人cit基因和egfr基因治療腫瘤的用途及其相關藥物的製作方法

2024-01-21 17:39:15 3

人cit基因和egfr基因治療腫瘤的用途及其相關藥物的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體公開了單獨的人CIT基因；以及人CIT基因與人EGFR基因作為協同施藥靶標，在製備或篩選腫瘤治療藥物中的用途。本發明還進一步構建了CIT基因小幹擾RNA、CIT基因幹擾慢病毒載體、CIT基因幹擾慢病毒，並公開了他們在與EGFR基因協同治療腫瘤中的用途。本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的慢病毒載體、慢病毒能夠特異性抑制人CIT基因和/或人EGFR基因的表達，尤其是慢病毒，本發明的CIT基因幹擾慢病毒能單獨、或者與EGFR基因幹擾慢病毒協同抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】人ClT基因和EGFR基因治療腫瘤的用途及其相關藥物

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體地涉及單獨的人CIT基因；以及人CIT基因和人 EGFR基因協同治療腫瘤的用途及其相關藥物。

【背景技術】
[0002] 目前腫瘤的基因治療已經取得了蓬勃快速的發展，但是迄今為止，仍然存在很多 需要解決的問題。目前用於腫瘤基因治療的基因太少，能抑制腫瘤生長的基因為數不多，急 需提供更多可利用的基因。另外，由於腫瘤的發生、發展、轉移等過程是一個多基因參與、涉 及多條信號通路的複雜網絡系統，因此單個基因治療或單一治療方法往往療效有限。因此， 未來基因治療發展的重點將在於挖掘並鑑定在臨床上有重要價值的基因，探索多個具有不 同抗腫瘤作用機理的基因聯合治療以及將多基因靶向藥物聯合治療等。
[0003] CIT citron (Rh〇-interacting, serine/threonine kinase21,與 Rho 相互 作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶21)含有一個與ROCK (Rho-associated kinase, Rho連 接激酶）相似的蛋白激酶結構域，此異構體稱為Citron-K，是第一個已知的Rho-GTP下 遊靶點，具有依賴細胞周期表達的特點。Citron-K聚集在間期細胞中，有絲分裂前中 期分散在胞漿，後期分布在細胞皮質，末期積聚在卵裂溝（Madaule P，Eda M，Watanabe N，et al. Role of citron kinase as a target of the small GTPase rho in cytokinesis. Nature. 1998;394(6692):491-494. Paramasivam M，Chang YJ，Lotrco JJ. ASPM and citron kinase co-localize to midboby ring during cytokinesis. Cell Cycle. 2007:6(13) 105-1612)。Citron激酶在細胞質分裂過程中調節肌球蛋白收縮近 而調節細胞原菜運動（Yamashiro S，Totsukawa G，Yamakita Y et al. Citron kinase，a rh〇-dependent kinase, induces di-phosphorylation of regulatory light chain of myosin II. Mol Biol Cell. 2003; 14(5) :1745-1756.)。過表達 citron 基因的變異體導致 產生多核細胞，喪失激酶活性的變異體在細胞漿移動過程中出現異常收縮。
[0004] 有研究報導，citron基因在神經元形成和精子生成的部分生理過程中起著功 會巨性的作用（Di Cunto F, Imarisio S, Hirsch E，et al. Defective Neurogenesis in Citron Kinase Knockout Mice by Altered Cytokinesis and Massive Apoptosis. Neuron2000;28(1):115-127.Di Cunto F，Imarisio S，Camera P，et al. Essential role of citron kinase in cytokinesis of spermatogenic precursors.J Cell Sci. 2002; 115 (Pt24) :4819-4826.)，敲除citron基因後的小鼠出生幾周內就會出現畸形 或由於運動失調或癲癇症而死亡（Di Cunto F，Imarisio S，Hirsch E，et al. Defective Neurogenesis in Citron Kinase Knockout Mice by Altered Cytokinesis and Massive Apoptosis. Neuron2000; 28 (1) : 115 - 127.)。同時，Citron-K 對於未分化雄性配子細胞前 體生理擴張是必需的，並確保精原細胞轉變為精母細胞，Citron基因敲除雄性小鼠呈現雙 睪丸狀損害，而雌性小鼠的卵巢未出現形態學改變（Di Cunto F，Imarisio S，Camera P，et al. Essential role of citron kinase in cytokinesis of spermatogenic precursors. J Cell Sci.2002;115(Pt24):4819-4826.)