一種納米酶、探針、用於現場快速檢測馬鈴薯中龍葵素的試紙條和應用

2024-04-12 21:10:05

1.本發明屬於檢測技術領域，尤其是一種納米酶、探針、用於現場快速檢測馬鈴薯中龍葵素的試紙條和應用。


背景技術：

2.馬鈴薯是繼水稻、小麥、玉米之後，全球第四大糧食作物，含有非常高的營養成分，如維生素c、植物蛋白、類胡蘿蔔素、膳食纖維和澱粉。馬鈴薯全年都有很高的市場需求，並逐漸朝著主糧化的方向發展。然而在運輸和儲存過程中，由於生長代謝和機械損傷，馬鈴薯會產生有毒的龍葵素，尤其在果皮和芽眼部位的含量很高，在馬鈴薯工業中已經成為棘手的問題。龍葵素具有神經毒性，會引起腦、胃腸、肺部等水腫，一次性攝入200mg龍葵素即會發病，當攝入500mg時症狀會明顯加重，嚴重時甚至會引起呼吸麻痺致死，因此馬鈴薯的食用安全及商品薯的及時區分問題備受關注，在貯藏過程中馬鈴薯有毒代謝物的檢測迫在眉睫。
3.目前對馬鈴薯中龍葵素的檢測主要有肉眼識別檢測，紫外分光光譜法，高效液相色譜法，以及紅外光譜和高光譜結合。但是，現有技術中存在如下技術問題：
4.問題1：傳統肉眼識別、近紅外和高光譜檢測主要是通過觀察馬鈴薯的綠變及發芽程度來判斷馬鈴薯的品質，這種方法耗費人力，準確程度低，不能有效區分馬鈴薯的可食用性，不適用於大量樣本的監測和鑑定。
5.問題2：紫外分光光譜和高效液相色譜靈敏度和準確性較高，但樣品需要提純處理，檢測成本高，設備笨重，分析時間長，不能滿足快速分析等要求，由於不便於攜帶，不能進行現場快速檢測。
6.問題3：現有的檢測技術的特異性和靈敏度未能同時兼顧，馬鈴薯、番茄等含有龍葵素的植物中的含有複雜的基質及表面可能會有有機農藥的殘留，因此會干擾檢測的準確度。
7.通過檢索，發現了如下幾篇與本發明專利申請相關的專利公開文獻：
8.1、一種基於機器視覺的綠化馬鈴薯檢測分級方法(cn103394472a)，通過對馬鈴薯的圖像進行數字圖像處理，提取綠化馬鈴薯的特徵值，利用h(色調)通道灰度值判別法對表皮發綠的馬鈴薯進行檢測分級。雖然該技術能夠通過檢測馬鈴薯的表面特徵快速將馬鈴薯劃分為綠變薯和發芽薯，然而沒有更確切地將內部龍葵素含量與馬鈴薯的可食性聯繫起來，此外未綠化的馬鈴薯內部的龍葵素含量無法測得。本發明直接精準定量龍葵素，不再使用視覺的判別馬鈴薯的可食性。
9.2、一種檢測馬鈴薯中糖苷生物鹼的方法(cn112557556a)，以糖苷生物鹼粗提物溶液為供體相，採用三相電膜萃取技術萃取糖苷生物鹼粗提物溶液中的糖苷生物鹼，用高效液相色譜法檢測糖苷生物鹼的濃度。該方法樣品處理過程繁瑣，檢測分析時間長，儀器昂貴。本發明檢測迅速，加樣18min分鐘即可進行數據讀取，方便用於現場檢測。
10.3、基於機器視覺與電子鼻融合技術的馬鈴薯龍葵素檢測方法(cn107748165a)，提供了一種通過計算機視覺與電子鼻採集獲得馬鈴薯圖像信息和氣味信息的馬鈴薯龍葵素檢測方法。然而由於馬鈴薯的個體差異大小，頂空氣體中實際氣體成分濃度存在一定的誤差，且樣品的氣味採集時間會影響龍葵素的定量，因此檢測的龍葵素含量存在誤差。本發明直接捕獲樣品中龍葵素，消除了採集時間影響，並通過智能信號精準定量。
11.4、一種利用雙光信號比率傳感器體系檢測食品中龍葵素的方法(cn114739961a)，利用mno2納米片作為二階散射信號供體和cds作為螢光信號猝滅劑，通過這兩種相反信號反應的傳感器體系，檢測食品中龍葵素。實驗過程中所用膽鹼酯酶易受環境影響，昂貴，且植物生長過程中若噴灑了農藥，如有機磷農藥，乙醯膽鹼法作為常見檢測有機磷農藥的信號載體，對於檢測龍葵素不具備完全特異性。本發明由於抗原抗體識別作用，具有極強的特異性。
12.5、一種檢測龍葵素的試紙條及其應用(cn202111132275.7)，基於抗原和抗體的特異結合，製備了一種用於檢測龍葵素的膠體金試紙條，適用於馬鈴薯、茄子、未熟西紅柿中龍葵素殘留的檢測。雖然免疫標記法特異性高，專一性強，但傳統膠體金試紙條的檢測靈敏度已遠遠不能滿足實際檢測需求。本發明採用穩定性能好，價格低廉，反應迅速的納米酶替代傳統的膠體金，效果更佳靈敏,檢測限和閾值分別為0.05ng/ml和15ng/ml。
13.通過對比，本發明專利申請與上述專利公開文獻存在本質的不同。


技術實現要素：

