一種新型噬菌粒展示載體pCANTAB5M的製作方法

2024-02-29 13:36:15

專利名稱：一種新型噬菌粒展示載體pCANTAB5M的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗體工程技術領域，特別涉及一種應用於噬菌體展示技術的新型噬菌粒展示載體。
背景技術：
噬菌體展示技術是目前應用得最為廣泛的分子展示技術，是利用細菌的病毒，如絲狀噬菌體M13作為載體，將基因和基因產物有機的結合起來。由此衍生的其它展示系統的基本原理都是一樣的，只是載體和宿主細胞不同而已。1985年，美國Missouri大學的Smith GP第一次將外源基因插入絲狀噬菌體(Filamentousbacteriophage, fd)的基因組,使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示，從而創建了噬菌體展示技術(Smith G P, Science, 1985,228(4705) :1315-1317)。1994年McCaffery等最先構建了曬菌體抗體展示文庫，開始了曬菌體展示技術應用的新時代(McCafferty J, et al, Nature, 1990, 348 :552-554) 如今卩遼菌體展示技術已被廣泛用於抗體庫的展示以及多肽和酶的製備中。噬菌體展示抗體庫通過直接將特定分子的基因型與表型相連接，統一於同一病毒顆粒內，這樣通過「吸附-洗脫-擴增」的富集過程，就可以篩選到有特定結合功能的蛋白，同時可有效地從抗體庫中篩選出特異性抗體的可變區基因。噬菌體抗體庫的用途主要有兩個方面一是可以製備人源抗體；二是可以優化抗體結構，提高抗體的高通量表達。這對抗體的製備和應用有著深遠的意義。到目前為止，研究人員已開發出數種常用的噬菌體展示系統，根據研究的側重點可選用相應的展示系統。如絲狀噬菌體展示系統，可以篩選出以分泌形式釋放的高親和力和高拷貝數的配體，並且絲狀噬菌體具有很好的免疫原性，在進行生物疫苗研製開發方面具有重要價值；、噬菌體展示系統和T4噬菌展示體系統容量較大，不易篩選高親和力配體；17噬菌體展示系統是目前最為理想的展示系統(徐潔，顧東生等.中國生物工程雜誌，2009，29 (2) :11-16)，能以多種拷貝展示不同分子量的蛋白，如將目的基因與IOB的17外殼蛋白的基因融合，可在17噬菌體表面展示高達400拷貝的大分子蛋白。噬菌體展示的載體主要分為噬菌粒展示載體和噬菌體展示載體兩大類。噬菌粒載體是一類帶有噬菌體複製起始點的質粒載體。它巧妙的組合了質粒和噬菌體的特徵，是一種人工構建的含有單鏈噬菌體包裝序列、複製子以及質粒複製子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體。噬菌粒需要輔助噬菌體(helper phage)來提供複製和包裝所需的蛋白酶和外殼蛋白。它在細菌的細胞中出現有輔助噬菌體的情況下，可被誘導成單鏈DNA噬菌粒，可以像噬菌體或質粒一樣複製。噬菌粒具有以下令人矚目的特徵1.雙鏈DNA既穩定又高產，具有常規質粒的特徵；2.免除了將外源DNA片段從質粒亞克隆於噬菌體載體這一繁瑣又費時的步驟；3.由於載體足夠小，故可得到長達IOkb的外源DNA區段的單鏈。其中Lerner實驗室以pBluescript為基礎構建的載體pCBAKS, pComb3, plomb8,主要用於Fab抗體庫的構建，以PUC為基礎構建的pHEN載體，用於構建ScFv抗體庫，Winter實驗室以I3UCl 19為基礎構建了 pCANTAB系列載體。pCANTAB5E載體是由Pharmacia的Jackson等人於1992年構建的一種卩遼菌粒載體，其中含有氨苄抗性基因(Amp)，Plac啟動子及M13噬菌體間隔區片段，用於克隆ScFv基因的Sfi I,Not I克隆位點及Etag序列和瑚珀終止碼TAG，該載體被廣泛地應用於噬菌體抗體庫的構建過程中。1999年，潘衛、戚中田首次對PCANTAB5E進行了改造，通過PCR技術將限制酶切點Xba I和HGV C片段引入新的噬菌體展示載體PCANTAB5X中，在一定程度上提高了克隆效率(潘衛，戚中田，第二軍醫大學學報，1999，Oct，20 (10)，723-725)。