。而且還有研究報導，Citron 基因還參與病 毒的複製過程（Atreya CD, Kulkarni S, Mohan KV. Rubella virus P90associates with the cytokinesis regulatory protein citron-K kinase and the viral infection and constitutive expression of P90protein both induce cell cycle arrest following S phase in cell culture.Arch Virol.2004;149 (4):779-789. Atreya CD, Mohan KV, Kulkarni S. Rubella virus and birth defects:molecular insights into the viral teratogenesis at the cellular level.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2004;70 (7):431-437. Loomis RJ, Holmes DA, Elms A et al.Citron kinase, a rho A effector, enhances HIV-lvirion production by modulating exocytosis. Traffic. 2006; 7 (12) : 1643-1653.)。因此，citron基因在一系列重要的生理過程中起著重 要的作用，Citron基因依賴細胞周期表達，在細胞有絲分裂中發揮重要的生理功能，而癌組 織是細胞不斷增值形成永生化，因此，Citron基因可能與腫瘤的發生具有一定的關係，有望 成為腫瘤基因治療的一個新靶點。
[0005] 表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor, EGFR) EGFR 是一種跨膜 蛋白質，屬於ErbB受體家族成員，其配體（EGF、TGF-a等）與EGFR胞外段結合使之二聚 化，由此導致胞內段酪氨酸激酶活化以及一系列信號轉導的級聯反應，促進細胞增殖，血管 生成，轉移並抑制細胞凋亡(梁後傑，鄒嵐.EGFR靶向藥物治療晚期結直腸癌最新進展.中 國處方藥2009; 84:58-61.)，從而導致腫瘤的發生。大量研究發現EGFR基因在多種腫瘤組 織中過表達或異常活化，從而使腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移能力增強。EGFR已成為經臨床 驗證的多種類型腫瘤的治療祀點（Ciardiello F，Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med2008;358:1160-1174. )〇
[0006] RNAi是利用雙鏈RNA介導的序列特異性的轉錄後基因沉默現象，已成為研究 基因功能的一種新興的有效手段，並有望成為腫瘤等疾病基因治療的工具（Izquierdo M.Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.Cancer Gene Ther. 2005; 12(3) :217-27.)。慢病毒（lentivirus)載體是高效的基因轉導工具，主要用於 感染對常規方法轉染效率較低的細胞，如原代細胞等。慢病毒顆粒可同時感染增殖和非增 殖的細胞，且感染比較穩定、持久。運用慢病毒載體，可實現特定基因的高表達，也可以表 達髮夾結構 RNA (short hairpin RNA，shRNA)以 RNA 幹擾（RNA interference，RNAi)方式 下調某基因的表達。本發明擬採用慢病毒介導的RNAi技術研究CIT基因在與EGFR基因協 同抑制腫瘤細胞增殖中的功能，為惡性腫瘤的非手術臨床治療提供理論依據。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的在於公開了 CIT基因作為癌症治療的靶標，治療腫瘤的用途及其相 關藥物；以及將CIT基因和EGFR基因共同作為癌症治療的靶標，通過同時沉默CIT基因和 EGFR基因的表達，實現協同治療腫瘤的用途，及其腫瘤治療藥物。
[0008] 本發明以RNA幹擾為手段，研究了單獨的CIT基因在腫瘤發生和發展中的作用，以 及，CIT基因與EGFR基因在腫瘤發生和發展中的協同作用，公開了一種抑制或降低腫瘤細 胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括：向腫瘤細胞施用一種能夠特異性抑制 CIT基因和/或EGFR基因的轉錄、翻譯，或能夠特異性抑制CIT蛋白和/或EGFR蛋白表達 的活性的物質，以此來抑制腫瘤細胞的生長、增殖、分化或存活。
[0009] 本發明第一方面，公開了分離的人CIT基因在製備或篩選腫瘤治療藥物，或者在 製備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0010] 所述的腫瘤可以為其腫瘤細胞的增殖與人CIT基因的表達相關的任意一種腫瘤； 更進一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自：結腸癌。