14.本發明目的在於克服現有技術中的不足之處，提供一種納米酶、探針、用於現場快速檢測馬鈴薯中龍葵素的試紙條和應用。
15.本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：
16.一種papain-cuncs納米酶，所述納米酶的製備步驟如下：
17.採用一步水熱法合成papain-cuncs，具體為：
18.伴隨著劇烈攪拌即轉速大於900rpm將10mg/ml木瓜蛋白酶逐滴加入到10mm硫酸銅溶液中，在35℃下繼續攪拌15min後，加入3m的naoh溶液，在37℃水浴中繼續攪拌2h，得到的溶液用截留分子量為3500da的透析袋在4℃下透析24h，用0.22μm的水系濾膜過濾，獲得純淨的papain-cuncs納米酶，在4℃冰箱密封保存；
19.其中，木瓜蛋白酶：硫酸銅溶液：naoh溶液的體積比為5：1：0.1。
20.進一步地，所述納米酶的表徵如下：
21.papain-cuncs為3-5粒的團簇，平均直徑為32.5
±
2nm，所制納米酶富含s，cu，c,o元素，從xrd、紅外光譜圖表明硫酸銅與木瓜蛋白酶結合；papain-cuncs納米酶的zeta電位為-62，表明分散粒子顆粒較小，體系比較穩定；納米酶的流體力學粒徑分布表明了顆粒在液體中的運動狀態，所制納米酶粒子強度、體積、數量分布三個數據的差值不大，表明樣品顆粒大小比較均勻。
22.利用如上所述的papain-cuncs納米酶的papain-cuncs-mab探針，所述papain-cuncs-mab探針的製備方法如下：
23.採用靜電吸附法製備papain-cuncs-mab探針，具體為：
24.取papain-cuncs納米酶，加入1mg/ml的龍葵素單克隆抗體(該龍葵素單克隆抗體
為現有技術中公知的抗體，如專利公開文獻cn202111132275.7中已經公開。該龍葵素單克隆抗體可以由龍葵素人工抗原經動物免疫得到，其能與龍葵素發生特異性免疫反應，該龍葵素單克隆抗體可以採用本領域內常規方法來進行製備。本技術人向浙江省食品藥品檢驗研究院購買得到。)，將所得混合溶液攪拌均勻後在室溫孵育1h，加入10％bsa溶液並孵育30min，以阻斷papain-cuncs納米酶的其他結合位點；最後，將混合溶液在高速冷凍離心機4000rpm離心10min，並用去離子水洗滌三次，洗去游離的龍葵素單克隆抗體和bsa，得到papain-cuncs-mab探針，將該探針重懸於去離子水中，並於4℃下儲存以備後用；
25.其中，papain-cuncs納米酶溶液：龍葵素單克隆抗體：10％bsa溶液：去離子水的體積比為1000：3：100：50。
26.利用如上所述的papain-cuncs-mab探針的用於現場快速檢測馬鈴薯中龍葵素的試紙條，所述試紙條包括硝酸纖維素膜、樣品墊、結合墊、吸水墊、襯板和papain-cuncs-mab探針，硝酸纖維素膜、樣品墊、結合墊、吸水墊和襯板均沿水平方向設置，且襯板上沿水平方向依次相連接設置樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，樣品墊的水平一端覆蓋設置於結合墊的水平一端上方，結合墊的水平另一端覆蓋設置於硝酸纖維素膜的水平一端，吸水墊的水平一端覆蓋設置在硝酸纖維素膜的水平另一端上方，吸水墊和結合墊之間的硝酸纖維素膜上沿水平方向間隔設置檢測線和控制線，檢測線和控制線沿縱向設置，其中硝酸纖維素上劃線包被有龍葵素半抗原-卵清蛋白偶聯物和羊抗鼠免疫球蛋白igg分別作為檢測線t線和控制線c線；
27.所述結合墊上設置有papain-cuncs-mab探針。
28.進一步地，所述試紙條的製備方法如下：
29.(1)硝酸纖維素膜的製備方法：1mg/ml龍葵素半抗原-卵清蛋白偶聯物以0.8μl/cm的劃線速率塗覆在檢測線上得檢測線t線，1mg/ml羊抗鼠免疫球蛋白igg以1μl/cm的劃線速率塗覆在控制線上為控制線c線，然後將包被好的膜於37℃條件下乾燥3h以備用；
30.(2)樣品墊的製備：將玻璃纖維膜剪裁成段，放入封閉液中浸泡2h，於37℃條件下乾燥4h，然後置4℃冰箱中保存；其中，封閉液為：質量濃度為2％的bsa，ph為7.2的磷酸緩衝液；
