲得的陽性克隆基因即為本發明的新基因,命名為/^力/l-y^s。將;^A4-T77連因通過公知的農桿菌介導法導入到柑橘感病品種甜橙中,轉基因植株經離 體接種柑橘潰瘍病菌表現出很強的抗性。序列表〈uo〉鄧子牛抗柑橘潰瘍病;7^4-"fe基因及其構建方法與應用〈130〉〈160>1<210〉1<211〉13678<212〉DNA〈213〉地毯黃單孢桿菌柑橘致病變種(Xanthomonas axonopodis pv. citri) 〈220〉〈222〉 (5821) ... (6639) 1tgagcgtcgcaaaggcgctcggtcttgccttgctcgtcggtgatgtacttcaccagctcc60gcgaagtcgctcttcttgatggagcgcatggggacgtgcttggc幼tcacgcgcaccccc120cggccgttttagcggctaaaa卿tcatggctctgccctccgcccatcat180gaccttgccaagctcgtcctgcttctcttcgatcttcgccagcagggcgaggatcgtggc240atcaccgaaccgcgccgtgcgcgggtcgtcggtgagccagagtttcagcaggccgcccag300gcggcccaggtCgCC3ttg8tgcgggcc兆ctcgcggscgtgctcatagtccacgacgcc360cgtgaUttgtagccctggccgacggccagcaggtaggccgacaggctcatgccggccgc420cgccgccttttcctcaatcgctcttcgttcgtctggaaggcagtacaccttgat8Lggtgg480gctgcccttcctggttggcttggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgcc540ggCggtElgCCggccagcctcgc卿gcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcg犯ta600agggacagtga3g犯gg肌cacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccgg660ctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggca犯atcctgtata720tcgtgcgaaa犯ggatggateitaccgaa犯aatcgctataatgaccccgaagcagggtta780tgcagcggaaaagcgccacgcttcccg犯ggg柳犯ggcggacaggtatccggt犯gcg840gC3gggtCggaacaggagagCgC3Cg3gggagcttcc3ggggga犯cgcctggtatcttt900atagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttg鄉gtcgatttttgtgatgctcgtcag960gggggcggagcctetgga犯aacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctttt1020gctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgta1080ttaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagCgC3gCg3gt1140C3gtg3gCg3ggaagcggaag3gcgcc卿aggccgccag柳ggccgeigcgcggccgtg1200aggcttggacgCt鄉gC3gagcccgtagcgggctgctacgggcgtctga1260cgcggtggaaagggggaggggatgttgtctacatggctctgctgtagtgagtgggttgcg1320ctccggcagcggtcctgatcaatcgtcaccctttctcggtccttcaacgttcctgacaac1380gagcctccttttcgccaatcC3tCg3C犯tC3CCgCg8gtccctgctcgaacgctgcgtc1440cggaccggcttcgtcgaaggcgtctatcgcggcccgcaacagcggcgagagcggagcctg1500ttcaacggtgccgccgcgctcgccggca/tcgctgtcgccggcctgctcctcaagcacggc1560aagtagctgattgtcatcagcgcattgacggcgtccccggccgaaaaacc1620cgcctcgcagagg犯gcgaagctgcgcgtcggccgtUccatctgcggtgcgcccggtcg1680cgtgccggcatggstgcgcgcgccatcgcggt鄉cgagcagcgcctgcctg卿ctgcg1740ggcattcccgatcagaaatgagcgccagtcgtcgtcggctctcggcaccgaatgcgtatg1800attctccgcc3gC3tggCttcggccsgtgcgtcg柳agcgcccgcttgttcctgaagtg1860ccagtaaagcgccggctgctgaacccccaeLccgttccgccagtttgcgtgtcgtcagacc1920gtctacgccgacctcgttcaacaggtccagggcggcacggatcactgtattcggctgcaa1980ctttgtcatgcttgacactttatcactgataaacataatatgtccaccaacttatcagtg2040cgcgcgttca3tCgg3CC3gcggaggctggtccggsggccagacgtga犯2100cccaacatacccctgatcgtaattctgagcactgtcgcgctcgacgctgtcggcatcggc2160ctgattatgccggtgctgccgggcctcctgcgcgatctggttcactcgaacgacgtcacc2220gcccactatggcattctgctggcgctgt8tgcgttggtgcaatttgcctgcgc犯ctgtg2280ctgggcgcgctgtcggatcgtttcgggcggcggccaatcttgctcgtctcgctggccggc2340