但是在使用過程中發現，pCANTAB5X展示隨機肽庫時有些重組噬菌體的庫容及滴度較低，很少篩選到插入SOObp以上插入片段，於是沈毅等對PCANTAB5X進行了改進，構建了新的載體pCANTAB5L，將常用內切酶位點增加到5個，並引入了柔性多肽接頭[G4S]3與大腸桿菌稀有密碼子，不僅改善 了庫容量較低的問題，並且對形成和維持活性功能起到促進作用(沈毅、潘衛等，第二軍醫大學學報，2003Mar, 24 (3)，298-302)。2004年，徐容等對pCANTABL載體的限制性內切酶位點進行了閱讀框的校正，進一步得到了改進後的載體PCANTAB5S，並成功應用該載體展示了葡萄球菌A蛋白的5個抗體結合結構域及大消化鏈球菌屬蛋白L的B3結構域，顯示了該載體廣闊的應用前景。但是，該載體仍然存在一些缺陷，PCANTAB5E載體本身使用的限制性內切酶位點為Not I和Sfi I，這為後續的抗體庫構建和庫容量提高帶來了很多不利影響。首先，因為兩種限制性內切酶的最佳作用溫度不同，所以導致在操作過程中增加了操作步驟，不利於抗體庫庫容的提高，而且帶來不必要的浪費；其次，Not I的酶切位點是一種G(鳥苷酸)、C(胞嘧啶)含量比較高的限制性內切酶位點，因此在酶切時需要過量的酶和較長的時間才能達到理想的效果；最後，Sfi I是一種具有位點優勢效應的酶，酶切效率不高，因此對PCANTAB5E載體進行改造，使其更加適用於噬菌體抗體庫的構建是具有非常重要的應用價值的。我們改造後的pCANTAB5M 載體，引入了 Xba I、Stu I、EcoRV 和 KpnI等4個常用的限制性內切酶位點，這些酶的最佳工作溫度均為37°C，而且基本上都可以使用雙酶切系統，簡化了後續的試驗操作，為更好的提高庫容提供了可能性。此外，我們還在新的噬粒載體上引入了 His和Myc兩種常用的蛋白標籤，可以用來鑑定展示的噬菌體中是否有目標蛋白的表達。最後，我們引入的BGH序列，也為噬菌體抗體庫後期的陽性克隆測序鑑定提供了方便的測序引物。

發明內容
本發明通過使用分子生物學技術，在PCANTAB5E載體的Sfi I和Not I酶切位點之間插入了 Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4個常用內切酶克隆位點，為噬菌體展示技術提供了改進的新型噬菌粒載體PCANTAB5M，如圖I所示。該載體不僅可以方便地進行多位點克隆，提高克隆效率與庫容量，而且可以用來鑑定展示的噬菌體中是否含有目標蛋白表達，方便陽性克隆測序鑑定工作。針對pCANTAB5E載體存在的上述問題，本發明引入了 Xba I、Stu I,EcoR V和KpnI等常用的限制性內切酶位點，這些酶的最佳工作溫度均為37°C，而且基本上都可以使用雙酶切系統，簡化了後續的實驗操作，進一步提高了克隆效率與庫容能力。除此之外，改進後的載體PCANTAB5M還增加了一些新的功能。本發明在載體中引入了 His和Myc兩種常用的蛋白標籤，這兩種標籤可以用來鑑定展示的噬菌體中是否有目標蛋白的表達，為陽性噬菌粒克隆的鑑定工作提供一種更為準確的檢測工具。同時，本發明還在新的噬菌粒載體中引入了 BGH序列，BGH序列是通用引物，它的引入極大地簡化了噬菌體抗體庫後期的陽性克隆的測序鑑定工作。改良後的噬菌粒載體PCANTAB5M適用於展示各種抗體庫，隨機肽片段和功能蛋白。應用PCANTAB5E噬菌粒己成功地展示了抗跨膜糖蛋白⑶22抗原的抗體庫。本發明的技術方案如下本發明提供了一種新型的噬菌粒展示載體pCANTAB5M，該載體是由噬菌粒PCANTAB5E及其Sfi I和Not I酶切位點之間插入的linker核苷酸片段組成，所述的 linker核苷酸片段包含a. Xba I、Stu I、EcoRV 和 Kpn I 酶切位點；b.序列為 GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG 的 myc 標籤；c.序列為 CATCATCATCATCATCAT 的 His 標籤；d.序列為CCTCGACTGTGCCTTCTA的通用測序引物BGH。