31.(3)結合墊的製備：將玻璃纖維膜剪裁成段，放入封閉液中浸泡2h，取出於37℃條件下乾燥4h，然後置4℃冰箱中保存；
32.將製備好的papain-cuncs-mab探針均勻噴塗在結合墊上，於37℃條件下乾燥1h，置於乾燥環境保存備用；
33.其中，封閉液為：質量濃度為2％的bsa，ph為7.2的磷酸緩衝液；
34.(4)吸水墊的製備：將吸水紙剪裁成段，即得吸水墊；
35.(5)試紙條的組裝：將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次按順序粘貼在襯板上，樣品墊的水平一端覆蓋設置於結合墊的水平一端上方，結合墊的水平另一端覆蓋設置於硝酸纖維素膜的水平一端，吸水墊的水平一端覆蓋設置在硝酸纖維素膜的水平另一端上方，硝酸纖維素膜的非覆蓋面上沿橫向設置檢測線和控制線，組裝成的試紙條裝在的塑料殼中，在4℃下保存。
36.進一步地，製備樣品墊時的玻璃纖維膜剪裁成長15mm
×
寬3mm的規格，製備結合墊時的玻璃纖維膜剪裁成長8mm
×
寬3mm的規格，所述吸水紙剪裁成長18mm
×
寬3mm的規格。
37.進一步地，所述試紙條的視覺檢測限vlod為0.05ng/ml，試紙條的檢測限lod為15ng/ml；
38.或者，所述試紙條能夠檢測龍葵素的主要組分為：α-茄鹼、β-茄鹼、澱粉、牛血清白蛋白、穀胱甘肽。
39.進一步地，所述試紙條在使用時，當樣品溶液中不存在龍葵素時，檢測線上形成可見帶；對於陽性樣品，不會在檢測線上出現可見帶。
40.如上所述的試紙條在龍葵素的檢測中的應用。
41.如上所述的試紙條在馬鈴薯的龍葵素的快速檢測中的應用。
42.本發明取得的優點和積極效果為：
43.1、本發明納米酶價格低廉，靈敏性高，具有催化活性，合成成本低，方法簡單便捷，穩定性高且易於表面修飾，可以使過氧化氫迅速氧化tmb顯色，未參與反應的papain-cuncs納米酶為透明色，背景噪聲小，結果準確；此外以木瓜蛋白酶作為模板劑比溶菌酶及混合酶作為模板劑催化顯色性能優異。如圖1a，圖3所示。
44.2、本發明試紙條成本低廉，便於攜帶，可用於快速檢測，納米酶在試紙條上的催化活性良好，負載了納米酶的試紙在至少六個月內有穩定的催化活性，同時顯色後能穩定性良好。如圖1b、圖2所示。
45.3、本發明試紙條在使用時，可以使用智慧型手機通過顏色識別軟體將馬鈴薯中龍葵素含量精準定量，消除了人工視覺誤差和解決了定量儀器的笨重問題，實現現場迅速檢測定量。
46.4、本發明納米酶具有快速、特異、靈敏、準確的優點。
47.傳統酶聯免疫所用的酶是生物酶，存在易失活，穩定性差，嗜熱範圍窄的問題，納米酶是一種新型的模擬酶，具有天然酶的催化活性，本發明利用納米酶替代傳統生物酶，通過納米酶的類酶活性催化底物分子輸出信號，擴大反應信號，在15min內便可以完成對樣品的檢測(圖3)，利用抗原抗體的結合提升檢測的特異性和準確程度。同時還解決了生物酶成本高與及靈敏性低的問題，檢測限vlod和閾值分別為0.05ng/ml和15ng/ml(圖7)。
48.5、本發明試紙條具有方便，便攜，可以現場篩查檢測的優點。
49.免疫層析法是將試紙條作為放大檢測效應的基質，進行快速定量目標檢測物。所述試紙條包括樣品墊、濾膜、檢測帶、控制帶、吸收墊、塑料基底。在實際應用中試紙條體積較小(長度僅有8cm，質量僅8.72g)，便於攜帶，適用於大批量、快速的樣品檢測(圖6)。
50.6、本發明解決了對龍葵素現場定量的問題，同時消除了視覺判定誤差。
51.智慧型手機定量檢測。在同一led燈的照射下用智慧型手機拍攝並識別檢測條帶的rgb值，並令bn＝b/(r+g+b)，帶入bn-濃度工作曲線方程以計算龍葵素含量，解決了現場對龍葵素迅速定量的問題。
52.7、本發明納米酶探針是基於銅納米酶作為信號載體，通過標記抗體製備探針，該探針具有高度的分散性和均勻性、良好的生物相容性和快速的抗體標記能力，並且具有較高的過氧化物酶活性，可以催化3，3'，5，5'四甲基聯苯胺(tmb)和過氧化氫(h2o2)觸發顯色反應，提高了檢測靈敏度及檢測結果的準確性，這對於監控馬鈴薯中龍葵素有很重要的意義。
53.8、針對便攜及檢測迅速的問題，本發明提供了一種現場檢測龍葵素的試紙條，工