[0011] 本發明中，所述人CIT基因作為針對腫瘤細胞的作用靶標應用於製備或篩選腫瘤 治療藥物，或者製備腫瘤診斷藥物。進一步的，所述針對腫瘤細胞的作用祀標為RNA幹擾作 用靶標。
[0012] 所述將分離的人CIT基因用於製備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內容：其 一，將人CIT基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於製備腫瘤治療藥物；其 二，將人CIT基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於篩選腫瘤治療藥物。
[0013] 所述將CIT基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於製備腫瘤治療 藥物具體是指：將CIT基因作為RNA幹擾作用的靶標，來研製針對腫瘤細胞的藥物或製劑， 從而提高或降低腫瘤細胞內CIT基因的表達水平。
[0014] 所述將CIT基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於篩選腫瘤治療 藥物具體是指：將CIT基因作為作用對象，對藥物或製劑進行篩選，以找到可以抑制或促進 人CIT基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發明所述的CIT基因小分子幹擾RNA (siRNA)即是以人CIT基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的 藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將CIT基因及其蛋白作為作用對象。
[0015] 所述將CIT基因用於製備腫瘤診斷藥物，是指將CIT基因表達產物作為一項腫瘤 診斷指標應用於腫瘤診斷藥物的製備。
[0016] 所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制CIT基因的轉錄或翻譯，或能夠特異性抑制 CIT蛋白的表達或活性的分子，從而降低腫瘤細胞中CIT基因的表達水平，達到抑制腫瘤細 胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0017] 本發明第一方面，還公開了分離的人CIT基因和人EGFR基因在製備或篩選腫瘤治 療藥物，或者在製備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0018] 本發明中，所述人CIT基因和人EGFR基因作為針對腫瘤細胞的作用靶標應用於制 備或篩選腫瘤治療藥物，或者製備腫瘤診斷藥物。進一步的，所述針對腫瘤細胞的作用祀標 為RNA幹擾作用靶標。
[0019] 所述將分離的人CIT基因和人EGFR基因用於製備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方 面的內容：其一，將人CIT基因和人EGFR基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應 用於製備腫瘤治療藥物；其二，將人CIT基因和人EGFR基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞 的作用靶標應用於篩選腫瘤治療藥物。
[0020] 所述將人CIT基因和人EGFR基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用 於製備腫瘤治療藥物具體是指：將CIT基因和人EGFR基因共同作為RNA幹擾作用的靶標， 研製能同時針對兩種基因的腫瘤治療藥物或製劑，從而提高或降低腫瘤細胞內CIT基因和 人EGFR基因的表達水平；或者，將CIT基因和人EGFR基因分別作為RNA幹擾作用的靶標， 來研製分別針對兩種基因的腫瘤治療藥物，從而獲得能提高或降低腫瘤細胞內CIT基因和 人EGFR基因表達水平的腫瘤治療藥物或製劑。
[0021] 所述將人CIT基因和人EGFR基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用 於篩選腫瘤治療藥物具體是指：將人CIT基因和人EGFR基因同時作為作用對象，對藥物進 行篩選，以找到可以分別影響(抑制或促進）人CIT基因表達的藥物和影響(抑制或促進）人 EGFR基因表達的藥物，然後作為腫瘤治療備選組合物藥物；或者找到可以同時影響(抑制 或促進）人CIT基因和人EGFR基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發明所述的 CIT基因小分子幹擾RNA(siRNA)、基因幹擾核酸構建體、慢病毒，以及EGFR基因小分子幹擾 RNA (siRNA)、基因幹擾核酸構建體、慢病毒，均是以CIT基因和EGFR基因分別為作用對象 篩選獲得的；當它們共同使用時，存在協同作用的效果，比單一一種物質的使用效果更好； 可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將 人CIT基因和人EGFR基因及其蛋白作為作用對象。
[0022] 所述將人CIT基因和人EGFR基因用於製備腫瘤診斷藥物，是指將CIT基因表達產 物和人EGFR基因表達產物作為腫瘤診斷指標應用於腫瘤診斷試劑的製備。