所述的pCANTAB5E載體，是由pCANTAB5E載體先後經過限制性內切酶Not I、SfiI酶切後回收而得。所述的linker核苷酸片段，來源於載體p⑶NA 3. 1/myc-His㈠，即以載體pCDNA 3. 1/myc-His (-)為模板，通過PCR擴增而得。所述的linker核苷酸片段，包含Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4個常用內切酶克隆位點，其中Stu I酶切位點通過在引物中引入Stu I酶切位點核苷酸序列後PCR擴增而得。除上述4個酶切位點，該多克隆位點區還包含Xho I、BstX I、EcoR I、BstX I、BamH
I、Asp718 I, Hind III 和 Apa I 酶切位點。本發明提供了一種新型噬菌粒展示載體PCANTAB5M，其linker核苷酸片段具有SEQ ID NO I所示的序列。本發明提供了噬菌粒展示載體PCANTAB5M用於展示抗體庫、隨機肽庫和功能靶蛋白的用途。本發明提供了噬菌粒展示載體pCANTAB5M用於展示⑶22抗體的用途。


圖I :新型噬菌粒載體pCANTAB5M。圖2 :Linker序列PCR擴增結果。圖3 pCANTAB5M陽性克隆菌液PCR鑑定結果。圖4 pCANTAB5M陽性克隆酶切鑑定結果。圖5 :應用pCANTAB5M噬粒載體構建的⑶22抗體庫ELISA標籤檢測結果。
具體實施例方式本發明的實施方案通過下列實施例舉例說明。然而本發明的實施方案不限於這些實施例的特定細節，因為對於本領域的普通技術人員來說，其它的變化是已知的，或根據直接公開的內容和附屬的權利要求是顯而易見的。因此，凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。本文引用的參考文獻以其全文通過引用併入本文。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例I :pCANTAB5M重組載體的構建I、linker序列的引物設計依據pCANTAB5E 載體與 pO)NATM3. 1/myc-His (-)載體的序列設計 linker 序列 PCR 擴展引物如下MH-SenseGCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCCTCTAGACTCGAGAGGCCTCCMH-AntisenseTTTTCCTTTTGCGGCCGCTAGAAGGCACAGTCGAGGCTGATCAGCGGT2、I inker序列的擴增以pcDNA 3. 1/myc-His (-)質粒為模板，以 MH-Sense、MH-Antisense 為引物擴增linker序列。在擴增的同時，由於引物中Stu I酶切位點基因序列的引入，pcDNA 3. I/myc-His(-)載體原有的Not I酶切位點被突變成為Stu I酶切位點，通過擴增，從而得到了包含Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I四個酶切位點，myc、His標籤和BGH通用測序引物的 linker 序列。擴增體系為pcDNA 3. 1/myc-His (-)質粒模板 0. 5 u L, MH-Sensell U 1，MH-Antisense I u l,dNTP 4u I, IOx buffer 5 y 1，Taq 聚合酶 0. 5 y 1，ddH20 38 yl。擴增條件為95°C 5min，一個循環；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，30 個循環；72°C lOmin，一個循環。電泳結果如圖2所示，I號泳道是天根生化科技有限公司DNA marker III，2號泳道是linker序列PCR擴增的結果。電泳結果表明擴增得到的linker條帶單一、清晰、位置正確。3、I inker序列的回收使用Axygen公司DNA膠回收Kit回收linker序列，並進行DNA含量測定，檢測結果顯示linker DNA濃度為70ng/ul。