作原理為：基於競爭檢測原理，首先，將papain-cuncs納米酶探針與樣品溶液混合，然後滴到測試條上，通過毛細作用移向試紙的測試區域。當樣品溶液中不存在龍葵素時，納米酶探針會被檢測線中被抗原捕獲，在檢測線上形成可見帶。相反，對於陽性樣品，游離的龍葵素和固定在檢測線上抗原之間存在強烈的競爭反應，導致檢測線強度隨龍葵素濃度的增加而降低。當龍葵素濃度足夠高時，納米酶探針僅會被控制線捕獲，不會在檢測線上出現可見帶。在信號增強模式下，由於papain-cuncs納米酶探針的類過氧化物酶活性，檢測線的顏色從無色變為藍色(圖6)。
附圖說明
54.圖1為本發明中papain-cuncs納米酶的催化穩定性證明圖：其中，a圖為papain-cuncs納米酶的顏色顯示圖，其中，左圖為未反應的無色透明的papain-cuncs納米酶，右圖為加入tmb和h2o2的papain-cuncs納米酶的顯色反應圖；b圖為納米酶在12個月內催化穩定性測定圖；
55.圖2為本發明中papain-cuncs納米酶的表徵圖；其中，圖a至圖c依次為200nm下的papain-cuncs掃描電鏡圖、100nm下的papain-cuncs納米酶粒徑大小(直徑約為32.5
±
2nm)、200nm下的papain-cuncs透射電鏡圖；圖d至圖i為papain-cuncs納米酶的不同元素組成含量圖；圖j為papain-cuncs納米酶的xrd圖；圖k為papain-cuncs納米酶的紅外光譜圖；圖i為papain-cuncs納米酶的zeta電位圖，圖m為papain-cuncs納米酶的粒徑分布圖；
56.圖3為本發明中papain-cuncs納米酶與其他酶類作為納米酶模板劑的催化能力比較圖；
57.圖4為本發明中納米酶參與催化反應實驗條件的優化圖；其中，圖a至圖f依次為不同濃度硫酸銅(0-50mm)、不同濃度木瓜蛋白酶(0-10mg/ml)、不同溫度(25-65℃)、不同ph(3～6.5)、不同濃度tmb(0.6-2.0mm)和不同反應時長(2-55min)對納米酶顯色的影響圖；
58.圖5為本發明中納米酶促動力學常數的測定圖；
59.圖6為本發明中試紙條的組裝及測定原理示意圖；
60.圖7為本發明中納米酶-免疫層析試紙條的製備及靈敏度和特異性的驗證圖；其中圖a至圖b依次為試紙條靈敏度和檢測限測定圖，試紙條特異性檢測圖。
具體實施方式
61.下面詳細敘述本發明的實施例，需要說明的是，本實施例是敘述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護範圍。
62.本發明中所使用的原料，如無特殊說明，均為常規的市售產品；本發明中所使用的方法，如無特殊說明，均為本領域的常規方法。
63.一種papain-cuncs納米酶，所述納米酶的製備步驟如下：
64.採用一步水熱法合成papain-cuncs，具體為：
65.伴隨著劇烈攪拌即轉速大於900rpm將10mg/ml木瓜蛋白酶逐滴加入到10mm硫酸銅溶液中，在35℃下繼續攪拌15min後，加入3m的naoh溶液，在37℃水浴中繼續攪拌2h，得到的溶液用截留分子量為3500da的透析袋在4℃下透析24h，用0.22μm的水系濾膜過濾，獲得純淨的papain-cuncs納米酶，在4℃冰箱密封保存；
66.其中，木瓜蛋白酶：硫酸銅溶液：naoh溶液的體積比為5：1：0.1。
67.進一步地，所述納米酶的表徵如下：
68.papain-cuncs為3-5粒的團簇，平均直徑為32.5
±
2nm，所制納米酶富含s，cu，c,o元素，從xrd、紅外光譜圖表明硫酸銅與木瓜蛋白酶結合；papain-cuncs納米酶的zeta電位為-62，表明分散粒子顆粒較小，體系比較穩定；納米酶的流體力學粒徑分布表明了顆粒在液體中的運動狀態，所制納米酶粒子強度、體積、數量分布三個數據的差值不大，表明樣品顆粒大小比較均勻。
69.利用如上所述的papain-cuncs納米酶的papain-cuncs-mab探針，所述papain-cuncs-mab探針的製備方法如下：
70.採用靜電吸附法製備papain-cuncs-mab探針，具體為：