[0023] 本發明的所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制人CIT基因和/或人EGFR基因的 轉錄或翻譯，或能夠特異性抑制人CIT基因和/或人EGFR基因的表達或活性的分子，從而 降低腫瘤細胞人CIT基因和/或人EGFR基因的表達水平，達到抑制腫瘤細胞的增殖、生長、 分化、存活的目的。
[0024] 本發明製備或篩選的腫瘤治療藥物包括但不限於：核酸分子、碳水化合物、脂類、 小分子化學藥(例如抑制劑)、抗體藥、多肽、蛋白或幹擾慢病毒。
[0025] 所述核酸分子包括但不限於：反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內 切酶ΠΙ製備的小幹擾RNA (esiRNA)或者短髮夾RNA (shRNA)。
[0026] 所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人CIT基因和人EGFR基因的轉錄或翻譯， 或者足夠降低人CIT蛋白和人EGFR蛋白的表達或活性的劑量。以使人CIT基因和人EGFR 基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0027] 本發明中，當人CIT基因和人EGFR基因作為協同施藥靶標進行腫瘤治療和藥物篩 選時，是通過RNA幹擾的方法，以人CIT基因和EGFR基因作為RAN幹擾的靶基因，降低這兩 個基因的表達水平。
[0028] 所述的腫瘤可以為其腫瘤細胞的增殖與人CIT基因和人EGFR基因的表達相關的 任一種腫瘤；更進一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自：結腸癌。
[0029] 採用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法是通過單獨降低人CIT基因的表達水平 抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的，或者通過同時降低人CIT基因和人EGFR基因的表 達水平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的。具體的，治療時，將能有效降低人CIT基因 表達水平的物質；或者，將能有效降低人CIT基因和人EGFR基因表達水平的物質給藥於患 者。
[0030] 本發明第二方面公開了一種治療腫瘤的核酸分子藥物，其有效成分含有降低腫瘤 細胞中CIT基因表達的分離的核酸分子，以及降低腫瘤細胞中EGFR基因表達的分離的核酸 分子；所述降低腫瘤細胞中CIT基因表達的分離的核酸分子包含：
[0031] a)CIT基因雙鏈RNA，所述CIT基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與CIT基因 雜交的核苷酸序列；或者
[0032] b)CIT基因 shRNA，所述CIT基因 shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與CIT基因雜交 的核苷酸序列；
[0033] 所述降低腫瘤細胞中EGFR基因表達的分離的核酸分子包含：
[0034] A. EGFR基因雙鏈RNA，所述EGFR基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與EGFR 基因雜交的核苷酸序列；或者
[0035] B. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與EGFR基因 雜交的核苷酸序列。
[0036] 進一步的，所述腫瘤為結腸癌。
[0037] 較優的，所述CIT基因雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互 補共同形成RNA二聚體，並且所述第一鏈的序列與CIT基因的靶序列基本相同。
[0038] 較優的，所述EGFR基因雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈 互補共同形成RNA二聚體，並且所述第一鏈的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
[0039] 較優的，所述CIT基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈 片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，並且所述 正義鏈片段的序列與CIT基因的靶序列基本相同。
[0040] 較優的，所述EGFR基因 ShRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義 鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，並且所 述正義鏈片段的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
[0041] 更優的，所述shRNA的莖環結構的序列可選自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0042] 更優的，所述CIT基因的靶序列，為SEQ ID NO: 1所示序列；所述EGFR基因的靶序 列，為SEQ ID N0:2所示序列。
[0043] 所述CIT基因的靶序列即為siRNA用於特異性沉默CIT基因表達時，與所述siRNA 互補結合的mRNA片段所對應的CIT基因中的片段。同理，所述EGFR基因的靶序列即為 siRNA用於特異性沉默EGFR基因表達時，與所述siRNA互補結合的mRNA片段所對應的EGFR 基因中的片段。