gccagatctggggaaccctgtggttggcatgcacatacaaatggacgaacggataaacci;2400tttcacgcccccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacc2460cgcc肪tstatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcggg犯scgac幼tctgai2520tcatgagcggagaatt犯ggg3gtC3Cgttatgacccccgccgatgacgcggg3C卿CC2580gttttacgtttggaactgacag犯ccgc肪cgttg犯ggagccactcagccgcgggtttc2640tggagtttaatgagct犯gcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttca犯agtcgcc2700ta兆gtcactatcagctagctgtcaaa幼tgctccactgacgttccataa2760attcccctcggtatcc犯ttagagtctcsttattcactctcatctgcaccg2820gatctggatcgtttcgcatgattgaacaagcgcaggttctccggccgctt2880gggtgg柳ggctattcggctatgactgggcacaacagac犯tcggctgctctgatgccg2940ccgtgUccggctgtcsgcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccg3000gtgccctgaatg肌CtgCELggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcg3060ttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactg肌gcggg犯gggactggctgctattgg3120gcg肪gtgccctcctgtcatctceiccttgctcctgccgagaaagtatcca3180tcatggctgatgc犯tgcggCggCtgC£lt3cgcttgatccggctacctgcccattcgacc3240accaagcgaaac3tcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatc3300aggatgatctggELCg卿agcatc郷ggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctca33603ggCgCgC3tgcccgacggcgatgstctcgtcgtgacccstggcgstgcctgcttgccga34203t3tC3tggtgg犯aatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtgg3480cggaccgctfttcaggacatagcgttggctscccgtgatattgctg犯gagcttggcggcg3540aatgggctga>ccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcg3600ccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcg3660cc犯gcgeicgcccaacctgcC3tC3Cg3g3tttcgattccaccgccgccttctatgaaag3720gttgggcttcgg犯tcgttttccgggacgccggctggstgatcctccagcgcggggatct3780catgctggagttcttcgcccacgggatctctgCgg犯C3ggcggtcg卿gtgccgatat3840cattacgacagc犯cggccgcgccacgatcctgagcgacaatatgalcgg3900gcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcet卿ccgagatgcaccg3卿cgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgCC8C3g3CCCggstgstccc4020cgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattg犯tcctgttgccggtcttgc4080gatgattatcatat肪tttctgttg幼ttacgtt幼gcatgtaataattaacatgtaatg4140catgacgttagggttttt3tgattagagtcccgcaattat4200cgcgatagaa3gcgcgca肌ctaggat肌attatcgcgcgcggtgtcatc4260tatgttactEtgatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtg4320gcggctctgagggtggtggctctg鄉gtggcggttctgagggtggcggctctgagggag4380gcggUccggtggtggctctggttccggtgattttgattagcaaacgcta44403t肌gggggCtstgaccg犯犯tgccgatg犯肪cgcgctacagtctgacgcta幼ggca4500aacttgattctgtcgctactgatt£LCggtgCtgCt3tCg3tggtttcattggtgacgttt4560ccggccttgct朋tggt肪tggtgctactggtgattttgctggctct幼ttccca犯tgg4620tgacggtgataattcacctttttccgtcaatatttacctt4680ccctccctcatgtcgcccttUgtctUggcccaatacgc^犯ccgcctc4740tccccgcgcgttggccgattcattaatgcagCtggC3Cg3caggtttcccgsct 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權利要求