4、pCANTAB5E載體和linker序列的雙酶切使用限制性內切酶Not I (購自New England Biolabs Inc.)分別過夜酶切PCANTAB5E載體和linker序列，然後回收酶切後的載體和linker序列片段。使用限制性內切酶Sfi I (購自New England Biolabs Inc.)再次過夜酶切回收後的載體和linker序列片段，然後二次回收雙酶切的載體和linker片段，定量備用。5、雙酶切片段的連接與轉化將經過Not I和Sfi I雙酶切的載體序列與linker序列連接過夜，轉化TGl大腸桿菌感受態細胞，塗2YTAG培養基平板，370C，靜置，過夜培養。6、陽性克隆的鑑定從連接產物的轉化平板上挑取12個克隆分別進行酶切鑑定和菌液PCR鑑定。擴增體系為菌液 I y I，MH-Sense lul, MH-Antisense lul, dNTP 4 u I, IOx buffer 5 U I,Taq 聚合酶 0. 5ii l，ddH20 38 u I0 擴增條件為95°C 5min，一個循環；95°C 30s, 56°C 30s,72°C 30s，30 個循環；72°C lOmin，一個循環。鑑定結果如圖3所不，I號和14號泳道為天根生化科技有限公司DNA marker III,2號泳道到11號泳道分別為克隆12到克隆3，12號泳道為克隆1，13號泳道為克隆2。菌液PCR結果表明只有克隆I為陽性克隆。提取12個陽性克隆中的質粒，用限制性內切酶EcoRI與EcoRV(購自New England Biolabs Inc.)進行雙酶切，37°C，過夜酶切。酶切結果如圖4所示，I號泳道為天根生化科技有限公司DNA marker III，2號泳道到13號泳道分別為克隆12到克隆I。酶切結果表明只有I號克隆為陽性克隆，可以切出大小正確的兩條目標條帶。7、測序驗證pCANTAB5M重組載體將PCANTAB5M質粒的陽性克隆Cl送英俊公司進行核苷酸序列測定，檢測採用BGH 和SI兩種引物並雙向測通，檢測結果表明Cl與目標序列完全匹配。序列匹配結果如下所示，所插入的linker序列如SEQ ID NO 1所示。
權利要求
1.ー種新型的噬菌粒展示載體PCANTAB5M，由噬菌粒pCANTAB5E及其Sfi I和Not I酶切位點之間插入的linker核苷酸片段組成,所述的linker核苷酸片段包含 a.Xba I、Stu I、EcoRV 和 Kpn I 酶切位點； b.序列為GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG 的 myc 標籤； c.序列為CATCATCATCATCATCAT 的 His 標籤； d.序列為CCTCGACTGTGCCTTCTA的通用測序引物BGH。
2.根據權利要求I所述的曬菌粒展示載體PCANTAB5M,其特徵在於,所述的linker序列如SEQ ID NO 1所示。
3.根據權利要求1、2任一所述的噬菌粒展示載體pCANTAB5M用於展示抗體庫、隨機肽庫和功能靶蛋白的用途。
4.根據權利要求3所述的噬菌粒展示載體pCANTAB5M用於展示⑶22抗體的用途。
全文摘要
本發明公開了一種新型噬菌粒展示載體pCANTAB5M及其製備方法和應用。該載體對商用載體pCANTAB5E進行了改進，在Sfi I和Not I酶切位點之間插入了Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4個常用的內切酶克隆位點，同時在載體中引入了Myc標籤和His標籤及通用測序引物BGH。這樣的改進簡化了外源基因的定向克隆操作，提高了庫容量與克隆效率，使得陽性噬菌粒克隆的鑑定更為準確，極大地方便了陽性克隆的測序驗證工作。本發明適用於展示各種隨機肽庫，抗體庫和各種功能靶蛋白。
文檔編號C12N7/01GK102676569SQ20121014214
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者劉志剛, 劉方傑, 尹琪, 王康, 白先宏, 馬金偉 申請人:百泰生物藥業有限公司