71.取papain-cuncs納米酶，加入1mg/ml的龍葵素單克隆抗體(該龍葵素單克隆抗體為現有技術中公知的抗體，如專利公開文獻cn202111132275.7中已經公開。該龍葵素單克隆抗體可以由龍葵素人工抗原經動物免疫得到，其能與龍葵素發生特異性免疫反應，該龍葵素單克隆抗體可以採用本領域內常規方法來進行製備。本技術人向浙江省食品藥品檢驗研究院購買得到。)，將所得混合溶液攪拌均勻後在室溫孵育1h，加入10％bsa溶液並孵育30min，以阻斷papain-cuncs納米酶的其他結合位點；最後，將混合溶液在高速冷凍離心機4000rpm離心10min，並用去離子水洗滌三次，洗去游離的龍葵素單克隆抗體和bsa，得到papain-cuncs-mab探針，將該探針重懸於去離子水中，並於4℃下儲存以備後用；
72.其中，papain-cuncs納米酶溶液：龍葵素單克隆抗體：10％bsa溶液：去離子水的體積比為1000：3：100：50。
73.利用如上所述的papain-cuncs-mab探針的用於現場快速檢測馬鈴薯中龍葵素的試紙條，所述試紙條包括硝酸纖維素膜、樣品墊、結合墊、吸水墊、襯板和papain-cuncs-mab探針，硝酸纖維素膜、樣品墊、結合墊、吸水墊和襯板均沿水平方向設置，且襯板上沿水平方向依次相連接設置樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，樣品墊的水平一端覆蓋設置於結合墊的水平一端上方，結合墊的水平另一端覆蓋設置於硝酸纖維素膜的水平一端，吸水墊的水平一端覆蓋設置在硝酸纖維素膜的水平另一端上方，吸水墊和結合墊之間的硝酸纖維素膜上沿水平方向間隔設置檢測線和控制線，檢測線和控制線沿縱向設置，其中硝酸纖維素上劃線包被有龍葵素半抗原-卵清蛋白偶聯物和羊抗鼠免疫球蛋白igg分別作為檢測線t線和控制線c線；
74.所述結合墊上設置有papain-cuncs-mab探針。
75.較優地，所述試紙條的製備方法如下：
76.(1)硝酸纖維素膜的製備方法：1mg/ml龍葵素半抗原-卵清蛋白偶聯物以0.8μl/cm的劃線速率塗覆在檢測線上得檢測線t線，1mg/ml羊抗鼠免疫球蛋白igg以1μl/cm的劃線速率塗覆在控制線上為控制線c線，然後將包被好的膜於37℃條件下乾燥3h以備用；
77.(2)樣品墊的製備：將玻璃纖維膜剪裁成段，放入封閉液中浸泡2h，於37℃條件下乾燥4h，然後置4℃冰箱中保存；其中，封閉液為：質量濃度為2％的bsa，ph為7.2的磷酸緩衝液；
78.(3)結合墊的製備：將玻璃纖維膜剪裁成段，放入封閉液中浸泡2h，取出於37℃條件下乾燥4h，然後置4℃冰箱中保存；
79.將製備好的papain-cuncs-mab探針均勻噴塗在結合墊上，於37℃條件下乾燥1h，置於乾燥環境保存備用；
80.其中，封閉液為：質量濃度為2％的bsa，ph為7.2的磷酸緩衝液；
81.(4)吸水墊的製備：將吸水紙剪裁成段，即得吸水墊；
82.(5)試紙條的組裝：將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次按順序粘貼在襯板上，樣品墊的水平一端覆蓋設置於結合墊的水平一端上方，結合墊的水平另一端覆蓋設置於硝酸纖維素膜的水平一端，吸水墊的水平一端覆蓋設置在硝酸纖維素膜的水平另一端上方，硝酸纖維素膜的非覆蓋面上沿橫向設置檢測線和控制線，組裝成的試紙條裝在的塑料殼中，在4℃下保存。
83.較優地，製備樣品墊時的玻璃纖維膜剪裁成長15mm
×
寬3mm的規格，製備結合墊時的玻璃纖維膜剪裁成長8mm
×
寬3mm的規格，所述吸水紙剪裁成長18mm
×
寬3mm的規格。
84.較優地，所述試紙條的視覺檢測限vlod為0.05ng/ml，試紙條的檢測限lod為15ng/ml；
85.或者，所述試紙條能夠檢測龍葵素的主要組分為：α-茄鹼、β-茄鹼、澱粉、牛血清白蛋白、穀胱甘肽。
86.較優地，所述試紙條在使用時，當樣品溶液中不存在龍葵素時，檢測線上形成可見帶；對於陽性樣品，不會在檢測線上出現可見帶。
87.如上所述的試紙條在龍葵素的檢測中的應用。
88.如上所述的試紙條在馬鈴薯的龍葵素的快速檢測中的應用。
89.具體地，相關製備及檢測實施例如下：
90.實施例1
91.一種papain-cuncs納米酶的製備、優化與表徵，具體步驟如下：
92.1、papain-cuncs納米酶的製備