[0044] 所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0045] 進一步的，所述雙鏈RNA為小幹擾RNA (siRNA)。
[0046] 最優的，CIT基因小幹擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :9所示，具體為 5' -GUCCUCAUACCAGGAUAAA-3'。SEQ ID N0 :9 所示的 CIT 基因 siRNA 的第一鏈為以 SEQ ID NO: 1所示的序列為RNA幹擾靶序列設計的針對人CIT基因的小幹擾RNA中的一條鏈，該第 一鏈與第二鏈組成的siRNA能夠起到特異性沉默腫瘤細胞中內源CIT基因表達的作用。
[0047] 最優的，EGFR基因小幹擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID N0:10所示，具體為 5' -GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3'。SEQ ID N0 :10 所示的 EGFR 基因 siRNA 的第一鏈為以 SEQ ID N0:2所示的序列為RNA幹擾靶序列設計的針對人EGFR基因的小幹擾RNA中的一條鏈， 該第一鏈與第二鏈組成的siRNA能夠起到特異性沉默腫瘤細胞中內源EGFR基因表達的作 用。
[0048] 最優的，所述CIT基因 shRNA的序列如SEQ ID N0:11所示，具體為： 5, -GCGUCCUCAUACCAGGAUAAA CUCGAG UUUAUCCUGGUAUGAGGACGC-3，。
[0049] 最優的，所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示，具體為： 5, -GUGGCUGGUUAUGUCCUCAUUCUCGAG AAUGAGGACAUAACCAGCCAC-3，。
[0050] 當用作治療腫瘤的藥物時，是將安全有效量的雙鏈RNA或shRNA施用於哺乳動物。 具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
[0051] 本發明第三方面，公開了一種治療腫瘤的慢病毒載體藥物，其有效成分含有CIT 基因幹擾慢病毒載體和EGFR基因幹擾慢病毒載體，所述CIT基因幹擾慢病毒載體含有編碼 前述CIT基因 shRNA的基因片段，所述EGFR基因幹擾慢病毒載體含有編碼前述EGFR基因 shRNA的基因片段。
[0052] 進一步的，所述腫瘤為結腸癌。
[0053] 所述CIT基因幹擾慢病毒載體是將編碼前述CIT基因 shRNA的DNA片段克隆入已 知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述CIT基因幹擾慢病毒載體經過病毒包裝 成為有感染力的病毒顆粒後，感染腫瘤細胞，進而轉錄出所述ShRNA，通過酶切加工等步驟， 最終獲得所述CIT基因小幹擾RNA，用於特異性沉默CIT基因的表達。EGFR基因幹擾慢病 毒載體同CIT基因。
[0054] 編碼所述CIT基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 1所示序列及其互 補序列。編碼所述EGFR基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID N0:2所示序列及其 互補序列。
[0055] 進一步的，本發明所述基因幹擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤 細胞中可被檢測的標記物的核苷酸序列；較優的，所述可被檢測的標記物如綠色螢光蛋白 (GFP)。
[0056] 進一步的，所述慢病毒載體可以選自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Ne。、pLKO. 1-Ne。、pLKO. 1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、 pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、 pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0057] 本發明第四方面，公開了一種治療腫瘤的慢病毒藥物，其有效成分含有CIT基因 幹擾慢病毒和EGFR基因幹擾慢病毒，所述CIT基因幹擾慢病毒由前述CIT基因幹擾慢病 毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成；所述EGFR基因幹擾慢病 毒由前述EGFR基因幹擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而 成。
[0058] 進一步的，所述腫瘤為結腸癌。
[0059] 本發明的慢病毒可感染腫瘤細胞並產生分別針對CIT基因或EGFR基因的小分子 幹擾RNA，從而抑制腫瘤細胞的增殖。該CIT基因幹擾慢病毒和EGFR基因幹擾慢病毒可用 於製備預防或治療腫瘤的藥物。
[0060] 本發明第五方面，公開了一種用於治療結腸癌的藥物組合物，其組成含有前述降 低腫瘤細胞中CIT基因表達的分離的核酸分子、CIT基因幹擾慢病毒載體、CIT基因幹擾慢 病毒中的至少一種；以及，前述降低腫瘤細胞中EGFR基因表達的分離的核酸分子、EGFR基 因幹擾慢病毒載體、EGFR基因幹擾慢病毒中的至少一種。