1.一種抗柑橘潰瘍病pthA-nls基因,其特徵在於,具有如下序列tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctccgcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccccggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcatgaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggcatcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccaggcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcccgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc gacaggctca tgccggccgccgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgggctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgccggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaataagggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccggctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtatatcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggttatgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcggcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 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2. —種如權利要求l所述的抗柑橘潰瘍病ptM-nls基因的構建方法,其特徵在於,包括以 下步驟(1)引物設計,根據基因銀行登記序列號為U28802的ptvW基因序列設計潰瘍病核定 位信號的特異性引物引物名稱序列引入酶切位點上遊引物pl5' -gactctagagttgcccagttatctcgccctga-5' -ga卿tccgttgcccagttatctcgccctga-3勘Ip2下遊引物P35 z -gcctcgagcaaccatgcgagctcctcttcgttg a-3' 5' -cccggggcctcgagc犯ccatgcgagctcctct tcgt-3'lp45"鵬I;(2) NLS序列的克隆,以P1/P3、 Pl/P4、 P2/P3或P2/P4為引物,以從湖南省柑橘潰瘍病疫 區分離的柑橘潰瘍病菌為模板,利用公知的PCR方法擴增出NLS序列,PCR反應條件為94°C4 min; 94 °C 30 sec、 58 °C 30 sec、 72 °C 1. 5 min, 35個循環,最後72 。C延伸10 min; (3) PCR產物回收及酶切,PCR產物用W 1.5W瓊脂糖凝膠電泳後用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝膠回收試劑盒回收純化,純化產物用15 25 iU無菌水溶解;回收片段用Ztel和5"acI 雙酶切,其中引物P1 /P4擴增產物採用/6al和5^al雙酶切;引物P2 /P3擴增產物採用 fe/^I和&c I雙酶切;引物P2 /P4擴增產物採用fe/myi和5"3C I雙酶切;酶切反應體系為20 Ul:純化產物15ul、兩種酶各1.5 ixl、 10XBuffer 2 ul;酶切條件為37 。C 5 10 h; 酶切產物用1% 1.5%瓊脂糖凝膠電泳後用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝膠回收試劑 盒回收純化;(4)植物表達載體雙酶切,將基因銀行登記序列號為AF485783的pBI121質粒用 J6a I和&c I雙酶切,其中,如連接擴增P1 /P4產物則用J6a I和5〉肪I酶切,連接P2 /P3擴增 產物用5a/zz//1和&c I酶切;連接P2 /P4擴增產物用5a/7z//1和5"ac I酶切;酶切反應體系和條 件同步驟(3);酶切產物用1% 1.5%瓊脂糖凝膠電泳後用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA 凝膠回收試劑盒回收純化;(5)連接,將pBI121酶切產物用T4 DNA連接酶與相應的NLS序列 的PCR酶切產物連接,連接反應體系為10 ul: pBI121酶切產物4 ii 1、 NLS序列PCR酶切產物4 ul、 T4 DNA連接酶1 ul、 10XBufferl ul; 16 。C反應15 20 h; (6)克隆,將連接產物 轉化大腸桿菌DH5a,獲得的陽性克隆基因,命名為/^力力-/ 7&
3.如權利要求l所述的抗柑橘潰瘍病pthA-nls基因在柑橘抗潰瘍病育種中的應用。
全文摘要
抗柑橘潰瘍病pthA-nls基因及其構建方法與應用。本發明利用柑橘潰瘍病的致病基因pthA介導廣譜抗性原理,構建了抗柑橘潰瘍病的新基因pthA-nls。其構建方法包括以下步驟(1)引物設計;(2)NLS序列的克隆;(3)PCR產物回收及酶切;(4)植物表達載體雙酶切;(5)將pBI121酶切產物用T4 DNA連接酶與相應的NLS序列的PCR酶切產物連接;(6)將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,獲得陽性克隆基因pthA-nls。基因pthA-nls可進一步對柑橘的感病品種進行遺傳轉化,獲得抗柑橘潰瘍病的新種質。本發明之抗柑橘潰瘍病pthA-nls基因為柑橘抗潰瘍病育種提供了有效工具。
文檔編號C12N15/10GK101260399SQ20081003080
公開日2008年9月10日 申請日期2008年3月13日 優先權日2008年3月13日
發明者張家銀, 磊 徐, 娜 李, 莉 楊, 胡春華, 鄧子牛 申請人:鄧子牛

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