93.採用一步水熱法合成papain-cuncs。伴隨著劇烈攪拌(轉速大於900rpm)將10ml10mg/ml木瓜蛋白酶逐滴加入到10mm硫酸銅溶液中(體積比為5：1)，在35℃下繼續攪拌15min後，加入0.1ml3m的naoh，在37℃水浴中繼續攪拌2h，得到的溶液用截留分子量為3500da的透析袋在4℃下透析24h，用0.22μm的水系濾膜過濾，獲得純淨的納米酶，最終在4℃冰箱密封保存合成的papain-cuncs。
94.2、papain-cuncs納米酶的表徵
95.利用透射電子顯微鏡，掃描電子顯微鏡獲取納米酶的形貌，並進行eds，納米粒徑、zeta電位、xps等表徵手段，研究其獨特的物理化學性質。結果如表1和圖2所示，從表1和圖2可知，papain-cuncs為3-5粒的團簇，平均直徑約為32.5
±
2nm，從eds圖譜可以發現納米酶富含s，cu，c,o元素，從xrd、紅外光譜圖表明硫酸銅與木瓜蛋白酶結合；papain-cuncs納米酶的zeta電位為-62,表明分散粒子顆粒較小，體系比較穩定。納米酶的流體力學粒徑分布表明了顆粒在液體中的運動狀態，圖m表明粒子強度、體積、數量分布三個數據的差值不大，表明樣品顆粒大小比較均勻。
96.表1本發明中papain-cuncs納米酶的元素組成及含量百分比
[0097][0098]
3、papain-cuncs納米酶與其他酶類作為納米酶模板劑的催化能力比較
[0099]
分別將10ml10mg/ml木瓜蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和溶菌酶混合液(1：1)逐滴加入到10mm硫酸銅溶液中(體積比為5：1)，在35℃下繼續攪拌15min後，加入0.1ml3m的naoh，在37℃水浴中繼續攪拌2h，得到的溶液用截留分子量為3500da的透析袋在4℃下透析24h，用0.22μm的水系濾膜過濾，獲得純淨的納米酶，最終在4℃冰箱密封保存合成的papain-cuncs、lysozyme-cuncs、mix-cuncs。將體積比為1：1的tmb和h2o2(濃度梯度為：0.01，0.1，1，10，20，30％)的混合液加入到三種酶中進行催化顯色反應，在652nm下測定吸光度，對照為未加入納米酶的tmb和h2o2混合液(加入同等體積的水)。結果如圖3a所示，tmb與h2o2可以緩慢地發生顯色反應，也就是圖3中的對照組有較低的吸光度值，即使隨著h2o2濃度的升高，ck組的吸光度幾乎無明顯變化，然而加入納米酶的混合體系在652nm處的吸光度逐漸升高，在h2o2濃度為10％時，papain-cuncs催化的顯色度明顯高於lysozyme-cuncs和mix-cuncs，表明使用木瓜蛋白酶作為模板劑製備的納米酶催化能力較好。
[0100]
測定了添加或不添加papain-cuncs的tmb和h2o2混合液、papain-cuncs、cuso4在652nm處的吸光度值，結果如圖3b所示，硫酸銅的顯色顯著高於papain-cuncs，表明papain-cuncs的成功製備，並且所製備的納米酶作為催化劑對顯色結果無背景幹擾；加入納米酶後的催化反應顯色明顯，表明所製備的papain-cuncs具有優良的類過氧化物酶活性。
[0101]
4、papain-cuncs納米酶類過氧化物酶活性評價
[0102]
(1)papain-cuncs納米酶的類過氧化物酶活性
[0103]
將體積比為1：1的tmb和h2o2混合液加入到步驟1製備好的papain-cuncs納米酶中進行催化反應，並測定納米酶在12個月內的催化穩定性。結果如圖1a所示，所製備的papain-cuncs納米酶為透明無色，對後續顯色反應影響低，同時也表明硫酸銅與木瓜蛋白酶的結合；當加入納米酶後，還處於無色狀態的tmb和h2o2混合液迅速被催化為藍色(如圖a右)，表明製備的納米酶良好的類過氧化物酶活性。圖b顯示了papain-cuncs納米酶的催化穩定性，結果表明至少在6個月內納米酶的催化活性還處於較穩定的狀態。
[0104]
(2)papain-cuncs納米酶的條件優化
[0105]