[0061] 優選的，上述成分為治療結腸癌的藥物組合物的藥效成分。
[0062] 當用作治療腫瘤的藥物時，是將安全有效量的雙鏈RNA、shRNA、或慢病毒施用於哺 乳動物。具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之 內的。
[0063] 本發明的藥物組合物中，特異性沉默CIT基因表達，以及特異性沉默EGFR基因表 達的有效成分發揮了協同治療的作用；本發明實施例記載，雙基因敲減後的癌細胞生長抑 制率明顯大於單基因敲減組的加和，表明特異性沉默CIT基因表達的物質與特異性沉默 EGFR基因表達的物質協同抑制腫瘤細胞的增殖。
[0064] 進一步的，本發明所述藥物或藥物組合物含有1?99wt%所述小幹擾RNA、shRNA、 基因幹擾核酸構建體和/或基因幹擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。 [0065] 製備藥物時，通常將有效成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或 藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為 賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅 菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、微晶 纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水等。製劑還可包括：溼潤劑、乳化劑、防腐劑（如羥基苯 甲酸甲酯和丙酯）、甜味劑等。
[0066] 本發明的有益效果為：本發明提供的siRNA或者包含該小幹擾RNA序列的核酸構 建體、慢病毒能夠特異性抑制人CIT基因的表達，尤其是慢病毒，能單獨，或者與EGFR靶向 慢病毒協同抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。本發明 中的CIT基因即可以作為單獨的腫瘤治療靶標，也可以作為EGFR基因協同治療靶標，在腫 瘤治療中具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0067] 圖 1 :GV115 質粒 DNA 圖譜
[0068] 圖 2 :GV113 質粒 DNA 圖譜
[0069] 圖3 :CIT shRNA質粒鑑定圖
[0070] 1# :陰性對照（ddH20) ;2# :陰性對照（空載自連對照組）
[0071] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，1. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，100bp
[0072] 4# ?8# :CIT shRNAl-5 號轉化子鑑定
[0073] 圖4 :EGFR shRNA質粒鑑定圖
[0074] 1# :陰性對照（ddH20)
[0075] 2# :陰性對照（空載自連對照組）
[0076] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，1. 5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp
[0077] 4# ?8# :EGFR shRNAl-5 號轉化子鑑定
[0078] 圖5 :CIT shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時浸染人結腸癌RKO細胞5天後， 顯著抑制細胞增殖

【具體實施方式】
[0079] 下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用於說明本發明，而非限制 本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條 件，如[美]SambrooLJ等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京：科學出版社 2002中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。
[0080] 實施例1針對人CIT基因和EGFR基因 RNAi慢病毒的製備
[0081] 1.慢病毒載體構建
[0082] 1)構建針對人CIT基因和EGFR基因的慢病毒載體
[0083] 從Genbank調取CIT(NM_007174)和EGFR基因（NM_201282)信息；利用上海吉凱基 因化學技術有限公司的設計軟體Genechem設計針對CIT基因和EGFR基因的有效的siRNA 靶點。初步篩選得到具有明顯抑制CIT基因表達功能的siRNA靶點序列（SEQ ID NO. 1)和 明顯抑制EGFR基因表達功能的siRNA靶點序列（SEQ ID NO. 2)。通過Genbank資料庫進行 BLAST分析，確定其不對任何其它基因產生幹擾作用。
[0084] 表IsiRNA靶點序列
[0085]

【權利要求】
1. 分離的人CIT基因在製備或篩選腫瘤治療藥物，或者在製備腫瘤診斷藥物中的用 途。
2. 如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述人CIT基因作為針對腫瘤細胞的作用靶 標應用於製備或篩選腫瘤治療藥物，或者製備腫瘤診斷藥物。
3. 如權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述針對腫瘤細胞的作用靶標為RNA幹擾作 用靶標。
4. 分離的人CIT基因和人EGFR基因在製備或篩選腫瘤治療藥物，或者在製備腫瘤診斷 藥物中的用途。
5. -種治療腫瘤的核酸分子藥物，其有效成分含有降低腫瘤細胞中CIT基因表達的分 離的核酸分子，以及降低腫瘤細胞中EGFR基因表達的分離的核酸分子； 所述降低腫瘤細胞中CIT基因表達的分離的核酸分子包含： a) CIT基因雙鏈RNA，所述CIT基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與CIT基因雜交 的核苷酸序列；或者 b) CIT基因 shRNA，所述CIT基因 shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與CIT基因雜交的核 苷酸序列； 所述降低腫瘤細胞中EGFR基因表達的分離的核酸分子包含： A. EGFR基因雙鏈RNA，所述EGFR基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與EGFR基因 雜交的核苷酸序列；或者 B. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與EGFR基因雜交 的核苷酸序列。
6. 如權利要求5所述的核酸分子藥物，其特徵在於，所述CIT基因雙鏈RNA包含第一 鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，並且所述第一鏈的序列 與CIT基因的靶序列基本相同；所述CIT基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連 接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互 補，並且所述正義鏈片段的序列與CIT基因的靶序列基本相同；所述EGFR基因雙鏈RNA包 含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，並且所述第一鏈 的序列與EGFR基因的靶序列基本相同；所述EGFR基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片 段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片 段的序列互補，並且所述正義鏈片段的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
7. 如權利要求6所述的核酸分子藥物，其特徵在於，所述CIT基因的靶序列，為SEQ ID NO:1所示序列；所述EGFR基因的靶序列，為SEQ ID NO: 2所示序列。
8. 如權利要求5-7任一權利要求所述的核酸分子藥物，其特徵在於，所述雙鏈RNA為 小幹擾RNA，並且CIT基因小幹擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :9所示；EGFR基因小幹擾 RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :10所示；所述CIT基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所 示；所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示。
9. 一種治療腫瘤的慢病毒載體藥物，其有效成分含有CIT基因幹擾慢病毒載體和EGFR 基因幹擾慢病毒載體，所述CIT基因幹擾慢病毒載體含有編碼權利要求5-8任一權利要求 所述核酸分子藥物中的CIT基因 shRNA的基因片段；所述EGFR基因幹擾慢病毒載體含有編 碼權利要求5-8任一權利要求所述核酸分子藥物中的EGFR基因 shRNA的基因片段。
10. -種治療腫瘤的慢病毒藥物，其有效成分含有CIT基因幹擾慢病毒和EGFR基因幹 擾慢病毒，所述CIT基因幹擾慢病毒由權利要求9所述慢病毒載體藥物中的CIT基因幹擾 慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成；所述EGFR基因幹擾 慢病毒由權利要求9所述慢病毒載體藥物中的EGFR基因幹擾慢病毒載體在慢病毒包裝質 粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
11. 一種治療結腸癌的藥物組合物，其組成含有權利要求5-8任一權利要求所述核酸 分子藥物中的降低腫瘤細胞中CIT基因表達的分離的核酸分子、權利要求9所述慢病毒載 體藥物中的CIT基因幹擾慢病毒載體、權利要求10所述慢病毒藥物中的CIT基因幹擾慢病 毒中的至少一種；以及權利要求5-8任一權利要求所述核酸分子藥物中的降低腫瘤細胞中 EGFR基因表達的分離的核酸分子、權利要求9所述慢病毒載體藥物中的EGFR基因幹擾慢病 毒載體、權利要求10所述慢病毒藥物中的EGFR基因幹擾慢病毒中的至少一種。
【文檔編號】A61K35/76GK104232744SQ201310232000
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月9日 優先權日:2013年6月9日
【發明者】朱向瑩, 高博, 楊敏, 曹躍瓊 申請人:上海金鑑生物科技有限公司