分別使用不同濃度的木瓜蛋白酶(0-10mg/ml)、硫酸銅(0-50mg/ml)製備papain-cuncs納米酶，與1mmtmb、10mmh2o2,以體積比1：1：1添加到試管中並混合均勻。15min後用紫外分光光度計測試652nm處的吸光度。結果如圖4中的a、b所示，試驗表明，10mm硫酸銅，8mm木瓜蛋白酶為最適納米酶催化顯色配比。
[0106]
(3)納米酶的催化環境的優化
[0107]
為了解環境的影響，在不同ph(3～6.5)和不同溫度(25-65℃)的環境中製備papain-cuncs納米酶(10mm硫酸銅，8mm木瓜蛋白酶)，隨後催化不同濃度tmb(0.6-2.0mm)顯
色，15min後測定652nm處的吸光度。同時測定不同催化時長(2-55min)對顯色程度的影響實驗。結果如圖4中的c至f所示，試驗表明，納米酶在35℃，tmb濃度為1.2mm，ph為4.5的醋酸鈉緩衝液體系中催化15分鐘顯色效果最佳。
[0108]
(4)papain-cuncs納米酶的穩態動力學實驗
[0109]
在實驗過程中，分別改變tmb(0-10mm)和h2o2(10-50mm)的濃度，計算papain-cuncs納米酶的穩態動力學參數。並且檢測0-12個月內papain-cuncs納米酶的穩定催化活性。如圖5所示，實驗結果表明，當以tmb和h2o2為底物時，papain-cuncs納米酶的km值分別為0.380mm(tmb)和10.819mm(h2o2)，km值越低，納米模擬酶與底物的親和力越高，表明papain-cuncs納米酶與tmb的親合能力更強。
[0110]
5、papain-cuncs-mab探針的製備
[0111]
採用靜電吸附法製備papain-cuncs-mab探針。取1ml的papain-cuncs納米酶溶液(該papain-cuncs納米酶本身就為溶液狀態。)，加入3μl的龍葵素單克隆抗體(1mg/ml)，將所得混合溶液攪拌均勻後在室溫孵育1h，加入100μl的10％bsa溶液並孵育30min以阻斷papain-cuncs納米酶的其他結合位點。最後，將混合溶液在高速冷凍離心機4000rpm離心10min，並用去離子水洗滌三次，洗去游離的龍葵素單克隆抗體和bsa，得到papain-cuncs-mab探針，將該探針重懸於50μl的去離子水溶液中，並於4℃下儲存以備後用。
[0112]
實施例2
[0113]
一種納米酶-免疫層析試紙條的製備及靈敏度和特異性的驗證，具體步驟如下：
[0114]
1、免疫層析試紙條的製備
[0115]
本發明的免疫層析試紙條包括硝酸纖維素膜、樣品墊、結合墊、吸水墊、襯板和papain-cuncs-mab探針，硝酸纖維素膜、樣品墊、結合墊、吸水墊和襯板均沿水平方向設置，且襯板上沿水平方向依次相連接設置樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，樣品墊的水平一端覆蓋設置於結合墊的水平一端上方，結合墊的水平另一端覆蓋設置於硝酸纖維素膜的水平一端，吸水墊的水平一端覆蓋設置在硝酸纖維素膜的水平另一端上方，吸水墊和結合墊之間的硝酸纖維素膜上沿水平方向間隔設置檢測線和控制線，檢測線和控制線沿縱向設置，其中硝酸纖維素上劃線包被有龍葵素半抗原-卵清蛋白偶聯物和羊抗鼠免疫球蛋白igg分別作為檢測線t線和控制線c線；
[0116]
所述結合墊上設置有papain-cuncs-mab探針。
[0117]
本發明的免疫層析試紙條的結構可以如圖6所示。
[0118]
所述試紙條的製備方法如下：
[0119]
(1)硝酸纖維素膜的製備方法：1mg/ml龍葵素半抗原-卵清蛋白偶聯物以0.8μl/cm的劃線速率塗覆在檢測線上得t檢測線，1mg/ml羊抗鼠免疫球蛋白以1μl/cm的劃線速率塗覆在控制線上為c控制線,然後將包被好的膜於37℃條件下乾燥3h以備用。
[0120]
(2)樣品墊的製備：將玻璃纖維膜剪裁成長15mm寬3mm的規格，放入封閉液(濃度為2％bsa，ph為7.2的磷酸緩衝液)中浸泡2h，於37℃條件下乾燥4h，然後置4℃冰箱中保存。
[0121]
(3)結合墊的製備：將玻璃纖維膜剪裁成長8mm寬3mm的規格，放入封閉液(濃度為2％bsa，ph為7.2的磷酸緩衝液)中浸泡2h，取出於37℃條件下乾燥4h，然後置4℃冰箱中保存。將製備好的papain-cuncs-mab探針均勻噴塗在結合物釋放墊上，於37℃條件下乾燥1h，置於乾燥環境保存備用。
[0122]
(4)吸水墊的製備：將吸水紙剪裁成長18mm寬3mm的規格，即得吸水墊。
[0123]
(5)試紙條的組裝：將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次按順序粘貼在襯板(如pvc基質)上，樣品墊的水平一端覆蓋設置於結合墊的水平一端上方，結合墊的水平另一端覆蓋設置於硝酸纖維素膜的水平一端，吸水墊的水平一端覆蓋設置在硝酸纖維素膜的水平另一端上方，硝酸纖維素膜的非覆蓋面上沿橫向設置檢測線和控制線，組裝成的試紙條裝在的塑料殼中，在4℃下保存。
[0124]
2、快速檢測龍葵素試紙條靈敏度測定
[0125]
(1)將龍葵素標準品溶於超純水中，稀釋為0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20ng/ml不同的濃度，超純水作為為空白對照。將5μl的papain-cuncs-mab探針與100μl龍葵素標準溶液混合孵育，再把測試條的樣品墊浸入不同濃度上述檢測液中，混合物通過毛細血管力的作用向吸水墊遷移。反應3min後，在t線和c線之間加入6μltmb-h2o2反應液。15min後，用肉眼觀察試紙條結果，同時使用相機拍攝測試結果，每組實驗重複3次。
[0126]
(2)在同一環境的led燈的照射下(控制相同亮度、拍攝高度和背景)，用智慧型手機讀取具體檢測條帶的rgb值，並令bn＝b/(r+g+b)，帶入bn-濃度曲線方程以計算龍葵素含量，從而實現對龍葵素的定量檢測。
[0127]
(3)檢測結果：如圖7所示，當通過肉眼觀察到檢測線t線明顯比空白對照條淺時，相應的龍葵素最小濃度定義為視覺檢測限(vlod)，當檢測線t線完全消失時，相應的最小濃度作為閾值濃度。競爭抑制率ic10定義為檢測限(lod)。vlod和閾值分別為0.05ng/ml和15ng/ml。
[0128]
3、快速檢測龍葵素試紙條的特異性實驗
[0129]
分別將α-茄鹼、α-卡茄鹼、澱粉、牛血清白蛋白、穀胱甘肽用超純水稀釋至100ng/ml的濃度，分別取100μl溶液作為檢測液，與5μl的papain-cuncs-mab探針混合孵育，再把測試條的樣品墊浸入上述測試溶液中，同時取100μl超純水作為空白對照液。3min後在t線和c線之間加入6μltmb-h2o2反應液。使用相機拍攝測試結果，根據標準曲線進行定量，每個試驗在相同條件下至少重複3次。如圖6所示，結果顯示本試紙條對龍葵素的主要組分(α-茄鹼和α-卡茄鹼)具有良好的特異性，與測試樣品中的常見幹擾物沒有明顯的交叉反應。
[0130]
實施例3
[0131]
加標檢驗馬鈴薯果肉、果皮、芽的龍葵素含量，具體步驟如下：
[0132]
準確稱量馬鈴薯樣品1g，將樣品分別浸泡在加入1ml的含不同濃度的龍葵素(1、5、10、20μg/kg)中，3000rpm下均質。加入2ml乙醇-乙酸(100∶30,v/v)試劑，進行超聲輔助提取，提取液離心，取上層清液2ml，減壓蒸餾，回收溶劑。過spe-nh2柱，甲醇/二氯甲烷(5∶95)洗脫，減壓蒸餾，回收試劑至全乾，甲醇定容至5ml，過0.22μm膜。在測試前，馬鈴薯樣品需被稀釋5倍以減少基質的影響。將5μl的papain-cuncs-mab探針與100μl龍葵素標準溶液混合孵育，再把測試條的樣品墊浸入上述測試溶液中，混合物通過毛細作用向吸收墊遷移。反應3min後，用肉眼觀察t線的信號強度，並用可攜式裝置定量測量。在信號增強模式下，在t線和c線之間加入6μltmb-h2o2反應液。15min後，使用相機拍攝測試結果。同時，並用可攜式裝置定量測量t線上的最終強度，並根據標準曲線計算檢測樣品濃度。
[0133]
加標回收率％＝測定的樣品濃度/加入標樣的濃度
×
100
[0134]
檢測結果如表2所示，加樣回收率為98％-134.5％，表明該檢測方法準確度高，可
用於加標樣品中龍葵素的快速檢測，反映其良好的應用價值。
[0135]
表2本發明中加標樣品檢測效果圖
[0136][0137]
儘管為說明目的公開了本發明的實施例，但是本領域的技術人員可以理解：在不脫離本發明及所附權利要求的精神和範圍內，各種替換、變化和修改都是可能的，因此，本發明的範圍不局限於實施例所公開的內容。